农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2020年第1期

• 甘蓝型油菜CIPK2与CIPK16基因的克隆、表达分析与互作CBL蛋白的鉴定

  李燕飞, 辛玉琼, 高世东, 赵培玉, 燕敬利, 陈芹芹, 张翰风, 刘舞贞, 杨博, 李竞, 江元清

  类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶(calcineurin B-like interacting protein kinase, CIPK)是植物中广泛存在的一类参与解码钙信号的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,在植物非生物与生物逆境信号转导中起着重要作用。本研究在甘蓝型油菜(Brassica napus)中通过逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)克隆获得BnaCIPK2 (GenBank No. KF169730)与BnaCIPK16 (GenBank No. MK571826)基因的cDNA序列。序列分析表明,BnaCIPK2和BnaCIPK16基因的开放阅读框分别为1 389和1 386 bp,编码氨基酸残基分别为463与461个,这2个BnaCIPK基因编码的蛋白含有保守的激酶结构域与天冬酰胺-丙氨酸-苯丙氨酸(asparagine-alanine-phenylalanine, NAF)基序。亚细胞定位结果显示,2个CIPK蛋白主要分布于细胞质与细胞核。qRT-PCR结果显示,茉莉酸(jasmonic acid, JA)、冷害以及聚乙二醇(PEG8000)显著诱导BnaCIPK2的表达,百草枯(methyl viologen, MV)处理24 h后极显著抑制BnaCIPK2的表达;水杨酸(salicylic acid, SA)、热害、冷害、双氧水(H2O2)和PEG8000可诱导BnaCIPK16的表达量上调,JA和脱落酸(abscisic acid, ABA)处理则导致BnaCIPK16的表达量下调。酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)与双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)结果表明,BnaCIPK2与油菜钙调磷酸酶B4蛋白(Brassica napus calcineurin B-like protein 4, BnaCBL4)、BnaCIPK16与BnaCBL3存在互作。本研究为阐明BnaCIPK2与BnaCIPK16的功能与调控机制提供了基础资料。

• 基于不结球白菜转录组EST-SSR标记开发及多态性分析

  杨丹青, 何晓丽, 杜志杰, 王树彬, 孙笠维, 林义章, 邵贵荣, 钟凤林

  由转录组测序信息获得的EST-SSR标记具有通用性好、保守性高、多态性丰富、共显性遗传等优点,广泛应用于植物种质资源的遗传多样性分析。本研究通过对不结球白菜(Brassica rapa ssp. chinensis)转录组高通量测序,挖掘SSR位点和开发EST-SSR标记,并进行引物的初步验证及其多态性分析。在不结球白菜转录组的48 817条Unigene序列中共搜寻到17 009个SSR位点,发生频率为18.44%,SSR分布频率为34.84%。不结球白菜SSR位点共包括212种重复基元。其中,单、二和三核苷酸重复为不结球白菜转录组SSR的主要类型,占SSR总量的98.31%。单核苷酸重复最多,占总量的39.70%,其优势重复单元为T/A (26.83%)。利用Primer Premier 3.0设计EST-SSR引物,在批量设计的引物中随机挑选40对进行合成并初步验证,25对引物在92份不结球白菜种质资源中均能扩增出预期大小的条带。其平均等位基因数3.72个,有效等位基因数(effective number of alleles, Ne)、Shannon's指数(Shannon's index, I)、多态性信息指数 (polymorphism information content, PIC)和基因多样性(gene diversity, GD)分别为2.710 8、0.999 1、0.488 4和0.545 2。所获得的EST-SSR引物可为不结球白菜及芸薹属其他植物的遗传结构分析、种质资源利用及遗传图谱构建提供有效的分子标记。

• 水稻CMS-WA育性的光温敏感性分析

  林强, 罗曦, 谢鸿光, 何炜, 王颖姮, 蔡秋华, 张建福

  水稻(Oryza sativa)细胞质雄性不育(cytoplamic male sterility, CMS)系花粉育性不同程度的波动,直接影响杂交稻种子纯度。为了研究水稻野败型细胞质雄性不育(cytoplamic male sterility of wild abortion, CMS-WA)系育性的光温敏感性,本研究设置4个播栽期,4个不同光照长度处理,选择3个微效恢复基因数量不同的野败型(wild abortion type, WA)不育系'珍汕97A'、'龙特浦A'和'京福1A',以嵌合颖花率(rate of florets with fertile anthers)和黑染花粉率(dark pollen rate by I2-IK dyed)为育性指标,应用回归模型分析播栽期温度及光照长度对不育系花粉育性的影响。结果表明,光温互作对不育系中微效恢复基因的表达有重要的影响,随着播栽温度的上升,3个不育系的黑染花粉率和嵌合颖花率总体上均表现上升趋势,'珍汕97A'、'京福1A'的花粉育性对光照长度没有明显的反应,而光照长度对'龙特浦A'的效应达显著水平(P<0.05)。'龙特浦A'可归类为温光并进型,光照长度作用随播栽期温度同时发生互促效应,温光并进型不育系采取早繁早制的措施,种子纯度高;而在选育和提纯上,应在高播栽期温度短日照的条件下进行,及早剔除不合格单株或株系。'珍汕97A'和'京福1A'可归类为温度敏感型,光照长度效应不明显,因而低播栽期温度下繁殖和制种,高播栽期温度下选育和提纯,效果较好。本实验结果对不育系原种提纯、选育改良及繁殖制种具有指导和参考作用。

• 低温胁迫下玉米根系生理变化及相关基因表达分析

  赵训超, 盖胜男, 魏玉磊, 许晓萱, 丁冬, 刘梦, 张今杰, 邵文静, 徐晶宇

  低温是北方地区限制玉米苗期生长的主要非生物胁迫之一。本研究以玉米(Zea mays)自交系'合344'为实验材料,分析玉米幼苗在5 ℃低温处理12 h,24 h,3 d和7 d时,其根系抗氧化系统和渗透调节物质的变化及相关基因表达情况。结果表明,低温处理7 d时,玉米幼苗根系的鲜重和干重与对照相比分别降低了47.9%和66.7%;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD),过氧化氢酶(peroxidase, POD)活性逐渐升高,与对照相比分别提高了44.8%和30.1%;脯氨酸(proline, Pro)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量与对照相比分别上升了77.6%和83.1%。对低温处理3 d玉米幼苗根系进行了转录组测序分析,从中筛选10个ZmSODs基因,大多数基因上调表达,其中ZmSOD1,ZmSOD7和ZmSOD9与其他基因相比上调表达较高;筛选出12个上调表达的ZmPODs基因,其中ZmPOD35,ZmPOD92,ZmPOD94和ZmPOD108相对表达量较高;筛选出9个编码脂氧和酶(lipoxygenase, LOX)的基因,其中ZmLOX3, ZmLOX5, ZmLOX6和ZmLOX7上调表达;筛选出3个与脯氨酸合成相关的吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS),其中ZmP5CS1和ZmP5CS4上调表达。本研究为进一步研究作物在低温胁迫下生理指标及相关基因表达调控规律提供参考资料。

• ‘皇冠李’苹果酸转运体基因ALMT4、ALMT9和tDT密码子偏好性分析

  巫伟峰, 陈明杰, 陈发兴

  AL3+激活的苹果酸转运体4基因(aluminum-activated malate transporter 4, ALMT4)、AL3+激活的苹果酸转运体9基因(aluminum-activated malate transporter 9, ALMT9)和液泡膜二羧酸转运体基因(tonoplast dicarboxylate transporter, tDT)可能是参与李(Prunus salicina)果实苹果酸转运与积累的关键基因,密码子偏好性分析对其后续基因功能研究具有重要意义。该研究运用CodonW和CUSP程序分析了‘皇冠李’(Prunus salicina 'Huangguan') ALMT4、ALMT9和tDT基因的密码子偏好性,并与大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)、烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)及番茄(Lycopersicon esculentum)等模式物种基因组密码子偏好性进行比较。结果显示,‘皇冠李’ALMT4、ALMT9和tDT基因的有效密码子数(effective number of codons, ENC)远高于35,接近61,密码子适应指数(codon adaptation index, CAI)远小于1,接近0,密码子偏好性较弱。ALMT4和ALMT9偏好A/U(T)结尾的密码子,tDT偏好U(T)/C结尾的密码子。ALMT4的高频密码子有GCA、AGA、UGU、GGU、CCU、ACU、UAU、UUU、GAA、CAU、AAU、GAU,ALMT9的高频密码子有GCA、AGG、GGA、CAU、UUG、UCA、ACA、AAU、GAU、UUU、UAC,tDT的高频密码子有GCU、AGG、CGA、UGC、GAG、GGA、UUG、AGC、UCC、UAU、GAU、CAA、AAG。基因树相较于基于同义密码子相对使用度(relative synonymous codon usage, RSCU)构建的聚类树更能够反映物种的植物学分类关系。综合考虑密码子偏好性差异、成本、便捷等因素,酵母是‘皇冠李’ALMT4、ALMT9、tDT基因较理想的异源蛋白表达系统,番茄是较理想的异源植物表达系统。以酵母和番茄为例对‘皇冠李’ALMT4、ALMT9和tDT基因CDs序列进行改造优化,改造后的基因序列具有酵母和番茄基因组的密码子偏好性特征。本研究为后续的基因功能研究提供了理论基础。

• 毛竹PeNAC047基因的克隆与表达分析

  赵钟毓, 侯丹, 胡秋涛, 魏涵天, 郑颖, 林新春

  毛竹(Phyllostachys edulis)是我国最重要的经济竹种,干旱、盐渍等胁迫不仅影响了毛竹的产量,还限制其分布。NAC (NAM, ATAF1/2, CUC2)作为植物中最大的转录因子家族之一,在植物的生长发育和抗逆等方面都发挥着重要作用。为探究毛竹NAC基因在非生物胁迫方面的调控功能,本研究克隆得到两个毛竹NAC基因PeNAC047-1和PeNAC047-2,并对其序列和表达模式进行分析。结果表明,PeNAC047-1 (GenBankNo. MN013397)和PeNAC047-2 (GenBank No. MN013398)基因编码区分别为879 bp和1 095 bp,编码292和364个氨基酸,均包含明显的无顶端分生组织(no apical meristem, NAM)保守结构域,属于NAC转录因子。PeNAC047-1和PeNAC047-2启动子区域包含赤霉素(gibberellin acid, GA)响应元件、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)响应元件、脱落酸(abscisic acid, ABA)响应元件等顺式作用元件,提示了其可能受非生物胁迫以及激素调控。亚细胞定位和转录激活实验结果表明,PeNAC047-1和PeNAC047-2为定位在细胞核上的转录激活子。组织特异性表达分析结果显示,PeNAC047-1和PeNAC047-2在毛竹各组织中均有表达,且在根系中表达丰度最高,叶片和茎中次之。在非生物胁迫下,PeNAC047-1和PeNAC047-2的表达均被高盐和高温胁迫诱导,被干旱胁迫抑制。在激素处理下,PeNAC047-1和PeNAC047-2的表达均被MeJA诱导;PeNAC047-1和PeNAC047-2对GA3处理的响应模式存在差异,其中,PeNAC047-1为GA3早期(3~6 h)响应因子,PeNAC047-2为GA3晚期(48~72 h)响应因子;此外,在ABA处理下PeNAC047-1和PeNAC047-2表达模式相反,其中,PeNAC047-1被ABA诱导,PeNAC047-2被ABA抑制,推测其可能通过不同的信号途径参与非生物胁迫调控。本研究探究了PeNAC047-1和PeNAC047-2与非生物胁迫应答的关系,为毛竹抗逆分子机制的研究提供了基础资料。

• 牦牛胎盘组织细胞凋亡相关蛋白的表达

  马悦, 樊江峰, 何翃闳, 韩小红, 余四九, 崔燕, 徐庚全, 王立斌, 潘阳阳, 于艺腾, 赵生贤, 马进彪

  胎盘是妊娠期连接母体和胎儿的纽带,在妊娠期经历了从形成、发育到成熟、退化的动态变化过程,其功能异常可能导致胎儿发育异常甚至流产。细胞凋亡是胎盘组织维持动态平衡和发挥正常功能的重要方式。为研究牦牛(Bos grunniens)妊娠各个阶段胎盘组织细胞凋亡的动态变化规律及其分子机理,本研究采集妊娠各个阶段牦牛的胎盘组织,用免疫组织化学法(immunohistochemistry)检测凋亡相关蛋白死亡受体(factor associated suicide, Fas)/死亡受体配体(factor associated suicide ligand, Fasl)、B淋巴细胞瘤-2基因(b-cell lymphoma-2, Bcl-2)/B淋巴细胞瘤-2基因相关X蛋白(b-cell lymphoma-2 assaciated X protein,Bax)以及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (cysteinyl aspartate specific proteinase3, Caspase3)/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 (cysteinyl aspartate specific proteinase 9, Caspase9)的表达情况。结果显示,Fas和Fasl蛋白在附植期及妊娠早期胎盘组织中有较高的表达,随着妊娠的进行呈现下降趋势。Bcl-2蛋白主要表达在胎儿绒毛上皮且随着妊娠期延长表达量逐渐下降。Bax在胎儿绒毛上皮和早期滋养层中有较高的表达且在妊娠末期有明显的升高。Caspase3主要表达在子宫内膜,而Caspase9则清晰的表达在胎儿滋养层中。可见凋亡相关蛋白Fas/Fasl、Bcl-2/Bax和Caspase3/Caspase9在牦牛妊娠期胎盘组织中有着广泛的细胞特异性和时间特异性表达模式。推测凋亡相关蛋白介导的细胞凋亡,在胎盘组织形成、发育、成熟、退化的动态变化过程中,调控着胎盘细胞的正常更新和动态平衡,在胎盘组织正常功能维持中发挥着重要作用。本研究为解决牦牛生产过程中的问题如流产、胎儿生长受限等异常现象提供了一定的理论基础。

• KRTCAP3基因多态性与细毛羊产毛及生长性状的相关性分析

  王丽, 胡瑞雪, 李发弟, 乐祥鹏

  角化细胞相关蛋白3基因(keratinocyte-associated protein 3, KRTCAP3)主要调节角蛋白表达进而影响机体皮肤、指甲和毛发的生长发育。为了解KRTCAP3基因在'南甘'杂交绵羊(Ovis aries)群体中的遗传变异及其与产毛和生长性状之间的关系,本研究以南非肉用美利奴(Ovis aries)(♂)×甘肃高山细毛羊(♀)('南甘')及南非肉用美利奴(♂) ×'南甘' (♀) ('南南甘')杂种羊为研究对象,采用DNA混合池测序结合SNPscanTM高通量SNP分型技术对KRTCAP3的基因全长进行SNP扫描,同时分析SNP位点与杂种羊产毛和生长性状的相关性。结果表明,在KRTCAP3基因第2内含子上发现1个g.34287851C>G的SNP位点,鉴定到CC、CG和GG 3种基因型,其基因型频率分别为0.35、0.52和0.13,C和G等位基因频率分别为0.61和0.39。遗传参数分析发现,杂合度(heterozygosity, He)、纯合度(homozygosity, Ho)、有效等位基因数(effective number of alleles, Ne)和多态信息含量(polymorphic information content, PIC)分别为0.47、0.53、1.90和0.36,属于中度多态(0.25<PIC<0.50)。χ2适合性检验表明,该SNP在研究群体中不处于Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。SNP与毛用性状的关联分析发现,该SNP位点与肩部和体侧毛长、股部和背部毛长、羊毛卷曲度和卷曲回复率相关(P<0.05或P<0.01);SNP与生长性状的关联分析发现,该位点与管围和胸围性状相关(P<0.05或P<0.01)。综上,KRTCAP3基因g.34287851C>G位点可作为分子标记辅助选育的候选分子标记,在细毛羊品种选育和培育肉毛兼用新品种中利用,加快育种进程。

• 巴什拜羊miR-486多态性及其表达规律研究

  张伟, 王世银, 石国庆, 邓双义, 刘晓娜, 杨力伟

  miR-486在动物肌肉组织中高表达,在成肌细胞的生长发育中发挥着关键作用。为了阐明miR-486在巴什拜羊(Ovis aries)中的多态性及其表达规律,本研究采用stem-loop qRT-PCR对巴什拜羊胎儿期100 d不同组织,以及胎儿期和出生后共计8个不同发育阶段骨骼肌中miR-486的表达情况进行了定量分析;采用PCR-单链构象多态性(PCR-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)技术检测了巴什拜羊群体中miR-486前体(precursor miR-486, pre-miR-486)序列的突变情况,并在细胞水平研究了突变对pre-miR-486序列加工成熟的影响。结果表明,miR-486在巴什拜羊100 d胎儿心肌和骨骼肌组织中高表达,在胃、肠组织中度表达,而在肝、脾、肺、肾、皮肤和脑组织中表达量相对较低;miR-486在胎儿期40~100 d的骨骼肌中表达量持续上升,到胎儿期100 d时达到峰值,然后逐渐下降,至胎儿期120 d时达到最低值,而后又逐渐上升直至出生后90 d;在巴什拜羊群体中发现pre-miR-486序列存在1处G>C突变,位于miR-486成熟序列上游第1个碱基处,在100只巴什拜羊中分别检测到GG、GC和CC 3种基因型,但91%的个体为GC基因型,进一步研究结果表明,在骨骼肌卫星细胞中突变型的CC基因型可显著提高细胞中miR-486的表达水平(P<0.05)。本研究可为进一步阐明miR-486对巴什拜羊骨骼肌发育的调控机制及其与巴什拜羊优良肉质性状的关联性提供基础资料。

• 猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Marc-145细胞自噬的超微结构

  李小璟, 龚双燕, 李幽幽, 陈瑛琪, 蔡瑶, 李雨濛, 徐逸飞, 徐志文, 朱玲

  细胞自噬是病毒感染及肿瘤发展等的基础研究热点之一。本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)诱导非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)胚胎肾细胞Marc-145发生自噬,以明确自噬体特征、自噬体判定以及细胞超微结构的变化特征。通过荧光显微镜及透射电子显微镜对细胞状态及自噬体进行观察,初步判定自噬发生,而后对溶酶体、内质网、线粒体和细胞核等的超微结构变化进行观察。结果显示,PRRSV感染使Marc-145细胞由典型的梭形变为圆形,且被感染细胞内有明显的自噬体存在;同时出现线粒体嵴溶解、内质网脱颗粒、溶酶体活动增强以及细胞核异常等超微结构的变化。上述结果表明,PRRSV诱导Marc-145细胞发生自噬,细胞自噬程度与超微结构密切相关,超微结构的状态可用作判定自噬发展进程的重要参考。本研究可为自噬、细胞超微结构及病毒感染等的研究提供参考依据。

• 环境雌激素双酚A暴露干扰仔鼠卵巢发育的研究

  张石磊, 包佳鹭, 史万玉, 钟秀会

  双酚A (bisphenol A, BPA)是一种无处不在的环境雌激素。为探究小鼠(Mus musculus)孕期和哺乳期连续暴露BPA对子代卵巢发育的影响,。本研究将8周龄孕0 d母鼠随机分为7组,每组20只,分别通过饮水给予蒸馏水和0.05、0.5、5、10、20和50 mg/kg BPA。从母鼠孕0 d开始直到仔鼠21 d断奶,仔鼠并未直接接触BPA,而是通过孕期胎盘传递和哺乳期乳汁传递间接接触BPA,小鼠均于孕20 d分娩,故仔鼠间接接触BPA时间为41 d。结果显示,母鼠染毒BPA剂量≥20 mg/kg时,仔鼠血清和卵巢中BPA含量显著增加(P<0.05)。器官指数测定结果显示,染毒BPA剂量≥10 mg/kg可使仔鼠卵巢指数显著增大(P<0.05)。苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)病理组织切片的观察结果则证明,极低剂量BPA (≥0.05 mg/kg)即可使仔鼠卵巢产生损伤,卵泡颗粒细胞层出现破损。细胞凋亡原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL)实验结果显示,母鼠染毒BPA≥20 mg/kg时卵巢颗粒细胞发生细胞凋亡(P<0.05)。免疫组化结果显示,母鼠染毒BPA剂量≥20 mg/kg时仔鼠卵巢雌激素受体α (estrogen receptor α, ERα)表达量显著增多(P<0.05);而母鼠染毒BPA剂量为50 mg/kg时其子代雌鼠卵巢ERβ表达量显著升高。转录组测序结果显示,母鼠染毒BPA后仔鼠卵巢相较于空白对照组核糖体通路发生变化,其中核糖体蛋白L3 (ribosomal protein L3, Rpl3)、Rpl21、Rpsa基因表达显著下调、Rps2、Rps28、Rpl26、 Rpl32和Rpl10a基因表达显著上调。这些基因分别与胚胎生殖系统发育受阻、细胞凋亡和卵巢早熟等相关。荧光定量PCR验证了转录组结果。本研究证实了BPA的生殖毒性,在基因层面揭示了核糖体功能蛋白合成异常与BPA的生殖毒性有关,且低剂量BPA抑制核糖体蛋白表达而高剂量BPA促进核糖体蛋白表达,证明了BPA在扰乱卵巢发育的两面性,即低剂量抑制卵巢发育,高剂量促进卵巢发育。使用剂量的不同或许是目前关于BPA研究结果产生矛盾的原因。本研究中,子代小鼠并未直接接触BPA,但仔鼠卵巢的发育依然受到了BPA的影响,并进一步证实了BPA通过影响卵巢核糖体功能扰乱卵巢正常发育。本研究结果意味着家畜使用含BPA的塑料制品可能会影响后代卵巢发育,因此在家畜养殖中避免使用含BPA塑料制品将有助于保证后代生殖健康,提高畜家畜殖效益。

• 表皮生长因子(EGF)对小鼠卵丘细胞自噬及胞吞相关蛋白表达的影响

  马睿, 王萌, 李秦, 何翃闳, 王靖雷, 崔燕, 余四九, 潘阳阳

  自噬和胞吞是细胞内重要的生理活动,可调控细胞的生长状态以应对恶劣环境的威胁。为探究表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)对小鼠(Mus musculus)卵丘细胞自噬和胞吞活动的影响,本研究使用浓度为0、50、100、150、200 ng/mL的EGF及适宜浓度(40 μg/mL)表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)抑制剂Gefitinib作用于小鼠卵丘细胞,提取细胞总RNA和总蛋白。利用qRT-PCR及Western-blot技术测定各浓度下自噬相关基因5 (autophagy related gene 5, Atg5)、Bcl-2同源结构域蛋白(Bcl-2 homologous domain protein, Beclin1)、微管相关蛋白轻链3 (microtubule-associated protein light chain 3, LC3)、小窝蛋白(caveolin, Cav) Cav1和Cav2的相对表达量,并结合免疫荧光技术对5种蛋白在细胞的表达定位进行比较分析。结果显示：Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2五种蛋白均主要在卵丘细胞质表达。经EGF处理,基因表达水平上,Atg5、LC3及Cav1相对表达量显著上升,且在150 ng/mL处最高(P<0.05),而Beclin1、Cav2相对表达量显著下降,在150和200 ng/mL处最低(P<0.05);蛋白表达水平上,Atg5、Beclin1、LC3表达量均显著升高(P<0.05),且在150~200 ng/mL处最高(P<0.05),此外LC3Ⅰ和LC3Ⅱ在200 ng/mL处最高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在100 ng/mL处最高,Cav1、Cav2蛋白在50 ng/mL处表达量均显著升高(P<0.05),而在200 ng/mL处均显著降低(P<0.05)。抑制EGFR后,基因表达水平上,Atg5、LC3和 Cav1相对表达量显著升高,而Beclin1、Cav2表达量显著降低(P<0.05),蛋白表达水平上,Atg5、Beclin1、LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Cav1表达量均显著增高(P<0.05或P<0.01),Cav2蛋白表达量显著降低(P<0.01)。研究结果表明EGF可能参与调节Atg5、Beclin1、LC3、Cav1和Cav2的表达,对小鼠卵丘细胞的自噬和胞吞活动起重要调控作用。本研究为进一步研究EGF对小鼠卵丘细胞自噬和胞吞的调控机制提供参考依据。

• 肉鸡TFEB基因的表达特征及其与脂肪细胞溶酶体数量的关系

  高卓然, 丁然, 陈耀峰, 翟祥云, 李辉, 杜志强

  转录因子EB (transcription factor EB, TFEB)在溶酶体表面被哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)磷酸化后,发生核移位进而发挥生物学功能。TFEB与溶酶体生物合成、自噬、脂类物质代谢等都有着密切关系。本研究以东北农业大学高、低脂双向选择系肉鸡(Gallus gallus)为材料,检测了TFEB基因在肉鸡腹部脂肪组织和脂肪细胞中的表达情况,进行了肉鸡脂肪细胞中TFEB蛋白的免疫荧光定位,同时观察分析了肉鸡脂肪细胞诱导分化过程中溶酶体数量的变化。结果表明,在1、4、7周龄中,TFEB在低脂肉鸡腹脂的表达量均高于在高脂肉鸡腹脂中的表达量,且在4周龄中,TFEB在两系腹脂中的表达量差异显著;TFEB在两系肉鸡原代前脂肪细胞诱导分化过程中表达呈相反的趋势,在高脂系的诱导分化过程中表达量下降,在低脂系的诱导分化过程中表达量升高,同时在爱拔益加(arbor acres, AA)肉鸡原代前脂肪细胞诱导分化过程中TFEB表达量呈下降趋势,且TFEB在诱导至72 h与0 h的表达量差异显著;TFEB蛋白在肉鸡脂肪细胞的细胞质和细胞核上均有分布,且溶酶体的数量在脂肪细胞诱导分化过程中减少。本研究结果为进一步探讨TFEB调控溶酶体生物合成,进而影响肉鸡脂肪代谢的分子机制提供了基础资料。

• 达氏鲟心型脂肪酸结合蛋白的基因克隆及表达分析

  陈叶雨, 刘亚, 赖见生, 宋明江, 龚全

  心型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid-binding proteins, FABP-3)是脂质结合蛋白超家族的成员,主要参与机体脂肪酸摄取和转运等代谢过程。为深入了解FABP-3的结构及其在达氏鲟(Acipenser dabryanus)营养代谢及免疫调控中的功能,本研究以达氏鲟3代全长转录组测序获得的unigenes序列为基础,获得FABP-3的cDNA序列,分析FABP-3基因在不同组织、饥饿胁迫及迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)侵染作用下的表达情况。结果显示,FABP-3基因cDNA全长为641 bp (GenBank No. MN064725),其中5'非编译区为89 bp,3'非编译区为150 bp,开放阅读框为402 bp,编码133个氨基酸。其三维结构由10个β-折叠和2个α-螺旋组成,包含3个保守氨基酸残基(Arg 107, Arg 127, Tyr 129),在氨基酸6~120位置之间具有保守的脂质转运蛋白结构域。FABP-3在达氏鲟各组织中广泛分布,其中,肌肉中FABP-3表达量最高,显著高于其他组织(P≤0.05)。饥饿条件下,脑、肝和胃中的FABP-3表达量呈先上升后降低的趋势;肠道和肌肉中的FABP-3表达量在饥饿过程中出现下调,且均显著低于第0天(P≤0.05)的表达水平。迟缓爱德华氏菌侵染作用下,FABP-3在鳃和脾中呈现先下降后上升的表达趋势;感染12 h后,在肠道中的表达量是对照组的219倍。本研究结果表明达氏鲟FABP-3参与机体营养代谢及免疫应答等生物学途径,为今后达氏鲟营养及免疫调控分子机制的研究提供了理论基础。

• 利用本氏烟筛选小麦叶锈菌效应蛋白

  齐悦, 张悦, 李建嫄, 杨文香, 刘大群

  小麦(Triticum aestivum)叶锈病是由小麦叶锈菌(Puccinia triticina)引起的一种气传性真菌病害,在全世界范围均有发生,严重发生可造成小麦15%~40%甚至更高的产量损失,最为安全、经济、有效的防治方法是培育和使用抗病品种,但由于小麦叶锈菌致病性频繁变异,导致小麦抗叶锈性不断丧失。探讨小麦叶锈菌致病的分子机制对于有效控制小麦叶锈病尤为重要。基于3个小麦叶锈菌单胞菌系08-5-9-2 (KHTT)、13-5-28-1 (JHKT)和13-5-72-1 (THSN)的休眠孢子、萌发夏孢子和吸器形成时期共9个样本的转录组数据,本研究利用SignalP 4.1、TargetP 1.1、TMHMM 2.0和EffectorP 2.0软件进行效应蛋白的初步筛选,获得357个候选效应蛋白;从中选取20个在小麦叶锈菌与感病材料Thatcher互作过程中表达量逐渐上调的候选效应蛋白,进一步利用本氏烟(Nicotiana benthamiana)和能够引起过敏性坏死反应的Bax和INF1对20个候选效应蛋白进行筛选,结果证实20个候选效应蛋白均为效应蛋白。本研究结果表明,异源表达系统是进行专性寄生菌效应蛋白筛选的有力工具,可为深入开展效应蛋白的致病作用研究提供参考依据。

• 泛素偶联酶Ubc-9对布鲁氏菌胞内生存及细胞凋亡的影响

  邵志然, 李启峰, 易继海, 张欢, 陈创夫, 王震

  类泛素蛋白SUMO (small ubiquitin-related modifier)偶联酶E2在生物机体中只发现一种,即泛素偶联酶9 (ubiquitin-conjugating enzyme 9, Ubc-9)。在已知的所有生物体中,Ubc-9具有高度保守性。本研究首先通过qRT-PCR技术检测布鲁氏菌(Brucella ovis) 16M侵染小鼠(Mus musculus)巨噬细胞RAW264.7不同时间的Ubc-9转录水平;然后通过慢病毒包装技术构建Ubc-9基因沉默的小鼠巨噬细胞系模型;最后利用流式细胞术分析Ubc-9基因沉默对布鲁氏菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡的影响,并检测胞内载菌量。结果表明,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞8 h,细胞内Ubc-9转录水平显著高于对照组细胞(P<0.05);经慢病毒包装系统构建的Ubc-9基因沉默的小鼠巨噬细胞中,Ubc-9基因转录被显著抑制,布鲁氏菌感染诱导的细胞凋亡率显著降低(P<0.05),胞内载菌量高于对照组(P<0.05)。本研究为深入探讨布鲁氏菌在巨噬细胞内的存活机制提供了基础资料。

• 人CD5信号肽介导犬细小病毒非结构蛋白1 (NS1)在真核细胞的分泌型表达

  王幸, 李楠, 霍珊珊, 张建楼, 张辉, 仲飞

  犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)非结构蛋白1 (nonstructural protein 1, NS1)是CPV的重要功能蛋白,参与病毒的复制和转录,同时也是宿主细胞的毒性蛋白。为探索其生物学功能,需要制备重组NS1蛋白。本研究采用人(Homo sapiens) CD5信号肽序列介导NS1蛋白在真核细胞中进行分泌表达,以制备高纯度的NS1重组蛋白。首先,根据人CD5信号肽序列(GenBank No. NM_014207.4),设计合成1对两端带有限制性内切酶位点的互补全长CD5信号肽序列(2条寡核苷酸链);然后将2个寡核苷酸链进行退火处理,生成CD5信号肽基因,进而通过酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1-NS1/H的NS1基因5'端,与NS1基因融合,构建形成与His标签融合的NS1分泌型真核表达载体pcDNA3.1-CD5-NS1/H。将该表达载体转染人胚胎肾(human embryonic kidney, HEK) 293T细胞使其表达,用Ni-NTA琼脂糖胶粒通过亲和层析法从细胞培养基中纯化重组NS1蛋白。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,纯化的NS1蛋白纯度达95%以上,并能与抗His标签抗体进行特异结合,表明所构建的表达载体可以介导NS1在真核细胞中进行分泌型表达。为提高表达水平,进一步分析载体用量、转染时间和表达时间对NS1表达的影响,初步确定NS1表达的最适条件为在T75细胞培养瓶中载体用量30 μg、转染时间5 h、表达时间48 h。本研究可为进一步探讨NS1的生物学功能提供基础资料。

• 花青素苷在植物逆境响应中的功能研究进展

  王鸿雪, 刘天宇, 庄维兵, 王忠, 朱林, 渠慎春, 翟恒华

  花青素属于类黄酮类化合物,是一类具有水溶性的天然色素。自然条件下,花青素以糖苷(花青素苷)形式存在。花青素苷的种类、含量和分布是植物花、茎、叶、果实等器官组织呈现不同色彩的重要原因。花青素苷在植物抵抗干旱、低温、盐胁迫、低氮等非生物胁迫及火疫病菌、软腐病菌、黄萎病菌等生物胁迫中也具有重要的作用。本文主要从植物花青素苷的生物合成代谢途径、花青素苷在植物响应非生物胁迫和生物胁迫中的分子作用机制两个方面进行综述,并对其今后的研究方向进行了展望,以期更好地揭示其在植物响应逆境胁迫中的分子作用机制,为培育花青素苷介导的高抗性植物提供理论依据。

• MDCK细胞悬浮培养驯化及其在增殖禽流感病毒H9亚型中的初步应用

  刘萍, 崔燕

  禽流感严重威胁养殖业和人类健康,并给国民经济带来巨大损失,目前接种禽流感疫苗是最有效的预防措施。用于禽流感疫苗制备的传统鸡胚工艺存在诸多问题,正逐步被细胞工艺所替代。为评价悬浮培养技术在生产细胞源禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)灭活疫苗的应用,本研究选取1株来源清楚的贴壁犬肾细胞(Madin-Daby canine kidney cells, MDCK),通过逐步降低血清的方法,驯化其适应悬浮条件培养。将AIV H9亚型疫苗株分别接种贴壁和悬浮MDCK细胞进行培养,将细胞源与鸡胚源病毒制备灭活疫苗,免疫无特殊病原体(specefic pathogen free, SPF)鸡(Gallus gallus),通过血清学方法评价细胞源与鸡胚源禽流感灭活疫苗的免疫效果。研究结果表明,MDCK悬浮培养48 h后的细胞密度达到3.0×106 cells/mL,培养72 h后达5.0×106 cells/mL,且细胞形态良好、活力高、单个悬浮于培养基中;进行摇瓶和7.5 L生物反应器培养的数据及细胞状态显示,该细胞株适合生物反应器悬浮培养。以悬浮MDCK细胞为基质增殖H9亚型禽流感病毒并制备灭活疫苗,免疫SPF鸡后21 d血清产生的红细胞凝集抑制(hemagglutination inhibion, HI)效价几何平均值达6(log2)以上,与鸡胚疫苗的免疫效果相当。上述实验结果提示,筛选获得的悬浮培养MDCK细胞株具有生长快和增殖稳定的特点;适用于增殖H9亚型禽流感病毒,且病毒血细胞凝集(hemagglutination, HA)效价高;制备的灭活疫苗抗体效价高、免疫原性好。本研究可为规模化生产禽流感及其他病毒类疫苗提供细胞学基础资料。