农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2022年第5期

• 茶树12个酚类物质合成途径关键酶SSR分子标记的开发及应用

  彭靖茹, 檀业维, 温立香, 张芬, 黄寿辉, 陈家献, 袁冬寅, 赵媛

  茶多酚是茶树(Camelliasinensis)的主要次级代谢产物,与茶树的新陈代谢、生长发育及品质非常密切。茶树酚类物质的合成涉及多种酶。目前针对茶树酚类合成途径特定酶开发的 SSR 分子标记引物及应用还较少。本研究基于茶树全基因组序列,以茶树酚类物质合成途径12个关键酶的基因及其侧翼序列开发获得了 158 对 SSR 分子标记引物,其中类黄酮 3'-羟化酶开发获得的 SSR 引物最多,有 29 对,肉 桂酸羟化酶最少,只有1对。所开发的158对SSR引物,位于基因间隔区的最多,依次是内含子区、上游区及外显子区,位于5′端上游非编码区的最少。这些引物总计有122个重复单元,其中二核苷酸最多,之后依次为三核苷酸、四核苷酸及五核苷酸,最少的是六核苷酸。从158对SSR引物中挑选68对进行了引物多态性筛选,将获得的13对多态性好的引物开展72份茶树种质资源遗传多样性的研究,共获得105种带型,同一样品的重复样可聚在一起,表明所筛选的引物能很好地区分种质资源,具有较好的准确性。72份茶树种质资源的遗传相似系数为0.8120~0.9849。本研究为茶树基于主要内含物酚类物质开展核心种质构建、新品种选育及品种鉴定等提供依据,同时也可为针对特定基因开发SSR分子标记提供参考方法。

• 水稻OsCLF基因的功能分析及其对铝毒胁迫的响应

  李超, 肖恩宗, 白庆, 徐枫, 冀曦悦, 李春娥, 王玉琪

  组蛋白甲基化修饰在真核生物基因表达调控中发挥着重要的作用。调控拟南芥(Arabidopsis thaliana)卷叶的蛋白(curly leaf protein, CLF)是重要的组蛋白甲基转移酶,参与多种细胞发育过程。本研 究对水稻(Oryza sativa) OsCLF 基因的功能进行了初步研究。通过双酶切克隆,构建了 OsCLF 基因过量表 达载体 pCAMBIA1300-35S-OsCLF,进而转化拟南芥 clf突变体。表型及生化功能分析表明水稻OsCLF蛋白具有类似拟南芥CLF蛋白的H3K27三甲基转移酶的功能,且能功能互补使拟南芥clf突变体的表型为野生型。qPCR检测发现,水稻OsCLF基因的表达在长日照条件下较高,且铝毒胁迫能显著诱导其表达;随后将RNA干涉载体pYLRNA-OsCLF-RNAi转入水稻,长日照条件下的表型分析表明,OsCLF基因RNA水稻株系的株高、旗叶长宽度、花粉活力及结实率均显著低于野生型水稻(P<0.01),而分蘖数和叶绿素含量则显著高于野生型水稻(P<0.01);下调OsCLF基因表达的RNAi水稻株系对铝毒胁迫的抗性得到提高,说明OsCLF负调控水稻耐铝基因的表达。本研究初步揭示了OsCLF基因参与的水稻生长发育的生物学过程,为进一步探明这些过程的表观遗传机理提供参考依据。

• 甘蓝型油菜FAF基因家族鉴定并挖掘分枝形成相关成员

  蒋先润, 罗桂林, 梁峰豪, 黄莎, 肖华贵, 张超, 代文东

  FAF基因家族是植物界特有的转录因子之一,具有调节分生组织大小的作用。为研究甘蓝型油 菜(Brassica napus)中 FAF 基因对分枝形成的影响,本研究对甘蓝型油菜 FAF 家族成员进行了全基因组鉴定和生物信息学分析;以 3 个多分枝材料和 3 个少分枝材料为研究对象,提取不同生育期组织部位的总RNA,利用 qPCR 对 BnFAF 基因进行了表达模式分析。结果显示,甘蓝型油菜中共有 17 个 BnFAF 基因,分布在 13 条染色体上;基于氨基酸序列的相似度,参考拟南芥(Arabidopsis) FAF 基因将 BnFAF 基因分为Ⅰ~Ⅳ共4个亚家族;基因结构、蛋白结构鉴定表明Ⅳ家族成员的分化较大,而其余亚家族内成员相对保守。qPCR分析发现,BnFAF4-4 和 BnFAF4-7 的表达模式一致,且在多分枝材料薹期茎、上部腋芽和中部腋芽中的相对表达量显著高于少分枝材料,推测这些基因可能影响分枝的形成。本研究为进一步利用FAF 基因改良甘蓝型油菜分枝性状提供了理论指导。

• 绿豆GRAS基因家族鉴定及其非生物胁迫下的表达模式分析

  张文慧, 何光鑫, 王子鑫, 周鹏, 徐红岩, 张琦, 杜吉到

  GRAS (gibberellic acid insensitive (GAI), repressor of GAI (RGA), and scarecrow (SCR))基因家族 广泛存在于植物中,对于植物响应逆境胁迫及生长、发育等方面起重要作用。绿豆(Vigna radiata)是我国 传统的经济作物,抗逆性强,是盐碱土壤改良的优良作物之一。本研究鉴定出 58 个绿豆 GRAS 基因,并 对这些基因进行生物信息学分析及非生物胁迫下的表达模式分析。结果表明,GRAS基因不均匀的分布在绿豆的 1~11 号染色体上 ;系统进化分析将 GRAS 基因分为 8 个亚家族(PAT1, DELLA, SCL3, LISCL, LS, SCR, SHR 和 HAM),同一亚家族的 VrGRAS 蛋白有相似的蛋白基序;基因结构分析发现绿豆 GRAS 内含子较少,在不同物种中具有较高的保守性;启动子区域含有脱落酸、乙烯、茉莉酸甲酯等激素响应元 件以及胁迫响应元件;qPCR 结果显示,绿豆 GRAS 基因在叶片中能够不同程度的响应盐、干旱、碱和低温 等非生物胁迫,且表达具有组织特异性。PAT1亚家族基因对绿豆响应逆境胁迫起重要的调控作用。本研究结果可为绿豆GRAS家族基因的抗逆功能分析提供参考。

• 基于转录组测序分离姜荷花类胡萝卜素合成关键基因

  刘建新, 毛俐慧, 许骅, 陈海燕, 蔡淑钰, 吴丽元, 沈瑜

  姜荷花(Curcuma alismatifolia)是国内新兴的一种热带球根花卉,然而已知的关于该物种的遗传和基因信息非常有限,尤其是苞片颜色基因方面的研究处于空白,这阻碍了姜荷花花色方面的分子育种。为获得姜荷花类胡萝卜素生物合成途径关键基因,本研究基于PacBio平台的第3代测序技术对姜荷花'清迈粉'进行全长转录组测序,经重测序分离以及实时定量PCR(real-timequantitative PCR, qPCR)法验证了 类胡萝卜素生物合成途径的关键基因。实验总计获得了插入片段数(number of reads of insert) 494 242 条及高质量全长转录本序列(HQFLpolished consensus) 64471条。利用公共数据库：非冗余蛋白数据库(non-redundant protein database, Nr)、蛋白质真核同源数据库(eukaryotic orthologous groups, KOG)、蛋白质序 列 数 据 库 (Swissprot protein database, SwissProt)、蛋 白 相 邻 类 的 聚 簇 (cluster of orthologous groups, COG)、基因本体论(gene ontology, GO)和 KEGG 等对获得的序列进行了功能注释和分类。根据注释结果经重测序获得了11条类胡萝卜素合成途径关键基因全长cDNA序列,分别为β-胡萝卜素羟化酶1(beta-carotene 3-hydroxylase 1, CHYB1)、ζ-胡萝卜素脱氢酶 1 (zeta-carotenedesaturase 1, ZDS1)、玉米黄质环氧化酶 1 (zeaxanthin epoxidase 1, ZEP1)、八氢番茄红素合成酶 1 (phytoene synthase 1, PSY1)、八氢番茄红素脱氢酶 1 (phytoene desaturase 1, PDS1)、番茄红素异构酶 1 (prolycopene isomerase 1, CRTLSO1)、番茄红素 β- 环化酶 1 (lycopene beta-cyclase 1, LCY-B1)、番茄红素 ε 环化酶 1 (lycopene epsilon cyclase 1, LCYE1)、牻牛 儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 1 (geranyl geranyl pyrophosphate synthase1, GPPS1)、类胡萝卜素裂解双加氧酶 1 (carotenoid cleavage dioxygenase 1, CCDs1)和 9, 10'类胡萝卜素裂解双加氧酶 1 (carotenoid 9,10 (9', 10')- cleavage dioxygenase 1)。最后从中筛选出 3 个基因：LCY-B1、ZEP1、PSY1 进行了组织表达功能验证。这些基因的获得有利于后期采用分子调控手段对姜荷花的苞片颜色进行改良育种,为培育具有新苞片颜色 的姜荷花品种提供分子基础。

• 基于转录组的蔗茅CML基因家族鉴定及冷胁迫表达分析

  钱禛锋, 谷杰, 赵雪婷, 饶席兵, 曾丹, 沈庆庆, 张蓉琼, 陈疏影, 何丽莲, 李富生

  类钙调蛋白(calmodulin-like protein, CML)是植物细胞中的钙离子结合蛋白,在植物生长发育和 逆境胁迫的信号转导中具有重要的功能。为探究冷胁迫下蔗茅(Erianthus fulvus) CML 家族基因的表达模 式,本研究基于转录组数据在蔗茅中鉴定出 39 个 EfCML 家族基因,并进行了生物信息学和冷胁迫下的表 达分析。蛋白质理化性质分析表明 ,蔗茅 EfCMLs 氨基酸残基数目为 59~312,分子量大小为 6.240 21~34.017 78 kD,等电点为 3.99~11.14。亚细胞定位预测结果显示,39 个 EfCMLs 分别定位于细胞质、细胞膜 和细胞核中。保守结构域分析发现,EfCML 家族蛋白含有 1~4 个典型的 EF-hand 结构域。基序(motif)分 析表明,EfCML 家族蛋白含有 1~4 个典型的 Ca2+结合基序。进化树分析表明,EfCMLs 蛋白分为 11 个组群。冷胁迫表达分析表明,低温诱导 EfCML 家族基因差异表达,其中 EfCML1 和 EfCML2 基因表达持续上调,在 72 h 冷胁迫下达到峰值,分别为对照的 27 和 35 倍(P<0.01),呈现最活跃状态。本研究为深入解析 蔗茅 CML 基因的冷胁迫调控机理提供基础资料。

• 关岭牛IGF1基因干扰载体构建及其对成肌细胞的影响

  宋林锦, 许厚强, 李永, 孙金魁

  胰岛素样生长因子 1 (insulin like growth factor 1, IGF1)是通过调控骨骼肌蛋白的合成影响肌肉 发育的单链多肽类激素,对细胞增殖等多种生理功能具有重要作用,本研究旨在探究IGF1基因对关岭牛 (Bos taurus)成肌细胞的影响。选用健康的成年(2~3 岁)关岭牛 3 头,采集心、肝、脾、肺、肾、前腿肌、后腿 肌、背最长肌、斜方肌、臀肌、胃、小肠12个组织样提取RNA,采集背最长肌组织成功培养关岭牛成肌细胞。运用 qPCR 技术检测 IGF1 基因在不同组织中的相对表达量;运用在线软件对关岭牛 IGF1 蛋白质理化性质、二级结构和三级结构、亚细胞定位进行分析 ;同时通过在线软件设计 IGF1 基因的 3 对短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)干扰序列和 1 对阴性对照序列,与 pGPU6-GFP-Neo 载体连接后进行测 序,将构建成功的 IGF1基因干扰载体转染至成肌细胞;运用qPCR技术检测并筛选出干扰效率最高的干 扰载体,分析该干扰载体对 IGF1 基因表达的影响;运用 qPCR 技术检测干扰 IGF1 基因对细胞增殖相关基 因细胞周期蛋白 D1 (cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖性激酶 2 (cyclin-dependent kinases 2, CDK2)的相对表达量影响;运用 CCK8 (Cell Counting Kit-8)法检测成肌细胞增殖情况。结果表明,IGF1 基因在关岭牛心、前腿肌、后腿肌、背最长肌、斜方肌、臀肌等12个组织样中均有表达,在肝中相对表达量最高,极显著高于 其他组织(P<0.01);在培养关岭牛成肌细胞的基础上 ,成功构建关岭牛IGF1基因干扰载体 ,并筛选出 shRNA-IGF1-1 干 扰 效 率 最 高 (P<0.01);IGF1 蛋 白 的 分 子 式 为 C744H1186N214O216S15,相 对 分 子 质 量 为 17.06581 kD,理论等电点为 9.36,属碱性不稳定蛋白;IGF1 基因被抑制后,细胞增殖相关基因 cyclin D1 和 CDK2 的表达量均极显著低于 shRNA-NC (P<0.01)。CCK8 法检测细胞增殖结果表明,IGF1 基因被抑制后,在 24 和 72 h 成肌细胞增殖均显著低于对照组(P<0.05),48 h 为极显著水平(P<0.01),表明体外沉默 IGF1 基因后,会影响成肌细胞增殖能力和抑制成肌细胞增殖相关基因表达。本研究为进一步研究 IGF1 基因对关岭牛肌肉生长发育的作用及调控机制提供了基础数据。

• LncRNA TCONS_00153149基因在酉州乌羊皮肤黑色素沉积过程中的作用

  张丽, 李杰, 付琳, 刘丽, 杨恒, 王高富, 任航行, 周鹏, 董贤文

  长链非编码 RNA (long noncoding RNA, LncRNA)是一类长度大于 200 个核苷酸且不能编码蛋 白质的 RNA，可通过多种调控途径作用于皮肤恶性黑色素瘤的增殖、侵袭和转移等。为探究酉州乌羊 (Capra hircus) LncRNA TCONS_00153149 基因在黑色素沉积过程的调控作用及分子机制，本研究以酉州乌羊和渝东白山羊为对象，验证 LncRNA TCONS_00153149在不同肤色山羊组织的表达特性，同时分析其在小鼠(Mus musculus) B16-F10 黑色素细胞分化阶段的表达特征，通过构建 LncRNA TCONS_00153149 的慢 病毒表达载体，转染 B16-F10 黑色素细胞，探究 LncRNA TCONS_00153149 对黑色素沉积的调控作用。结 果显示 LncRNA TCONS_00153149 在酉州乌羊和渝东白山羊不同组织中均有不同程度的表达，且酉州乌 羊皮肤组织中的相对表达量极显著高于渝东白山羊(P＜0.01)；LncRNA TCONS_00153149的表达在黑色素细胞分化前期呈上升趋势，分化第3天相对表达量达到最高，其后呈递减趋势，在分化第7 天达到最低，其在第 3 天的相对表达量极显著高于分化第 0、1 和 7 天(P＜0.01)；转染 B16-F10 细胞发现，与转空载体组 (negative control group, NC)相比，转染 LncRNA TCONS_00153149 基因的黑色素细胞中，LncRNA TCONS_ 00153149 基因相对表达量极显著提高(P＜0.01)，黑色素含量显著升高，这些结果验证了 LncRNA TCONS_00153149 基 因 对 黑 色 素 沉 积 的 显 著 促 进 作 用 。 同 时 ，黑 色 素 沉 积 相 关 基 因 酪 氨 酸 酶 相 关 蛋 白 1 (TYRosinase related protein 1, TYRP1)、小眼畸形转录因子(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)、酪氨酸酶相关蛋白 2 基因(TYRosinase-related protein 2, TYRP2)相对表达量显著升高(P＜0.05)， Agouti 信号蛋白(agouti signaling protein, ASIP)相对表达量极显著降低(P＜0.01)。结合 Inta RNA2.0.0 软 件分析 LncRNA TCONS_00153149 与色素关键基因的互作结果，本研究推测 LncRNA TCONS_00153149 基 因可能是通过靶向增强黑色素候选基因(TYRP1, TYRP2, MITF, ASIP 基因等)的功能，正向调控黑色素的沉积。本研究为明确山羊皮肤着色相关的LncRNA调控理论的研究提供了基础资料。

• 干扰CIDEa基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成的影响

  李君, 孙雨婷, 郭震楠, 韩浩园, 赵金艳, 徐秋良, 牛晖, 权凯

  诱导细胞凋亡 DFF45 样效应子 a (cell death inducing DNA fragmentation factor 45 like effector a, CIDEa)是一类和脂类代谢紧密相关的蛋白,参与调控脂解、脂滴的生长融合和极低密度脂蛋白的成熟。 为研究 CIDEa 基因在奶山羊(Capra hircus)乳腺上皮细胞中的生物学功能 ,本研究利用 qPCR 技术检测CIDEa 在奶山羊泌乳期和干奶期乳腺组织的表达差异;采用 siRNA 介导的干扰技术研究 CIDEa 基因对脂 质合成和相关基因表达的影响。结果发现,CIDEa 基因在泌乳期乳腺组织的表达量显著高于干奶期(P< 0.05)。利用 siRNA 介导的干扰技术,在奶山羊乳腺上皮细胞中转染 siRNA,CIDEa 基因 mRNA 水平下调60%~88% (P<0.01);干扰 CIDEa,抑制了细胞中脂滴积累 ,显著降低细胞中甘油三酯含量(P<0.05);CIDEa 干扰后,显著上调脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FASN)和激素敏感脂酶(hormone-sensitive lipase, HSL)基因的表达(P<0.05),同时促进固醇调节元件结合蛋白 1 (sterol regulatory element binding proteins 1, SREBP1)基因的表达(P<0.05),并且抑制脂肪酸结合蛋白 3 (fatty acid-binding protein 3, FABP3)和二酰 基 甘 油 酰 基 转 移 酶 1(diacylglycerol acyltransferase 1, DGAT1) 基 因 的 表 达 (P<0.05)。研 究 结 果表 明 , CIDEa 基因在奶山羊乳腺上皮细胞中促进脂滴合成,本研究为进一步研究CIDEa调控奶山羊乳脂合成的作用机制提供理论依据。

• 藏羊MSTN基因表达及其与产肉性状的关联性分析

  张军霞, 雷秀存, 贺娜, 崔亚杰, 吕彩玲, 李明明, 郎侠, 王彩莲

  肌肉生长抑制素(myostain, MSTN)作为肌肉生长抑制因子,属于 TGF-β 超家族成员,MSTN 突变 会引起肌肉过度增长,出现“双肌”表型,该基因对于提高动物肌肉产量及瘦肉率有重要意义。为了分析 藏羊(Ovis aries) MSTN 基因与产肉性状的关联性,本研究随机选取体重相近、健康无病的 6 只 6 月龄藏羊, 屠宰后测定了藏羊的屠宰性能、肉品质和肉质营养成分;利用荧光定量 PCR 检测藏羊 MSTN 基因在臂三 头肌、股四头肌、背最长肌和半腱肌中 mRNA 的表达量,并对 MSTN 基因表达量与产肉性状进行关联性分 析。结果表明 ：藏羊所有屠宰性能指标在公羊与母羊之间无显著差异 ,公羊和母羊的屠宰率分别为51.32% 和 52.01%,胴体重分别为 22.08 和 20.03 kg。肉品质分析结果表明,除了剪切力在公、母羊之间有 显著差异(P<0.05)外,其余指标在公、母羊间差异均不显著。肉质营养成分分析结果中,各指标在公、母 羊间差异不显著。其中公羊与母羊的蛋白质含量分别为 23.14% 和 22.17%,粗脂肪含量分别为 2.46% 和 2.87%。MSTN 基因在藏羊 4 种肌肉中均有表达,在各组织间表达未达显著差异水平。对 MSTN 基因的表达 量与屠宰性能和肉品质中各指标的相关性分析结果显示,藏羊 MSTN 基因在臂三头肌中的表达量与宰前活 重呈显著正相关(P<0.05, 1.000);在背最长肌中的表达量与红度值呈显著正相关(P<0.05, 0.831),与熟肉率呈极显著负相关(P<0.01, -0.958);股四头肌中的表达量与熟肉率呈极显著负相关(P<0.01, -1.000);半腱肌中的表达量与各指标相关性均不显著。可见,MSTN基因与藏羊产肉性状存在相关性,本研究可为 MSTN 基因对藏羊肉品质调控机理的研究提供理论依据。

• 两个山羊品种MHC基因外显子3的遗传变异分析及与生长性能的相关性

  孙旺斌, 王伟萍, 黄艳, 宋晓越, 张迪, 尚佳乐, 长孙伟光, 李增辉

  陕北白绒山羊(Capra hircus)和子午岭黑山羊是陕北地区山羊的主要品种,但其生长性能均有待 提 升 ,特 别 是 后 者 的 存 栏 量 骤 减 ,急 需 明 确 其 群 体 遗 传 变 异 情 况 。 主 要 组 织 相 容 性 复 合 体 (major histocompatibility complex, MHC)基因的遗传变异可评估种群遗传多样性水平,且与家畜体尺性状有关。 为探究陕北白绒山羊和子午岭黑山羊的 MHC 基因外显子 3 的多态性,评估子午岭黑山羊种群发展趋势, 并明晰陕北白绒山羊MHC基因与生长性能和产绒性状的相关性,本研究利用扩增子高通量测序方法,对600 只陕北白绒山羊和 30 只子午岭黑山羊的 MHC 基因外显子 3 进行遗传变异分析及与生长性能的相关性研究。结果共获得 2 种 MHC 基因的外显子 3 序列,包括 4 条 DQA1 等位基因序列和 22 条 DQB2 等位基 因序列;子午岭黑山羊的杂合度和多态性均较低,种群发展趋势不乐观,需采取有效的保护措施;而陕北 白绒山羊多态性较高,且 DQA1 基因的 BB 基因型在十字部高和毛长指标方面都显著高于其他 2 种基因型 (P=0.035, P=0.021)、AA 基因型对应的绒细度最细(P=0.003),可分别作为生长性能改良和细绒型绒山羊 选育的有效分子标记。本研究有助于促进陕北白绒山羊分子标记辅助选择育种和子午岭黑山羊种质资 源的保护与开发利用。

• 与鸡斑点型锌指结构蛋白互作的细胞蛋白筛选及其功能分析

  王燕碧, 赵采芹, 唐宏, 周磊, 韩一帆, 邢静如, 石海英, 段志强

  斑点型锌指结构蛋白(speckle-type POZ (pox virus and zinc finger protein) protein, SPOP)是 E3 泛 素连接酶 Cullin 3 家族中的一员,通过与底物蛋白的互作促进底物的泛素化和降解,从而影响底物蛋白的 生物学功能。本研究构建了鸡(Gallus gallus) SPOP 基因的重组真核表达载体 pCMV-HA-SPOP,并将其和 空 载 体 pCMV-HA 分 别 转 染 鸡 胚 成 纤 维 细 胞 系 (DF-1),提 取 细 胞 总 蛋 白 ,利 用 免 疫 共 沉 淀 (co-immunoprecipitation, Co-IP)联合质谱分析技术筛选和鉴定与鸡 SPOP 蛋白互作的细胞蛋白,并对其进行 基因本体(Gene Ontology, GO)功能注释、KEGG 信号通路和蛋白互作网络分析。进一步利用荧光共定位 和 Co-IP 实验 ,对鸡 SPOP 蛋白和筛选的细胞蛋白 26S 蛋白酶体非 ATP 酶调节亚基 11 (26S proteasome non ATPase regulatory subunit 11, PSMD11)进行相互作用验证。结果显示,重组蛋白 HA-SPOP 在细胞内 得到正确表达 ,并且主要定位在细胞核和细胞质。利用 Co-IP 联合质谱分析技术共筛选到 158 个与鸡 SPOP 蛋白相互作用的细胞蛋白,主要分布在细胞核、细胞骨架和细胞质,参与了酶活性、核酸结合和蛋白 质加工等生物学过程及代谢、核糖体组成和生物调节等信号通路。蛋白互作网络图分析发现,与鸡 SPOP 蛋白互作的细胞蛋白之间存在复杂的相互作用网络,其中蛋白酶体激活物复合物亚单位 3 (proteasome activator complex subunit 3, PSME3)、PSMD11 和 H2A 组蛋白家族成员 Z (H2A histone family, member Z, H2AFZ) 3 个蛋白可能与鸡 SPOP 蛋白具有直接的相互作用。荧光共定位和 Co-IP 实验结果表明,鸡 SPOP 蛋白与 PSMD11 蛋白存在相互作用,并且可以改变 PMSD11 蛋白的细胞内定位。本研究为进一步探究鸡 SPOP 蛋白在细胞内的生物学功能提供参考。

• 鸭IFNα-AvBD2融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及生物学活性检测

  豆子航, 李秀丽, 庞洪泽, 韩颖, 雷白时, 赵款, 庞敬红, 袁万哲

  鸭(Anas platyrhynchos) α 干扰素(interferon α, IFNα)具有广谱的抗病毒活性,禽 β 防御素 2 (avian β -defensin 2, AvBD2) 具 有 广 谱 的 抗 菌 活 性 。 本 研 究 利 用 毕 赤 酵 母 (Pichia pastoris) 分 泌 表 达 鸭 IFNα - AvBD2 融合蛋白并明确 IFNα-AvBD2 的生物学活性,对于现有无抗养殖条件下的鸭疫病防控具有重要意 义 。 本 课 题 组 在 前 期 工 作 中 已 成 功 构 建 了 原 核 表 达 质 粒 pET32a-AplIFNα -AvBD2,并 在 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli)中成功表达。本研究以实验室保存的 pET32a-AplIFNα-AvBD2 为模板,通过 PCR 方法扩增得到 AplIFNα-AvBD2 成熟蛋白的基因片段,构建重组质粒 pPICZαA-AplIFNα-AvBD2;将线性化的重组 质粒电转化至毕赤酵母 KM71H 感受态细胞,阳性重组菌经甲醇诱导表达,对表达产物进行体外生物学活 性研究。SDS-PAGE 和 Western blot 结果显示,AplIFNα-AvBD2 重组蛋白分子量约为 24 kD;琼脂扩散法和微量稀释法表明重组蛋白对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌有较强的抗菌活性;细 胞病变抑制法检测重组蛋白抗病毒活性为 1.2×105 U/mL,比活性为 5.2×105 U/mg;MTT 细胞毒性试验显 示重组蛋白对非洲绿猴肾细胞(Vero)无毒。上述结果说明,AplIFNα-AvBD2 可在毕赤酵母中分泌表达, 同时具有抗菌活性和抗病毒活性。本研究为 AplIFNα-AvBD2 的进一步应用提供了基础资料。

• 不同密度稻-鲤-罗非鱼综合种养系统的鱼类生理生化及稻田环境特征

  衣萌萌, 莫洁琳, 莫航, 王淼, 翟婉婷, 王贺, 刘志刚, 高风英, 曹建萌, 可小丽, 卢迈新

  稻渔综合种养是一种具有良好经济效益和生态效益的生产模式,但是在养殖产量方面需要技术 改进与革新。本研究在稻渔综合种养“三江模式”的基础上,混养金边鲤(Cyprinus carpio var. Jinbian)和吉 富罗非鱼(Oreochromis niloticus, GIFT strain),并且提高养殖密度,探讨提高养殖密度和增加养殖品种对三 江地区稻渔综合种养经济和生态效益的影响。经过为期 145 d 的实验发现,高密度混养组(IDh)鲤鱼的增 重率和特定生长率显著高于低密度混养组(IDl)和鲤鱼单养组(SD),分别达到了 415.3% 和 1.2;IDh 组罗非 鱼的增重率显著高于 IDl 组,达到 4918.0% (P<0.05)。养殖密度和混合养殖对养殖鱼类的消化道淀粉酶 和脂肪酶活性,以及肝脏过氧化氢酶活性产生了影响,具体表现在：IDl 组鲤鱼消化道淀粉酶活性显著高 于 IDh 组和 SD 组,IDh 组鲤鱼消化道脂肪酶活性显著高于其他两组(P<0.05);而 IDh 组鲤鱼肝脏过氧化酶 活显著低于 IDl 组和 SD 组(P<0.05);IDh 组罗非鱼消化道淀粉酶和脂肪酶活性显著高于 IDl 组 (P<0.05)。 鱼类混养和不同的养殖密度同样影响了稻田及鱼坑的水质环境。稻田中 SD 组氨氮(ammonia-nitrogen, NH4-N),IDl 组 硝 酸 盐 (nitrate-nitrogen, NO3-N) 和 亚 硝 酸 盐 (nitrite-nitrogen, NO2-N),IDh 组 总 氮 (total nitrogen, TN),总磷(total phosphorus, TP),化学需氧量(chemical oxygen demand, CODCr)和有机质(organic matter, OM)降低幅度最大;在鱼坑中,SD 组 NH4-N,NO3-N 和 NO2-N,IDh 组 TN,CODCr 和 OM,IDl 组 TP 降 低幅度最大。综上所述,本研究在稻渔综合种养中采用的养殖密度或者混养罗非鱼并未对养殖产量、稻 田和鱼坑水质造成负面影响,而是在一定程度加快了营养物质循环,提高了养殖效益。可以在本研究基 础上进一步提高稻渔综合种养的鱼类养殖密度,以期提高生产效益。

• 一株耐低温纤维素降解菌的发酵条件优化和秸秆降解研究

  董雪丽, 季静, 张松皓, 王罡, 王昱蓉

  我国北方地区是主要的农作物种植产区,但由于气候寒冷干燥、土壤沙质化,农业残留秸秆分解 缓慢甚至不能被完全降解,使其既不能作为当季肥源施用,又造成了秸秆与后茬作物争氮、影响作物生长 的现象。为了解决寒冷地区的秸秆降解问题,本研究采用刚果红染色和低温筛选的方法从腐化秸秆中分 离出了 1 株耐低温纤维素降解菌株 JiTF01,并通过 18S rDNA 序列分析对该菌株进行了分子生物学鉴定; 采用单因素实验和响应面分析法优化了此菌株低温下的发酵产酶条件和所产纤维素酶的特性;另外,通 过对低温发酵过程中秸秆降解率和纤维素酶活性的测定,考察了目标菌株在低温下对秸秆的生物降解性能。结果表明：分离所得菌株 JiTF01 为青霉属(Penicillium sp., GenBank No. MZ285877),其可在 10 ℃下 降解纤维素。该菌株在低温下的最优产酶条件为 pH 6.67、接种量 2.89% 和培养时间 12.13 d。同时发现, 菌株 JiTF01 具有良好的耐酸特性,酸性条件下可产生较高的纤维素酶活性,且所产纤维素酶的酶促反应 活性和稳定性在 pH 2 时仍能分别保留 41.93% 和 94.35%。此外,菌株 JiTF01 在 10 ℃下与水稻秸秆发酵 21 d 后,秸秆的降解率可达 45.24%。本研究结果对纤维素酶的生产应用以及寒冷地区秸秆资源的处置具 有重要意义。

• sRNA rli82 分子特征及其对单核细胞增生李斯特菌环境应激和生物被膜形成的调控作用

  季春辉, 郭蕴, 王立霞, 宁程程, 李娜, 乔军, 孟庆玲, 才学鹏

  单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)是一种对外界环境具有广泛适应性的人兽共 患革兰氏阳性菌。为了解 sRNA rli82 对 LM 环境应激及生物被膜(biofilm, BF)的调控作用。本研究以 LM EGD-e 基因组为模板,扩增 sRNA rli82,并利用生物信息学分析 rli82 的分子特征和可能调控的潜在靶 基因;通过同源重组技术构建 rli82 基因缺失株 LM-Δrli82 及回补株 LM-Δrli82/rli82,比较其在不同胁迫环境下的生长情况及 BF 形成能力的差异,并通过 qPCR 检测与环境应激和 BF 形成相关基因的转录水平。 结果显示,rli82 基因全长 70 bp,二级结构拥有 2 个大的茎环结构,其调控的潜在靶基因为肉碱转运结合 蛋白(carnitine transport binding protein, opuCC)。LM-Δrli82 与 LM EGD-e 和 LM-Δrli82/rli82 相比,在不同 渗透压(4% 和 8% NaCl)处理下,LM-Δrli82 环境适应能力显著增强,而在 3.8% 乙醇、pH4、pH9 以及 30 ℃ 的应激处理下环境适应能力显著降低。3 株菌的 BF 形成能力无明显差异。qPCR 显示与环境应激有关基 因相对表达量显著降低,表明 rli82 对 LM 的环境应激适应能力发挥了重要的调控作用,本研究为进一步揭示 sRNA rli82 调控 LM 环境应激能力的分子机制提供了参考。

• 遗传修饰技术在甘蔗优质品种选育中的研究进展

  董刚刚, 王颖, 韩成贵

  甘蔗(Saccharum officinarum )作为一种全球重要的糖料和工业原料作物,目前已在 100 多个国家 成功实现商业化种植,甘蔗产业的高质量可持续发展,对于全球食糖有效供应和绿色能源经济的可持续 发展具有重要战略意义。近年来,依托传统杂交育种技术的甘蔗产业遭遇发展瓶颈。随着现代生物学技 术的迅速发展,遗传修饰技术在许多领域崭露头角。遗传修饰技术,即通过基因工程,特异性改造或改良 靶标基因,从而实现对功能性状的改变。甘蔗作为转基因生物安全等级最高的作物之一,以功能基因组 学为基础的报告基因和筛选标记基因推动了甘蔗在抗病、抗虫、抗(耐)除草剂和抗寒、抗旱等方面的优质 品种选育。此外,转基因技术也在提高甘蔗蔗糖含量、改良蔗糖品质及基于生物反应器的能源甘蔗等品 质改良方面成果丰硕;以基因组组装、基因组学辅助育种(genomics-assisted breeding, GAB)、多等位基因 诱变和功能缺失表型创建等为代表的基因编辑技术在甘蔗功能基因组研究和新材料创制方面表现优异。 本文全面综述了遗传修饰技术在上述多个甘蔗领域的研究进展,重点关注兼具多个优良性状的多价融合 转基因甘蔗研发和商业化,以期为我国甘蔗优质品种选育和品质改良提供参考,推动我国甘蔗产业高质 量可持续发展。

• 基于微滴式数字PCR定量检测转基因玉米'CC-2'外源基因和内参基因在土壤中的存留

  董姗姗, 肖泽华, 章嫡妮, 刘燕

  监测转基因作物外源基因在土壤中的持留水平及其动态变化,是评估转基因作物对土壤生态系 统潜在风险的重要内容。本研究以耐除草剂转基因玉米(Zea mays) 'CC-2'和非转基因对照玉米'郑 58'为 实验材料,采用微滴式数字 PCR (droplet digital PCR, ddPCR)技术,定量检测不同生长时期玉米根系土壤 中 耐 除 草 剂 基 因 CP4-EPSPS (Agrobacterium tumefaciens strain CP4 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase)和玉米内参基因 zSSIIb (Zea mays starch synthase isoform zSTSII-2)的拷贝数。结果显示,ddPCR 对 CP4-EPSPS 和 zSSIIb 基因的定量限(limit of quantitation,LOQ)分别为(0.48±0.07)和(0.22±0.04) copies/µL;转基因玉米'CC-2'各生育期根系土壤中 CP4-EPSPS 的拷贝数均低于定量限,随着生长时期的推移,其 阳性检出率呈下降趋势;'CC-2'根系土壤中 CP4-EPSPS 与 zSSIIb 基因拷贝数无显著差异;在玉米不同生育 期,'CC-2'与'郑 58'根系土壤中 zSSIIb 基因的阳性检出率和拷贝数的变化趋势相似,但是在拔节期'郑 58'根 系土壤中 zSSIIb 拷贝数显著高于'CC-2' (P<0.05)。实验结果表明转基因玉米中的外源基因可以通过根系分泌物进入土壤环境,但浓度很低,且随生育期推移呈迅速下降趋势,说明 ddPCR 技术能够灵敏、精准地 对土壤中存留的植物 DNA 进行定量分析。本研究为转基因作物外源基因在土壤中的定量检测提供新的方法和借鉴。

• 基于CRISPR/Cas9系统的多基因敲除载体的构建及其敲除效率检测

  徐磊, 赵育蓉, 胡悦旻, 王昊, 彭玥晗, 鞠辉明

  CRISPR/Cas9 系统是近年来快速发展的一种简单高效的基因编辑系统。在哺乳动物中，同时靶 向敲除多基因的研究仍然较为匮乏。为优化哺乳动物中靶向多基因的敲除系统的构建，本研究在已有的 CRISPR/Cas9 载 体 的 基 础 上 进 行 升 级 改 造 ，将 4 个 U6 启 动 子 介 导 的 小 向 导 RNA (small guide RNA, sgRNA)表达框串联至一个载体中的形式制备了多基因位点编辑载体，分别选取家猪(Susscrofa)的去乙酰化 酶 3 基 因 (sirtuin 3, Sirt3) 和 围 脂 滴 蛋 白 1 基 因 (perilipin 1, Plin1) 的 2 个 sgRNA，构 建 了 2 个 猪 Sirt3 sgRNA 的基因编辑载体(S2)、2 个猪 Plin1 sgRNA 基因编辑载体(P2)和同时包括上述 4 个 sgRNA 的基因编 辑载体(S2P2)，上述载体分别转染猪肾细胞 PK15，以转染未装载靶点质粒的细胞为对照组(CON 组)，在各实验组细胞目的基因的 DNA 水平、RNA 水平和蛋白水平检测目的基因敲除效率。结果表明，各实验组 细胞目的基因 DNA 中均检测出突变，S2P2 组和 S2 组中 Sirt3 基因突变率分别为 33% 和 26%，S2P2 组和 P2 组中 Plin1 基因突变率分别为 33% 和 24%；对目的基因 RNA 水平与蛋白水平的检测结果表明，与 CON 组 相比，所有实验组的目标基因 mRNA 及蛋白表达量均有所下降，差异极显著(P＜0.01)，其中 S2 组与 S2P2 组间 Sirt3 基因表达量差异不显著；P2 组与 S2P2 组间 Plin1 基因表达量差异不显著。本研究通过改良的 CRISPR/Cas9 载体系统构建了可以同时对猪 Sirt3 基因和 Plin1 基因高效编辑的载体，有助于后续开展多基因功能的研究。