农业生物技术学报

作者：蒋成辉, 郭容霞, 李小明, 常艳燕, 王会宝, 刘萍, 王晶, 杨进才, 曾巧英

单位：1 甘肃农业大学 动物医学院 兰州 730030; 2 中农威特生物科技股份有限公司 兰州 730046; 3 中国农业科学院 兰州兽医研究所 兰州 730046; 4 甘肃林业职业技术大学 环境工程学院,天水 741020

关键词：逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(RT-RAA),CRISPR/Cas12a,猪塞内卡病毒A,可视化检测,

基金：兰州市青年科技人才创新工程(2023-QN-77); 甘肃省龙源青年创新创业人才(个人)工程(2023LQGR62); 甘肃省青年科技基金(22JR5RA780); 甘肃省科技重大专项(23ZDKA0002)

猪(Sus scrofa)塞内卡病毒A (Senecavirus A, SVA)是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员,能够引起猪的水疱病和新生仔猪死亡,威胁着全球养猪业的发展。为了建立一种基于逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)和CRISPR/Cas12a技术检测SVA的可视化方法。本研究根据SVA基因组保守序列,设计3对RT-RAA引物、向导RNA靶向序列(CRISPR RNA, crRNAs)以及单链DNA探针(single-stranded DNA, ssDNA)。通过正交试验优化crRNA与来源于毛螺科细菌Cas12a核酸酶(LbCas12a)的最佳反应浓度。同时,评价RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法的敏感性、特异性和重复性,并对已知背景的110份临床样本进行模拟检测。结果显示,crRNA与LbCas12a的最佳反应浓度为100和200 nmol/L。以RNA标准品(SD-RNA)为模板,RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法灵敏性可达到15.1 copies/μL。所建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法特异性高,不与猪瘟病毒(Clssical swine fever virus, CSFV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)以及口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)发生交叉反应。重复性试验显示,批内变异系数(CV)小于5%,批间CV小于10%,表明该方法具有良好的重复性。临床样本检测与qPCR检测结果相当,符合率为100%。综上所述,本研究成功建立了一种特异性强、灵敏性高、重复性好的可视化RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法,可用于SVA的早期有效监测和流行病学调查。

来源：2025年第11期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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