农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2021年第1期

• 细胞自噬参与脱落酸介导的小麦耐盐作用

  李永波, 崔德周, 黄琛, 隋新霞, 樊庆琦, 楚秀生

  细胞自噬是植物受到环境胁迫时产生的一种自我防御机制。已有证据表明,细胞自噬参与小麦(Triticum aestivum)的耐盐过程,但其在耐盐中的作用及调控机理尚不清楚。本研究以耐盐小麦'德抗961'和不耐盐小麦'兰考323'为材料,通过溶酶体荧光探针和Western blot等方法进行细胞自噬水平的检测,发现盐胁迫促进两个品种小麦发生细胞自噬,但'德抗961'的细胞自噬水平明显高于'兰考323';阻断细胞自噬后,小麦幼苗的生长受到显著抑制。另外,'德抗961'中脱落酸(abscisic acid, ABA)信号途径的关键基因PYL1 (pyrabactin 1)、PYL2、PYL3和SNRK2 (sucrose non-fermenting related protein kinase 2)的表达量明显高于'兰考323';施加外源性ABA后,'德抗961'的细胞自噬水平明显高于'兰考323',推断ABA信号途径通过促进细胞自噬来提高小麦的耐盐性。本研究对于深入探讨小麦的耐盐机理、培育耐盐小麦新品种具有一定的理论和实践意义。

• 贵州地方稻种‘平塘黑糯’低温应答类糖基转移酶基因(OsCUGT1)的克隆及突变体创建

  蔡明亮, 陈蓉, 黄小贞, 赵德刚

  糖基转移酶(glycosyltransferase, GTs)在植物的生长发育和逆境胁迫中有重要作用。为了进一步挖掘和研究水稻(Oryza sativa)中新的糖基转移酶的生物学功能,本研究从前期构建的贵州地方稻种'平塘黑糯' (O. sativa ssp. japonica)低温响应转录组文库中,筛选并克隆了1个低温应答类糖基转移酶基因(cold-upregulated glycosyltransferase-like gene 1, OsCUGT1)。荧光定量PCR分析发现,OsCUGT1基因受到低温诱导表达。亚细胞定位结果显示其定位于叶绿体。序列比对结果表明,'平塘黑糯'中OsCUGT1基因与'日本晴'(O. sativa ssp. Nipponbare)相比,存在着多个碱基的差异。其中第511 bp的碱基发生了改变,由C变为A,碱基的改变造成了第170位氨基酸由赖氨酸(lysine, Q)变成了谷氨酰胺(glutamine, K)。对该基因序列进行多样性分析,发现该基因序列具有丰富的单核苷酸多态性,并在基因的外显子区域找到12个SNP位点。系统遗传进化树分析显示,OsCUGT1氨基酸序列在单子叶植物中较为保守。进一步利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统,构建了OsCUGT1基因敲除载体。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的愈伤转化、潮霉素筛选及测序分析,成功获得了OsCUGT1基因的定点编辑突变体。该研究结果为进一步明确OsCUGT1在水稻生长发育以及抗逆过程中的作用提供了研究材料和理论依据。

• 杂交水稻苗期杂种优势及基因表达与产量的关系分析

  王颖姮, 徐靖, 蔡秋华, 林强, 何炜, 谢鸿光, 谢华安, 张建福

  植物在发育早期就呈现出明显的杂种优势,苗期是水稻(Oryza sativa)株型形态建成和产量形成的重要时期。为了解苗期杂种优势及基因表达与产量杂种优势的相关性、探索通过水稻苗期表现预测杂交稻产量潜力的可能性,本研究选取杂交水稻有代表性亲本18份,配制45个不完全双列杂交组合,系统考查杂交组合苗期根和苗的杂种优势、基因表达及其与单株产量之间的关系。研究结果表明,同一时期根和苗的性状间、同一组织不同时期性状间都有相关性,苗期性状间有12对性状相关性显著(P<0.05),有2个苗期性状与田间单株产量呈正相关(P<0.05);杂交稻组合在萌发早期(发芽第3天, 3 d after sowing, 3DAS)杂种优势最高;6个苗期性状的中亲优势(middle parent heterosis, MPH)有13对性状正相关(P<0.01),根长-3DAS,根长-14DAS,株高-3DAS的MPH和单株产量MPH正相关(P<0.05);分析了4个根系发育相关基因在杂交稻组合和亲本间播种后第17天的表达模式,有3个基因与第17天植株的根干重和苗干重相关,4个基因的表达水平均与田间单株产量呈显著相关(P<0.05)。杂交水稻组合在种子萌发早期就表现出极强的杂种优势,苗期根和苗各性状间的杂种优势普遍具有相关性。部分性状的杂种优势以及与性状相关的基因表达水平与成熟期单株产量显著相关。本研究为利用水稻早期性状预测产量杂种优势模型的建立和杂交水稻新品种选育提供了理论基础。

• 大麦S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因HvSAMS2对非生物胁迫响应的表达分析

  张寒冰, 张书发, 李毛, 武军, 陈新宏

  植物在盐胁迫环境下通过多胺积累提高自身的耐受性,S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase, SAMS)是多胺合成过程中的重要限速酶。本研究从'农家二棱'大麦(Hordeum vulgare)中克隆HvSAMS2基因,分别对其进行生物信息学、组织表达特异性及非生物胁迫响应、亚细胞定位、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的耐盐性等分析。结果显示,HvSAMS2基因全长为1 297 bp,包含长度为1 185 bp的开放阅读框,中间没有内含子;预测蛋白含有394个氨基酸,分子量为42.83 kD,理论等电点为5.58。氨基酸多重比对分析表明,HvSAMS2与不同物种SAMS蛋白之间高度保守,与粗山羊草(Aegilops tauschii) SAMS2具有最高的同源性(一致率为93.06%)。对绿色荧光蛋白的观察显示,HvSAMS2定位于细胞核和细胞膜上,在细胞核分布更多。qRT-PCR检测结果显示,HvSAMS2表达具有组织特异性,大麦根部的HvSAMS2表达量最高,叶部次之,茎中最低;HvSAMS2被干旱、低温、盐及茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)诱导而显著表达。构建过表达载体pYES2-HvSAMS2,转染酿酒酵母营养缺陷型INVSc1进行异源表达,HvSAMS2基因在盐胁迫下增强了宿主菌的耐盐能力。综上,HvSAMS2可能在响应非生物逆境胁迫过程中具有重要作用,本研究为深入探讨SAMS抗盐的分子机制提供基础资料。

• 沉默辣椒Lcyb和BZR1基因对其叶片类胡萝卜素积累的影响

  李杰, 罗江宏, 杨萍

  类胡萝卜素作为光合系统和抗氧化系统的重要成员,在植物的生长发育和抗逆过程中起着重要作用。为了研究辣椒番茄红素β-环化酶(lycopene β-cyclase, Lcyb)和芸薹素唑耐受因子1 (brassinazole-resistant 1, BZR1)基因在其胡萝卜素合成中的作用,本研究以辣椒(Capsicum annuum) '陕早红'为材料,采用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术构建以烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)介导的Lcyb和BZR1基因TRV-VIGS瞬时沉默体系,采用叶脉注射法获得辣椒Lcyb、BZR1基因表达和RNAi株系幼苗,以未侵染辣椒植株为正常对照,TRV2-八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)基因侵染植株为阳性对照,TRV2空载体侵染植株为阴性对照,通过qRT-PCR检测沉默辣椒中Lcyb和BZR1基因表达,并测定沉默株系叶片类胡萝卜素的积累。结果表明,病毒侵染21 d后,TRV2-PDS侵染的辣椒植株叶片出现白化现象,经qRT-PCR检测发现,Lcyb和BZR1基因表达量均显著降低,且两种沉默株系辣椒叶片类胡萝卜素含量显著低于正常对照植株(P<0.05),说明Lcyb和BZR1基因参与辣椒叶片类胡萝卜素的合成。本研究对TRV介导的基因沉默在辣椒基因功能分析的研究提供了参考依据。

• 牛ZC3H12C基因在组织和胎盘中的等位基因表达及DNA甲基化状态分析

  赵广武, 刘晓倩, 杨子怡, 谷书凯, 杨欣怡, 孟世雄, 张萃, 李世杰

  基因组印记(genomic imprinting)作为表观遗传现象，是指依赖亲本来源特异性的单等位基因表达。印记基因在哺乳动物胚胎和胎盘发育以及个体生长中具有重要作用。ZC3H12C (zinc finger CCCH-type containing 12C)基因编码具有CCCH-type锌指结构的转录因子，参与调控人类(Homo sapiens)多种免疫性疾病。ZC3H12C首先在人类胎盘中被发现为印记基因，在牛(Bos taurus)中是否发生印记尚不明确。本研究首先分析牛ZC3H12C基因结构，进而基于SNP比较基因组DNA和cDNA扩增产物的方法分析牛ZC3H12C基因在组织和胎盘中的等位基因表达状态，发现ZC3H12C基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑等6个组织均表现为单等位基因表达，在胎盘中表现为双等位基因表达。进一步利用亚硫酸盐测序法分析ZC3H12C基因的甲基化状态，发现在单等位基因表达的肝脏和肾脏中，X2剪接体的第1个内含子上含有一段差异甲基化区，而在双等位基因表达的胎盘中，该区域呈现轻甲基化。上述结果提示，DNA甲基化可能参与调控牛ZC3H12C基因的单等位基因表达。本研究结果可为深入研究牛ZC3H12C基因的功能提供参考依据。

• 树蛙抗菌肽Cathelicidin在毕赤酵母中的表达及抑菌活性分析

  王莲哲, 刘士俊, 刘佳乐, 洪军

  树蛙(Rhacophorus)抗菌肽Cathelicidin是一类具有广谱抗微生物活性的小分子多肽，在医疗、畜牧等方面有潜在应用价值，但其真核表达少有报道。本研究根据毕赤酵母(Pichia pastoris)的密码子偏爱性进行优化，合成树蛙抗菌肽Cathelicidin的目的基因，与表达载体pPIC9K连接后电击转化至毕赤酵母 GS115，通过高浓度G418筛选高拷贝酵母转化子，通过PCR和反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)验证，获得的阳性转化子使用1%甲醇诱导表达72 h后，收集培养液上清液进行体外抑菌活性检测及毒性分析。结果表明，树蛙抗菌肽Cathelicidin在毕赤酵母GS115中获得成功表达，分泌表达的抗菌肽对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherchia coli)具有抑菌活性，最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)分别为(1.175±0.002)和(2.35±0.001) μg/mL，最小抑菌浓度下没有细胞溶血性。本研究为新型树蛙抗菌肽的工业生产提供基础数据支持。

• 常温和低温纤维素降解菌的分离及其降解特性

  孟建宇, 陈勿力吉玛, 郭慧琴, 冯福应, 陈玉萍

  寻找适合的纤维素降解菌是解决内蒙古等北方地区纤维素有效应用的关键。本研究采用富集培养和纯培养法对内蒙古西部地区的纤维素降解细菌进行分离并分析其降解特性,以期获得一些高效纤维素降解菌。基于16S rDNA基因序列进行同源性比对以确定种属,用3, 5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)比色法测定纤维素酶活性,并对酶活较高的菌株进行产酶条件优化。结果表明：总共分离到59株纤维素降解细菌,包括分别在10 ℃下分离到的36株低温纤维素降解细菌和28 ℃下分离到的23株常温纤维素降解细菌;16S rDNA序列分析显示59株菌分别属于α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及放线菌门(Actinobacteria)。其中,α-变形菌纲为常温纤维素降解细菌中第1优势菌群,β-变形菌纲和放线菌门为第2优势菌群;γ-变形菌纲为低温纤维素降解细菌中第1优势菌群,拟杆菌门为第2优势菌群。在属水平上,假苍白杆菌属(Pseudochrobactrum)为常温纤维素降解细菌中第1优势菌属,假单胞菌属(Pseudomonas)为第2优势菌属;假单胞菌属为低温纤维素降解细菌中第1优势菌属,鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)为第2优势菌属。菌株CB04 (属于纤维菌属(Cellulomonas))的羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose, CMC)酶活在所有菌株中最高,优化后的最佳产酶条件为：酵母提取物为氮源,培养时间为4 d,pH值为7,其CMC酶活可达114.6 U/mL,是极具开发潜力的纤维素酶生产菌菌株。本研究揭示了内蒙古西部地区可培养纤维素降解细菌的类群组成及其纤维素降解能力,为认识和利用纤维素降解菌提供理论依据和实践基础。

• 猪流行性腹泻病毒对仔猪小肠黏膜屏障以及粘附连接蛋白基因表达的影响

  杜雨露, 周雅静, 王海飞, 吴正常, 吴圣龙, 包文斌

  猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是引发仔猪(Sus scrofa)腹泻的常见病原,仔猪感染PEDV后小肠黏膜屏障被破坏,引发腹泻,其中粘附连接(adherens junction, AJ)是肠道黏膜屏障重要的组成部分。为了探讨PEDV对仔猪小肠黏膜屏障以及粘附连接蛋白基因表达的影响,本研究通过石蜡切片光镜观察PEDV对仔猪小肠黏膜的影响,并利用荧光定量PCR检测E-钙粘蛋白(E-cadherin)、整合素(Integrin)和结合素1 (Nectin-1)基因在PEDV感染和正常仔猪肠道以及细胞感染中的表达变化,进一步分析其与肠道屏障功能的关系。结果显示,感染PEDV的仔猪肠道绒毛受损、脱落,固有层暴露,肠腺萎缩;而正常仔猪肠道黏膜屏障结构完整、层次分明。PEDV感染组十二指肠中E-cadherin基因表达量显著低于正常组(P<0.05),空肠中Nectin-1基因表达量极显著低于正常组(P<0.01),其余无显著差异。细胞感染实验同样显示PEDV侵染猪小肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cell line J2, IPEC-J2)后E-cadherin和Nectin-1基因表达量显著降低。研究结果表明,PEDV感染仔猪肠道发生明显病变,小肠黏膜屏障受损,粘附连接被破坏,其中E-cadherin和Nectin-1基因表达显著下调,不利于维持肠道黏膜屏障完整性,而肠道黏膜屏障的受损可能进一步促进了仔猪腹泻的发生。本研究初步揭示了PEDV对仔猪小肠黏膜屏障以及粘附连接的影响,为今后从肠道屏障角度研究PEDV的致病机理提供理论参考。

• 通过全长cDNA扩增及高通量测序技术获取呼肠孤病毒科病毒的全基因组序列

  李占鸿, 宋子昂, 朱建波, 杨振兴, 李卓然, 李华春, 杨恒

  获取呼肠孤病毒科(Reoviridae)病毒的全基因组序列在该科病毒的分类学和流行病学研究及诊断试剂开发等方面具有重要意义。本研究通过全长cDAN扩增 (full-length amplification of cDNAs, FLAC)与二代测序 (next generation sequencing, NGS) 技术,获取了蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus, EHDV)、帕利亚姆病毒(Palyam virus, PALV)、广西环状病毒(Guangxi orbivirus, GXOV)、西藏环状病毒(Tibet orbivirus, TIBOV)、哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalian orthoreovirus, MRV)、版纳病毒(Banna virus, BAV)和芒市病毒(Mangshi virus, MSV)等8种不同呼肠孤病毒科病毒的全基因组序列。本研究建立的FLAC技术,具有高度的灵敏性,无需目标病毒的任何基因序列信息与引物设计,可在1个反转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)反应中扩增不同种属呼肠孤病毒科病毒完整的基因组DNA。扩增8种病毒的基因组大小在18 266 至23 605 bp之间,基因节段数目为10或12节段。将扩增病毒的全基因组PCR产物进行NGS测序与从头组装(de novo)拼接,可在1周内获取病毒的全基因组序列。不同毒株测序产生的数据量在1.6~1.9 Gb之间,用于病毒基因组拼接的reads数(Q>30)在293 016 800至423 210 600之间,病毒基因组中每个碱基位点的测序深度在6 000至20 000之间。呼肠孤病毒科病毒全基因组扩增与高通量测序技术的建立,为快速准确地获取呼肠孤病毒科病毒的全基因组序列,开展病毒进化与变异、诊断试剂开发与流行病学等方面的研究提供了技术保障。

• 植物WRKY转录因子：结构、分类、进化和功能

  任永娟, 王东姣, 苏亚春, 王玲, 张旭, 苏炜华, 阙友雄

  WRKY因其特殊的七肽保守序列WRKYGOK而得名,是植物中最大的转录因子(transcription factors, TFs)家族之一,广泛参与植物对生物、非生物和激素胁迫的响应。WRKY TFs主要通过特异性结合靶基因启动子的顺式作用元件(T)TGAC(C/T) (W-box)来调控靶基因的表达和参与到植物响应不同生物、非生物和激素的信号通路中以及与多种蛋白发生相互作用来实现其在不同信号转导途径中的功能。本文针对WRKY TFs的结构、分类、起源与进化及其在响应生物、非生物胁迫和激素信号中的功能和调控机制进行了阐述,目的是系统总结植物WRKY TFs的研究进展,为相关研究者深入了解WRKY TFs及其介导植物抗逆性提高的分子机制,为作物遗传改良,提供有益参考。

• 动物反转录转座子研究进展

  安亚龙, 陈子璇, 迟诚林, 陈才, 宋成义, 王宵燕

  反转录转座子是一类在基因组中能完成自我复制,以RNA作为中介,在反转录酶的作用下,整合到基因组其他位点中的功能元件。反转座子在生物基因组中拷贝数不断增多是基因组变大的一个主要原因,也是产生遗传变异的主要来源和驱动基因组进化的动力;反转座子的转座使染色体断裂、重排以及形成插入突变等结构变异,也参与基因组的表观调控以及异染色质结构的形成,并和基因的结构和功能变化紧密联系;反转座子对基因组、转录组和功能基因的影响已成为后基因组时代的研究热点。本文综述了动物反转座子的结构特征、在基因表达中的功能、近些年来反转座子在动物基因组进化过程中的作用及作为分子标记在动物生产中的应用;为反转录转座子在动物基因组和转录组中的功能作用,以及在动物特别是畜禽生产、遗传育种领域中的应用提供参考依据。

• 基于高校学生认知度的转基因科普及产业化的思考和建议

  程伟, 刘昆霖, 何水林, 廖玉才

  转基因技术是现代生物技术的核心,也是当今最易引起公众争论的社会议题之一。为了全面了解高校学生对转基因生物(genetically modified organisms, GMO)的认知现状,本研究对我国31个省/市174所高校的1 085名学生进行了问卷调查与分析。发现目前高校学生了解转基因的主要渠道依次为电脑(或手机)网络>电视>报刊杂志>日常交流>课程或讲座。高校学生支持/反对转基因的比例(3.22/1),是普通公众支持/反对转基因之比(0.29/1)的11倍;支持转基因与学历、学科、专业知识高度相关。在购物时,近55%的高校学生不会关注是否为转基因食品,约36.6%愿意或按需购买转基因食品,50.6%会综合考虑“性价比”等因素后再做决定,12.8%拒绝或抵制购买。同时,近1/4非常看好我国转基因产业化发展前景,1/10不看好。基于这些调查分析,本研究对目前高校的转基因科普宣传及相关通识课程设置与改革提出了一些思考和建议,还概述了我国转基因作物研发和产业发展的新态势,并提出一些对策,有助于有序推进我国转基因产业化的健康发展。

• 基因枪介导的普通小麦共转化体系的优化

  贺晓岚, 王建伟, 陈新宏, 李文旭, 汤宏

  高效安全的转基因技术对于推进转基因植物商业化生产、降低食品和环境安全风险具有重要意义。共转化法是获得无标记转基因植物的有效手段,为了确立筛选基因(bar)与目的基因β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase, gus)共转化小麦(Triticum aestivum)的最佳摩尔比,建立安全高效的小麦共转化体系,本研究以普通小麦'科农199'为受体材料,完整质粒pAHC25为参照,采用基因枪介导法将Ubi-bar基因表达盒或pAHC20与Ubi-gus基因表达盒分别按摩尔比1∶1,1∶2,1∶3共6个独立共转化组合导入受体材料,经胚性愈伤组织诱导、选择培养、再生等过程筛选稳定转化子。结果表明,随着Ubi-gus摩尔浓度增加,gus基因瞬时表达率显著增加,但瞬时表达与稳定表达之间无相关性。不同组合之间转化率差异显著,其中以Ubi-bar或pAHC20∶Ubi-gus摩尔比1∶2转化率最高。Ubi-bar或pAHC20∶Ubi-gus摩尔比为1∶2时,完整质粒转化率显著低于最小表达盒,但是,摩尔比为1∶1或1∶3时,完整质粒显著高于最小表达盒的转化率。GUS染色和Southern blot检测结果表明,gus基因能在受体细胞中稳定整合、表达及遗传。除结实差,阳性株系在形态上与对照无差异。该转化体系的建立为小麦遗传转化研究打下了坚实的基础。

• CP4-EPSPS蛋白抗原表位鉴定及其快速DAS-ELISA检测方法的建立

  候吉超, 李忠鹏, 梁雨欣, 张春雨, 于寒松, 李小宇, 王永志

  中国每年进口大量转基因大豆(Glycine max),其中主要为cp4 epsps转基因大豆,需建立一种针对cp4 epsps转基因大豆的高效的快速ELISA鉴定方法。本研究利用合成多肽法将CP4-EPSPS蛋白分段表达,初步定位了5株CP4-EPSPS单克隆抗体识别的抗原表位,采用方阵法对识别不同抗原表位的单抗进行配对,以P/N最大值确定工作抗体及其浓度,通过控制变量法,确定最佳检测条件,建立cp4 epsps转基因大豆快速双抗夹心ELISA (double antibody sandwich ELISA, DAS-ELISA)检测方法。并通过特异性试验、重复性试验、阳性判定值试验,对建立的检测方法进行性能评估,利用建立的检测方法和商品化试剂盒同时对130份样品进行检测,比较其符合率。通过方阵法确定单抗2D3为捕获抗体,单抗1D10为检测抗体时检测信号最强,2D3工作浓度为20 μg/mL,1D10工作浓度为10 μg/mL。捕获抗体最佳包被条件为37 ℃封闭2 h,4 ℃过夜,样品与检测抗体先后加入酶标板37 ℃共同孵育10 min。该方法灵敏度为叶片或籽粒稀释160倍(g/mL),待检叶片最佳稀释范围是10~80 (g/mL)、籽粒最佳稀释范围是10~40 (g/mL)。板内、板间变异系数小于25%,阳性判定值为1.41。对70份大豆叶片、40份大豆籽粒和20份豆浆进行检测,结果与CP4-EPSPS蛋白ELISA试剂盒检测结果比较,符合率为100%,且与其他蛋白不发生交叉反应。本研究建立的快速ELISA检测方法具有良好的准确性、重复性和特异性,该检测方法仅需30 min完成检测,适用于大豆植株、大豆籽粒及豆浆的快速鉴定。

• 四种单碱基编辑器在羊成纤维细胞上的编辑效率

  孙嘉媛, 孙珂欣, 丁一格, 周世卫, 高亚伟, 陈玉林, 王小龙

  单碱基编辑器作为一种新型的CRISPR衍生工具,具有精准、高效及低脱靶等优点,现已应用于多种生物体中。单碱基编辑器经过不断改造目前已开发出多个版本。为探究不同版本碱基编辑器在羊成纤维细胞上的编辑效率,本研究选定滩羊(Ovis aries)的绵羊多胎基因(fecundity booroola, FecB)和陕北白绒山羊(Capra hircus)的成纤维细胞生长因子5 (fibroblast growth factor 5, FGF5)基因,利用xCas9-ABE (腺嘌呤碱基编辑器, adenine base editor)、ABEmax4、xCas9-BE4和BE4max 4种新型单碱基编辑器,在滩羊和陕北白绒山羊胎儿成纤维细胞上进行单碱基定点编辑。结果显示,在绵羊细胞中,ABEmax编辑效率为46.15%,xCas9-ABE的编辑效率为38.46%,比普通编辑器ABE7.10分别高出27.4%与19.71%;在山羊细胞上,BE4max的编辑效率为92.86%,比普通编辑器BE3高56.5%,但xCas9-BE4未产生编辑。综上所述,本研究在羊胎儿成纤维细胞的碱基编辑应用中筛选出最优碱基编辑器,证明了高效定点编辑羊基因组的可行性,同时也为碱基编辑器应用于大型哺乳动物基因编辑提供技术支撑。

• 利用CRISPR/dCas9系统构建适用于芽胞杆菌基因敲减的重组质粒及其应用

  陶冶, 赵素雅, 尹晓燕, 刘苏瑶, 魏旭阳, 牛秋红

  芽胞杆菌(Bacillus)在自然界中广泛存在,是一类重要的生防资源。以芽胞杆菌为对象建立简便高效的遗传学操作技术有助于相关分子机制研究的开展。本研究采用分子生物学手段构建可简便高效地用于芽胞杆菌基因敲低的重组质粒pBD1。为了验证pBD1在芽胞杆菌中基因敲低效率,进一步设计杀线虫芽胞杆菌(Bacillus nematocida) B16丝氨酸蛋白酶基因bace16的单向导RNA (single guide RNA, sgRNA),将其插入重组质粒pBD1,构建bace16低水平表达载体,电转入B16后比较突变株与野生株的bace16表达差异。结果显示,本研究基于dCas9成功构建了用于芽胞杆菌的可逆型基因敲低重组质粒pBD1,利用qRT-PCR和酶活性测试方法,成功获得了B16中bace16基因表达水平降低的突变株;将异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)移除后,bace16表达基本回复到野生型水平。本研究构建了适用于芽胞杆菌的可逆型基因敲减重组质粒,建立了芽胞杆菌基因敲低及互补系统,为研究芽胞杆菌基因功能提供了基础资料。

• 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体液相芯片检测方法的建立

  夏立叶, 姜焱, 单虎, 李桂梅

  猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是危害养猪(Sus scrofa)业最严重的病毒性疾病之一。为建立一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的高通量血清学检测方法,给同时大量监测PRRSV提供技术支撑,本研究通过液相芯片检测技术(multi-analyte profiling solve for unknown x, xMAP technology)建立一种PRRSV抗体检测方法。首先将PRRSV-N (nucleocapsid)蛋白与羧基化的荧光微球偶联,验证偶联效率,与血清样本反应,添加捕获生物素化的检测抗体,最后利用Luminex 200分析系统检测微球的荧光信号,初步建立液相芯片检测抗体技术。接下来,为确定检测阈值,测定32份1∶100稀释无特定病原(specific pathogen free, SPF)猪血清样本的中值荧光强度(median fluorescence intensity, MFI)和标准偏差,计算出阈值。对最佳结合蛋白量进行了探索。对该方法的重复性进行了验证;与商品化试剂盒对比,对该方法的灵敏性进行了研究。对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)和伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)阳性血清进行检测,以验证方法的特异性。分别用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒和液相芯片检测方法检测83份临床采集的猪血清样本,验证两种方法检测结果的一致性。研究结果表明,该方法MFI检测阈值为103.22,最佳结合蛋白浓度为8 μg/1.25×106个微球;批间和批内变异系数均在10%以内,检测方法的重复性良好;与ELISA试剂盒相比,液相芯片检测方法敏感性更高,检测3种不同疾病的阳性血清,证明建立的液相芯片检测方法具备良好的特异性。同时用ELISA和液相芯片检测技术对83份临床采集的猪血清样本进行检测,结果显示,两种检测方法一致性为91.57%。说明利用液相芯片技术高通量检测PRRSV的方法建立成功,本研究为PRRSV的血清学检测提供了一种新方法,也为其他病原体的检测提供了借鉴。

• 基于机器学习的低信噪比细胞图像分割

  阎彧萱, 卢金旺, 宋奕泓, 旷小宇, 田原, 傅静雁

  荧光显微图像在生命科学研究中具有重要作用。利用计算机和机器学习可以有效处理大量图像数据,从而得到具有统计意义的结论。本研究针对低信噪比的细胞荧光图像,提出一种基于U-Net的细胞分割模型,并构建了单通道低信噪比细胞图像数据集用于模型训练和测试。本研究提出的模型使用不同尺度的卷积核提取特征,利用残差模块加深网络深度,并使用权重损失机制使机器学习过程更加关注于细胞边缘。相较于其他方法,在低信噪比荧光显微图像的细胞分割上,可以有效解决细胞与背景对比度低、胞内信号亮度分布不均的问题,其像素准确率、IoU(intersection-over-union)可分别达到87.6%和72.0%。本研究为细胞形态学研究、借助图像的高通量细胞筛选提供技术支持。