农业生物技术学报

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• 小麦茎秆水溶性碳水化合物含量主效QTL QWSC.caas-7DS精细定位

  付路平, 王广梁, 薛博阳, 朱学元, 孟恒宇, 刘炳亮, 赵仁慧, 杨子博, 张勇, 任妍, 刘金栋, 李韬, 李吉虎

  茎秆贮藏型水溶性碳水化合物(water-soluble carbohydrates, WSC)是小麦(Triticum aestivum)籽粒灌浆的重要碳源,提高茎秆WSC含量是实现小麦高产稳产的重要途径。QWSC.caas-7DS是利用'扬麦16'/'中麦895'加倍单倍体(doubled haploid, DH)群体定位到的1个调控小麦花后10 d茎秆WSC含量(WSC10)的稳定主效QTL,其物理区间长11.7 Mb。对QWSC.caas-7DS进行精细定位、发掘其候选基因并开发分子标记对小麦茎秆WSC遗传改良具有重要意义。为此,本研究选择DH群体中QWSC.caas-7DS位点基因型不同而其余WSC10 QTL基因型相同的家系配制组合XY015/XY102,并逐步构建F2、F2:3、F2:4等多个世代次级分离群体。基于'扬麦16'和'中麦895'基因组重测序数据,针对QWSC.caas-7DS区间开发了20个竞争性等位基因特异性PCR (kompetitive allele-specific PCR, KASP)标记并利用755个次级F2单株构建了QWSC.caas-7DS加密遗传图谱。利用衍生自35个F2交换单株的F2:4纯合家系在3个环境下的WSC10表型数据,将QWSC.caas-7DS精细定位至7DS染色体66.44~69.14 Mb区间。综合分析'扬麦16'和'中麦895'目标QTL区段重测序数据、基因功能注释和表达谱数据,初步确定6个基因为QWSC.caas-7DS的候选基因。根据基因表达谱数据,候选基因Vrn-D3 (ID号: TraesCS7D01G111600)在茎、叶等组织中高表达,其可能通过调控源库间碳平衡来调控茎秆WSC含量和千粒重(thousand-kernel weight, TKW)。对Vrn-D3进行克隆测序发现,亲本间在第3外显子上存在G碱基“插入/缺失”变异,并开发了其功能标记Vrn-D3M。对黄淮麦区157份小麦品种(系)多环境表型数据分析表明,携带'中麦895'型等位变异的品种可有效提高WSC10和TKW。本研究为QWSC.caas-7DS目标基因克隆及功能研究奠定了重要基础,为QWSC.caas-7DS的育种应用提供了高效分子标记。

• 小麦细胞壁蔗糖转化酶基因TaCWINV41的克隆与分子标记开发

  张宇轩, 储雨航, 薛博阳, 孟恒宇, 朱学元, 王广梁, 刘炳亮, 张荣志, 任妍, 刘金栋, 付路平

  籽粒灌浆速率(grain filling rate, GFR)是影响小麦(Triticum aestivum)千粒重(thousand-kernel weight, TKW)和产量的重要因素,细胞壁蔗糖转化酶(cell wall invertase, CWINV)是调控植物碳水化合物代谢及籽粒灌浆的关键酶,发掘小麦CWINV家族基因并开发分子标记对小麦GFR和产量遗传改良具有重要意义。本研究以包含166份黄淮麦区小麦品种(系)的自然群体为材料,在4个环境下测定籽粒最大灌浆速率(GFRmax)和TKW,结合小麦660K和90K SNP芯片基因型数据,通过全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)在4B染色体60.60~62.33 Mb区间检测到1个同时调控GFRmax和TKW的QTL,解释表型变异率分别为7.48%~12.40%和7.53%~9.50%。参考'中国春'小麦基因组,该QTL区间存在1个CWINV家族基因TaCWINV41 (TraesCS4B02G066000)。通过克隆'扬麦16'和'中麦895'的TaCWINV41基因,鉴定到2个分布于其第3外显子上的SNP变异,其中,基因第1 892位碱基处SNP为C/T错义突变。基于该SNP,开发了竞争性等位基因特异性PCR (kompetitive allele-specific PCR, KASP)标记TaCWINV41_KASP,并利用194份小麦品种(系)的GFRmax和TKW表型数据验证了标记的可靠性。t检验结果表明,基因型为TT的材料GFRmax和TKW显著高于基因型为CC的材料(P<0.05, P<0.01或P<0.001),表明TaCWINV41_KASP可有效用于小麦GFR和TKW分子育种。综上,本研究通过GWAS鉴定到1个同时调控小麦GFR和TKW的主效QTL,发掘了该QTL候选基因TaCWINV41的等位变异,并开发了可用于小麦GFR和TKW分子育种的KASP标记,为小麦GFR遗传调控机制解析提供了理论参考,为GFR和产量遗传改良提供了高效分子工具。

• 小麦黑芒性状的遗传分析与基因定位

  李俊梅, 陈甜甜, 万文涛, 王玲, 韦璐阳, 别同德, 赵仁慧, 方正武

  在普通小麦(Triticum aestivum)中,黑芒性状较为罕见,其遗传机制尚不明确。本研究旨在对小麦黑芒性状进行遗传定位,为后续基因克隆及育种利用提供基础。利用'扬16G216' (白芒)/'扬16M6393' (黑芒) F2∶9代重组自交系(recombinant inbred lines, RIL)群体分析发现,白芒与黑芒分离比符合3∶1。进一步利用'扬16C106' (白芒)/'扬20M5623' (黑芒) F2∶5代RIL群体开展混池外显子捕获测序(bulked segregant exome sequencing, BSE-Seq),结果显示,在86 566个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点中,有456个与黑芒性状极显著相关(99%置信水平),其中99.34% (453个)密集分布于1AS染色体末端(65个)和1BL染色体近着丝粒区(388个),表明黑芒性状受这2个位点共同控制。通过加密标记分析,将1AS染色体位点定位于0~8.1 Mb区间,1BL染色体位点定位于360.4~399.5 Mb区间且与抗条锈病基因Yr26紧密连锁。通过打破该连锁并结合抗病基因检测,筛选出3个白芒且聚合了抗条锈病基因Yr26、抗白粉病基因Pm21、抗叶锈病基因LrYang16G216和抗赤霉病基因Fhb1的株系。本研究结果为黑芒基因的图位克隆、多抗性状聚合与分子育种应用提供了理论和材料基础。

• 小麦粉糊化特性的全基因组关联分析及候选基因预测

  郑杰鑫, 李博, 周冰, 冉浩江, 贾瑶, 宫金鹏, 徐菲雪, 徐乐, 徐延浩

  小麦(Triticum aestivum)粉的糊化特性是评价其加工品质的重要指标。挖掘调控小麦粉糊化特性的遗传位点和候选基因,对改良小麦加工品质具有重要意义。本研究以221份小麦材料为研究对象,在3年4个环境条件下,对峰值黏度、低谷黏度、衰减值、最终黏度、回生值、峰值时间和糊化温度7个小麦粉糊化性状进行了表型测定。结合90K SNP芯片基因型数据,采用一般线性模型(general linear model, GLM)、混合线性模型(mixed linear model, MLM)、多位点混合线性模型(multi-locus mixed linear model, MLMM)、固定与随机效应循环概率统一检验模型(fixed and random model circulating probability unification, FarmCPU)和贝叶斯信息与连锁不平衡迭代嵌套关键位点模型(bayesian-information and linkage-disequilibrium iteratively nested keyway, BLINK) 5种模型开展全基因组关联分析(genome-wide association analysis, GWAS)。结果显示,7个性状均表现出丰富的表型变异,其变异系数为0.92%~33.02%,广义遗传力为40.31%~70.36%。在多模型联合GWAS分析中,共鉴定到8个显著且稳定的关联位点,分别分布于2B、5A、6B和7A染色体,单个位点可解释2.09%~9.26%的表型变异。单倍型分析进一步明确了各高置信度关联位点的优势单倍型及其在群体中的分布频率。以高置信度关联位点上下游200 kb范围作为置信区间进行基因筛选,结合基因表达分析,筛选出TraesCS6B03G0474900 (编码甘氨酸裂解系统H家族蛋白)和TraesCS2B03G0671500 (编码40S核糖体蛋白S12) 2个与小麦粉糊化特性相关的候选基因。本研究可为小麦粉品质的遗传解析和分子育种提供参考。

• 小麦淀粉分支酶SBE基因家族鉴定及TaSBE1-7B功能标记开发

  李康春, 马旭光, 郭利建, 田甜, 张献丰, 王巧芸, 杨德龙

  淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)是一类具有双重催化功能的糖基转移酶,主要参与淀粉合成途径中支链淀粉的合成与转化,在小麦(Triticum aestivum)籽粒发育中起关键调控作用。为探究TaSBE家族基因在小麦籽粒发育中的表达特征并挖掘优异单倍型,本研究采用生物信息学方法对TaSBE家族成员进行全基因组鉴定、表达模式分析及功能分子标记开发与验证。结果显示,在小麦基因组共鉴定到15个TaSBE基因,分布在2A、2B、2D、7A、7B和7D染色体上,可分为3个亚族,同一亚族成员具有相似的基因结构和保守基序。种内共线性分析显示,共有9对染色体存在组内共线性关系,表明家族成员进化的保守性。顺式作用元件分析发现,TaSBE家族成员含有大量与生长发育相关的响应元件。RNA-seq和qPCR分析结果表明,TaSBE1-7A、TaSBE1-7B、TaSBE1-7D基因在籽粒中高表达。序列多态性分析发现,TaSBE1-7A及TaSBE1-7B均存在规律性SNP位点,可分别将其分为2种单倍型。针对TaSBE1-7A和TaSBE1-7B基因分别开发KASP分子标记,结果表明,位于TaSBE1-7B 完整基因组序列1 088 bp (G/A)的KASP标记可有效区分2种单倍型。籽粒淀粉含量关联分析表明,携带TaSBE1-7B-HapⅠ单倍型的品种籽粒淀粉含量显著高于TaSBE1-7B-HapⅡ,且该单倍型在小麦育种过程中受到正向选择。本研究为进一步解析TaSBE1基因调控籽粒发育和淀粉合成的分子机制提供理论依据。

• 不同小麦品种籽粒类胡萝卜素含量及关键调控基因表达分析

  李吉虎, 宋国琦, 耿嘉涛, 李玮, 张淑娟, 张荣志, 高洁, 李玉莲, 李根英

  深入分析小麦(Triticum aestivum)籽粒类胡萝卜素含量及关键基因表达模式,对培育高类胡萝卜素含量小麦品种具有重要意义。本研究利用高效液相色谱和质谱联用方法对'金麦1号' (JM1)、'济麦1803' (JM1803)和'济麦8040' (JM8040) 3个黄色面粉品种以及'济南17' (JN17)、'济麦22' (JM22)和'济麦44' (JM44) 3个白色面粉品种籽粒类胡萝卜素组分进行比较分析。结果显示,6个品种共检测到7种叶黄素、10种叶黄素酯和3种胡萝卜素,其中叶黄质、玉米黄质等8种组分在6个品种中广泛存在;JM1、JM1803和JM8040含有的组分较多,紫黄质、叶黄质二肉豆蔻酸酯、β-胡萝卜素和八氢番茄红素等4种组分为3个品种特有组分。定量分析结果表明,JM1、JM1803和JM8040总类胡萝卜素含量分别达到9.30、8.97和5.67 μg/g,显著高于其他品种(P<0.05);三者总叶黄素、总叶黄素酯、总胡萝卜素及多数类胡萝卜素组分含量也显著高于其他品种。进一步对籽粒类胡萝卜素合成关键基因PSY1、PDS、ZDS、LCYE和LCYB表达模式进行分析。结果表明,虽然不同品种5个基因表达的趋势一致,但JM1、JM1803和JM8040籽粒PSY1、PDS、ZDS基因在花后14和21 d,LCYE基因在花后7 d以及LCYB基因在花后7、14和28 d表达量显著高于其他3个品种(P<0.05),且上述基因表达量与总类胡萝卜素、叶黄素、叶黄素酯及胡萝卜素含量呈极显著正相关(P<0.01),关键基因的高表达可能是黄色面粉品种类胡萝卜素含量高的原因。本研究为深入认识类胡萝卜素合成途径、培育高类胡萝卜素的小麦品种提供了理论依据。

• 基于SNP芯片的314份小麦种质资源遗传多样性分析和功能标记检测

  吕省亚, 田海红, 李红霞, 樊明, 杨乐, 刘旺清, 裘敏, 李前荣, 张双喜

  在小麦(Triticum aestivum)常规杂交育种过程中,亲本材料主要以当前主推品种为主。这种亲本来源的趋同性导致新育成品种遗传基础日益狭窄,品种间遗传同质化程度加剧,致使大量蕴藏于地方种质资源中的抗病性、抗寒性及广谱抗逆性等优异等位基因资源流失。深入解析宁夏春小麦地方品种与育成品种之间的遗传多样性和亲缘关系,对优化宁夏春小麦育种中亲本杂交组合的选配策略及提高后代选择效率具有重要指导意义。本研究采用100K-GBTS芯片对314份春小麦种质资源进行基因型分析,并基于遗传距离进行聚类分析,将314份小麦种质划分为3个类群。进一步功能基因检测发现,粒重和籽粒大小综合表现最佳的有'96NS4019'和'14Y1269';5个矮杆基因全部表达的有'M423'、'91云315'和'MJ317' 3个材料。通过基因组合与相关性状单因素方差分析发现,基因型为Rht8+Rht-D1材料的株高显著低于基因型为QPht-2D+Rht8+Rht-D1的材料(P<0.05);含有TaCwi-A1+TaGS5-A1+TaT6P基因组合的材料其千粒重显著高于未携带高粒重基因材料(P<0.05)。以上结果为宁夏春小麦未来杂交育种中亲本组合的科学选配及目标性状的定向遗传改良提供了种质资源和分子依据。

• 小麦WRKY24基因家族成员分析及其对低温和2,4-EBR处理的响应

  王昊, 王化俊, 闫红财, 汪军成, 张宏, 司二静, 杨轲, 孟亚雄, 马小乐, 李葆春, 姚立蓉

  WRKY24在调控植物对非生物胁迫(尤其是低温胁迫)的响应中起重要作用。目前关于小麦(Triticum aestivum) WRKY24基因家族成员在低温和2,4-表油菜素内酯(2,4-epibrassinolid, 2,4-EBR)处理下的表达模式研究较少。本研究筛选了小麦WRKY24家族的6个成员(TaWRKY24-1/2/3/4/5/6),结合生物信息学分析和qRT-PCR技术,系统研究其在强抗倒春寒冬小麦品种'济麦22'和弱抗倒春寒冬小麦品种'蚂蚱麦'中的表达模式。结果表明,TaWRKY24-1/2/3基因分布于1号染色体(1A, 1B和1D),而TaWRKY24-4/5/6基因则分布于3号染色体(3A, 3B和3D);2组基因在编码蛋白的分子量与等电点上均存在显著性差异。系统进化树分析显示,小麦WRKY24基因家族成员与水稻(Oryza sativa)同源物的亲缘关系最近;同一亚家族的成员在基序组成及结构上存在明显差异。启动子分析显示该家族基因含有丰富的顺式作用元件,包括响应脱落酸(abscisic acid, ABA)、赤霉素(gibberellin, GA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、光、低温及干旱胁迫的元件,表明其受多种激素和环境因子调控。qRT-PCR分析表明,在低温胁迫下,TaWRKY24-1在'济麦 22'和'蚂蚱麦'中的转录水平均有所上升,TaWRKY24-2/3/4/6基因在'济麦 22'和'蚂蚱麦'中的转录水平均有所下降,在低温胁迫和2,4-EBR的联合处理下,TaWRKY24-1/3/4/5/6在'济麦22'和'蚂蚱麦'中的转录水平均进一步升高。研究结果表明,TaWRKY24基因可能受多种激素和环境因子调控,在低温胁迫及2,4-EBR处理下,不同TaWRKY24基因在强、弱抗倒春寒小麦品种中的表达模式存在差异。本研究为深入解析小麦低温响应分子机制及利用WRKY24家族基因进行抗寒育种提供了重要依据。

• 小麦TaXI-Ⅲ基因转录调控因子的筛选及其与TaWRKY33互作的验证

  刘洋, 白裔凡, 汤梦, 周晶晶, 司红起, 蔡华

  普通小麦木聚糖酶抑制剂(Triticum aestivum xylanase inhibitors, TaXIs)能够抑制禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum) GH11家族木聚糖酶的活性及其诱导的细胞坏死,但其转录调控机制尚不明确。本研究以小麦品种'安农1589'为材料,克隆TaXI-Ⅲ基因的启动子序列,采用PlantCARE数据库分析其顺式作用元件。以TaXI-Ⅲ启动子片段为诱饵,通过酵母单杂交筛选其互作转录因子,并通过点对点酵母单杂交、双荧光素酶报告系统及GUS组织染色实验验证转录因子与启动子的结合特异性。结果表明,本研究成功克隆了TaXI-Ⅲ上游2 138 bp启动子序列,其上含有茉莉酸响应、生物和非生物胁迫响应、MYB及MYC结合位点等顺式作用元件。以pHis-TaXI-Ⅲpro为诱饵载体,在添加120 mmol/L 3-AT (3-amino-1,2,4-triazole)的条件下筛选小麦cDNA文库,共获得4个候选转录因子,分别为TaMYB30、TaPIEP1、TaTGA1a和TaWRKY33。其中,TaWRKY33被证实能够与TaXI-Ⅲ启动子中的W-box元件结合并调控基因表达。qPCR分析结果表明,TaWRKY33与TaXI-Ⅲ在茉莉酸甲酯和禾谷镰刀菌处理下呈现共表达模式;且在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过表达TaWRKY33能增强植株对禾谷镰刀菌的抗性。以上结果表明,TaWRKY33可能通过结合TaXI-Ⅲ启动子中的W-box并依赖茉莉酸信号途径激活基因表达,从而增强对禾谷镰刀菌的抗性。本研究为进一步揭示TaXI-Ⅲ基因的转录调控机制提供了重要参考信息。

• 小麦SFT2基因家族鉴定及其在镉胁迫下的功能初探

  毋柳柳, 唐明明, 孙君艳, 董丽平, 李淑梅, 刘书含, 仝胜利, 杨艳琳, 楚宗丽

  囊泡转运蛋白(vesicle transport protein, SFT2)基因家族在真核生物的膜运输及胁迫响应过程中起关键作用,但其在小麦(Triticum aestivum)中的家族成员鉴定及镉(Cd)胁迫下的功能尚不明确。本研究基于全基因组水平,利用生物信息学方法对小麦SFT2基因家族成员进行系统鉴定,并重点研究了TaSFT2基因参与镉胁迫调控的生物学功能。结果表明,本研究从小麦全基因组中克隆到21个TaSFT2家族成员,分布于15条染色体,且在A、B、D亚基因组间拷贝数分布较为一致。系统发育分析将小麦、玉米(Zea mays)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SFT2蛋白划分为4个组,小麦SFT2s主要分布于D组,揭示其在进化过程中发生功能分化。基因结构和保守基序分析显示,同源基因具有相似的结构特征,所有成员均含4~5个内含子。顺式作用元件分析发现,TaSFT2s含有多个与激素信号(茉莉酸甲酯, 脱落酸)及非生物胁迫(干旱, 低温和厌氧)相关的顺式作用响应元件,表明其可能广泛参与激素信号和逆境响应。表达谱分析表明,TaSFT2s在不同组织和发育时期具有特异性表达模式,部分成员在穗和根中表现出较高的表达水平,提示其可能分别调控穗部发育和根系功能。原核表达实验证实,过量表达TaSFT2-1可显著增强大肠杆菌(Escherichia coli)对Cd胁迫的耐受性。本研究明确了小麦SFT2基因家族的成员构成、进化特征、表达模式及TaSFT2-1在Cd胁迫中的生物学功能,为解析小麦重金属耐受机制及耐Cd种质创制提供理论依据和基因资源。