农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2021年第6期

• StSWEET16b基因在烟草中异源表达对果糖含量和晚疫病抗性的影响

  范希德, 贺苗苗, 叶广继, 王舰, 周云

  糖转运蛋白(sugars will eventually be exported transporters, SWEETs)广泛存在于真核生物中,在植物糖类的长距离转运、激素转运、花粉发育、果实形成、种子灌浆及植物-病原体互作等生理过程中发挥重要作用。为解析StSWEET16b基因在糖的转运及病原菌互作中的功能,本研究以马铃薯(Solanum tuberosum) '青薯9号'为材料,采用qRT-PCR技术分析了该基因在不同糖处理下的表达规律,结果发现,StSWEET16b在3%的蔗糖、果糖和葡萄糖分别处理下表达模式均发生变化,表明该基因在马铃薯中可能同时参与蔗糖、果糖及葡萄糖的转运。通过分析转基因烟草(Nicotiana tabacum)在不同糖培养基上的生长状况,并测定植株体内蔗糖、果糖及葡萄糖的含量发现,在葡萄糖和蔗糖培养基上,转基因烟草的长势弱于野生型植株,并且转基因植株中的蔗糖和葡萄糖含量均低于野生型,而在果糖培养基上,转基因烟草的长势明显优于野生型植株,且转基因植株中的果糖含量高于野生型(P<0.05),表明在烟草中StSWEET16b的异源表达可促进果糖的转运,同时抑制蔗糖和葡萄糖的转运。瞬时表达结果表明,StSWEET16b基因参与了本氏烟-晚疫病菌之间的互作,抑制了晚疫病菌病斑的扩展,提高了植株的抗病性。研究结果表明,StSWEET16b蛋白在果糖转运和植物-病原病菌互作过程中发挥着重要作用。本研究为马铃薯品质的改良和抗病品种的选育提供理论依据。

• 番茄成熟过程中细胞壁代谢相关基因的表达及外源乙烯和ABA处理对其表达的影响

  曾文静, 杨军, 陈世美杰, 韦小英, 文国琴, 何卓远, 王倩, 陈奚潼, 周家燕, 邹建

  果实硬度是衡量其货架期的一个重要指标,细胞壁代谢是影响果实硬度及其软化进程的重要因素。为解析番茄软化进程与细胞壁代谢基因和促成熟激素调控之间的关系,本研究通过施加外源激素及其抑制剂,并利用qRT-PCR技术系统分析了番茄(Solanum lycopersicum)成熟过程中细胞壁代谢基因的表达变化,研究了促成熟激素脱落酸(abscisic acid, ABA)和乙烯(C2H4)及其抑制剂对这些基因表达的影响。结果表明,随着果实的成熟和软化,细胞壁代谢相关基因SlCel1 (endo-β-1, 4-glucanases)、SlTBG7 (β-galactosidase precursor)、SlXETB2-F2 (xyloglucanendotransglycosylase)、SlXET4-F1、SlTBG3、SlCel2、SlExp1 (expansin)、SlTBG1、SlPG (polygalacturonase)和SlTBG4的表达量增加,说明这些细胞壁代谢基因与番茄成熟过程中的软化进程密切相关。外源ABA和乙烯及其抑制剂NDGA (nordihydroguaiaretic acid)或1-MCP (1-methylcyclopropene)处理的结果显示,ABA处理促使SlCel1、SlExp1、SlTBG3、SlTBG4和SlXET4-F1基因表达上调,而SlCel1、SlExp1和SlTBG4基因受到NDGA抑制。另外,施加乙烯能使SlExp1、SlPG和SlTBG4基因表达量增加,其表达受1-MCP抑制。上述结果说明SlCel1、SlExp1、SlTBG3、SlTBG4、SlPG和SlXET4-F1等细胞壁代谢基因参与果实成熟过程中的软化进程,其表达可能受ABA和乙烯的调控。因此,合理施用NDGA或1-MCP有助于抑制细胞壁代谢,延长果实的货架期。而果实成熟过程中SlPG、SlCel1、SlExp1和SlTBG4基因低水平表达的番茄新品种的培育可能成为番茄采后保鲜、保持果实良好品质的新途径,这对实现番茄果实的成熟调控有指导意义。

• 海岛棉GbHCT13基因的克隆及表达特性分析

  滕露, 郑凯, 曲延英, 雷慧辰, 蔡永生, 陈全家

  植物木质素合成途径关键酶之一的莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(shikimate quinate hydroxycinnamoyl transferase, HCT)影响棉花(Gossypium spp.)纤维的品质,研究GbHCT13在棉纤维发育中的表达特性,可为今后探究棉花纤维品质发育机理提供参考。本研究利用PCR技术,从海岛棉(Gossypium barbadense)'新海21号'10 d的纤维中克隆了一个参与木质素代谢相关的HCT基因,命名为GbHCT13,并对其序列进行生物信息学分析;利用qRT-PCR技术,分别在海岛棉和陆地棉(Gossypium hirsutum)中对其表达模式和特性进行了分析;通过棉花胚珠离体培养实验,探究了咖啡酰辅酶A对纤维发育的影响。结果表明,GbHCT13基因(GenBank No. MW048849)位于海岛棉D组10号染色体上,全长1 400 bp,CDS全长1 311 bp,预测该基因编码的蛋白属于亲水性非膜蛋白,由1~432个氨基酸组成结构域。与其他物种蛋白多序列比对发现,GbHCT13的氨基酸序列包含1个BAHD酰基转移酶家族的HXXXD和DFGWG区域,进化上与亚洲棉(Gossypium arboreum)和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示该基因在不同海岛棉品种中的表达趋势类似,均在纤维发育前期5~15 d呈现较高表达量,尤其是在纤维发育的第10 d表达量最高。胚珠离体培养表明,一定浓度的咖啡酰辅酶A对纤维伸长生长具有促进作用,并促进GbHCT13基因表达。本研究为进一步探究海岛棉GbHCT13基因在纤维发育中的功能提供基础,也为今后研究GbHCT13基因参与纤维中木质素合成的分子机制提供理论依据。

• 毛竹NCED基因家族的全基因组鉴定及表达分析

  徐胤, 胡秋涛, 侯丹, 鲁海雯, 林新春

  9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)是脱落酸(abscisic acid, ABA)生物合成途径中的关键限速酶。本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)为材料,利用生物信息学方法,从毛竹全基因组中鉴定出10条具有完整RPE65保守结构域的NCED基因,这些基因编码的蛋白长度为240~654 aa,分子量为28.03~70.04 kD;系统进化分析表明,10个毛竹NCED基因可分为2个亚家族,且大部分毛竹NCED基因(除外PH02Gene49300和PH02Gene41427)与水稻(Oryza sativa) NCED的亲缘关系较近;顺式作用元件预测分析显示,NCED基因启动子中含有大量非生物胁迫响应元件,推测NCED基因可能在毛竹抗逆反应中发挥重要作用;转录组数据分析显示,NCED在毛竹不同组织与发育阶段中的表达具有特异性,尤其在毛竹根和笋中显著性高表达(P<0.05);qRT-PCR结果显示,毛竹NCED家族成员在脱落酸、水杨酸、干旱和盐胁迫处理后具有不同的表达水平,提示NCED家族成员在参与毛竹非生物胁迫与不同激素调控通路时可能发挥不同的作用。本研究为深入揭示毛竹NCED基因家族功能提供基础资料。

• 猪体细胞克隆胚胎早期发育中H3K64ac动态变化模式

  张丹丹, 许腾腾, 高迪, 宁伟, 齐昕, 汝振远, 张翔栋, 李运生, 张运海, 曹祖兵

  组蛋白乙酰化修饰是一种最先被确定的、广泛参与调控哺乳动物早期胚胎发育的转录后修饰。组蛋白H3上赖氨酸第64位乙酰化(H3K64ac)是组蛋白八聚体侧表面的、一种先前未被鉴定出来的组蛋白修饰,已知其可参与调控核小体的稳定性和促进体内基因的表达。目前关于H3K64ac在猪(Sus scrofa domesticus)体细胞核移植胚胎早期发育过程中的作用尚未知。本研究利用免疫荧光染色技术,检测孤雌激活(parthenogenetic activation, PA)胚胎和体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)胚胎各发育阶段的H3K64ac水平,再分别使用阿非迪霉素、鹅膏蕈碱和放线菌酮处理PA4-细胞胚胎。结果表明,H3K64ac在PA和SCNT胚胎中均存在,且H3K64ac水平在原核期最高,2-细胞期降低,4-细胞期略有回升,8-细胞至囊胚期H3K64ac处于低水平状态;比较两种类型胚胎的H3K64ac水平发现,各阶段SCNT胚胎的H3K64ac水平均显著高于PA胚胎(P<0.05);抑制DNA复制、RNA和蛋白质合成没有影响胚胎内H3K64ac水平。结果提示,猪SCNT胚胎早期发育中H3K64ac发生异常的重编程,且猪早期胚胎发育中H3K64ac水平的降低是不依赖于DNA复制、RNA和蛋白质合成的主动反应过程。本研究为进一步探究H3K64ac参与调控猪体细胞核移植胚胎发育过程中分子机制研究提供理论依据。

• ssc-miR-204靶向调控猪小肠上皮细胞中DLG5基因的表达

  王伟, 谢开会, 雒瑞瑞, 高小莉, 王鹏飞, 张娟丽, 杨姣姣, 张博, 马艳萍, 滚双宝

  ssc-miR-204在仔猪(Sus scrofa)感染C型产气荚膜梭菌耐受和易感组中显著差异表达,本研究旨在验证miR-204和Discs大同源物5 (discs large homolog 5, DLG5)基因之间的靶向调控关系。利用TargetScan软件预测miR-204与DLG5基因之间的靶向结合位点及保守性;构建DLG5基因3'UTR区野生型及突变型pmirGLO双荧光素酶报告载体,通过荧光素酶活性检测miR-204与DLG5基因之间的靶向关系;进一步在猪小肠上皮细胞(intestine porcine epithelial cells, IPEC-J2)中转染miR-204 mimic和inhibitor,通过qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光实验,检测miR-204对DLG5表达的调控。结果表明,miR-204成熟体种子区序列与DLG5基因3'UTR第1 333~1 339位核苷酸序列互补配对,并且在多个物种之间高度保守。通过双酶切和测序鉴定,本研究成功构建pmirGLO-DLG5-3'UTR双荧光素酶报告基因重组载体;荧光素酶活性检测结果显示,miR-204 mimic可以极显著降低DLG5基因的荧光素酶活性(P<0.01),二者具有靶标关系。qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光结果显示,转染miR-204 mimic后,可以极显著抑制DLG5的表达水平(P<0.01);相反,转染miR-204 inhibitor后,DLG5被显著或极显著上调表达(P<0.05或P<0.01)。miR-204可以靶向结合DLG5基因,miR-204对DLG5的表达具有负调控作用,本研究结果可为进一步在细胞水平验证miR-204和DLG5基因功能提供基础,为miRNAs参与调控C型产气荚膜梭菌性仔猪腹泻提供依据。

• 白藜芦醇和miR-222协同调控猪卵巢颗粒细胞凋亡

  章会斌, 周忍, 许黎明, 陈一歌, 张鹏, 杨明月, 杨敏, 丁月云, 殷宗俊, 张晓东

  卵巢颗粒细胞凋亡影响动物卵泡发育及排卵过程,白藜芦醇在卵巢颗粒细胞凋亡过程中发挥重要作用。本研究旨在解析白藜芦醇介导miR-222调控猪卵巢颗粒细胞(porcine ovarian granulosa cells, pGCs)凋亡的机制,为白藜芦醇在养猪生产中的应用提供理论支持。实验以不同浓度的白藜芦醇(0~100 μmol/L)处理分离培养获得的原代pGCs,在倒置显微镜下观察pGCs形态变化,借助流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期分布,利用qRT-PCR检测细胞周期相关基因CyclinD、CyclinB、p21及miR-222的表达变化;并检测miR-222过表达状态下pGCs凋亡的变化。结果显示当白藜芦醇浓度达到100 μmol/L时,pGCs的形态发生改变,细胞增殖率显著下降,细胞周期进程被阻碍;miR-222的表达水平随白藜芦醇浓度的增加呈先下降后上升的趋势,75 μmol/L时为拐点(表达量最低);在75 μmol/L白藜芦醇处理的pGCs中过表达miR-222,pGCs凋亡率显著下降。以上结果表明白藜芦醇(100 μmol/L以下)可抑制pGCs增殖,并以浓度依赖的方式调控细胞中miR-222的表达;且在75 μmol/L白藜芦醇处理的pGCs中过表达miR-222,可降低细胞凋亡率。本研究结果为白藜芦醇协同miRNA调控pGCs的生物学功能提供了参考数据。

• 从江香猪AR在附睾组织发育过程中的表达模式

  蒙利洁, 王维勇, 徐永健, 李子清, 万素芳, 牟琪, 杨艺, 龚婷

  附睾是精子运输、成熟和储存的主要场所,其结构、功能及基因表达高度依赖雄激素/雄激素受体(androgen receptor, AR)调控。AR在多种动物附睾高表达,调控附睾上皮和管腔液的功能,对于精子成熟具有重要意义。为探究AR在出生后从江香猪(Sus scrofa)附睾中的表达特征,本研究利用qRT-PCR、免疫组化和Western blot技术检测AR在从江香猪初情期前(15 d)、初情期(30 d)、初情期后(60 d)和性成熟期(180 d)四个关键时期附睾组织的表达变化。qRT-PCR结果显示,AR基因在15、30、60和180 d从江香猪附睾组织均有表达,且伴随日龄的增加而增高,在180 d表达最高;在不同区段中,AR基因在Ⅳ区(附睾尾)表达最高、Ⅰ区(附睾头)表达量最少(P<0.05);除Ⅰ区与Ⅲ区(附睾体)表达差异不显著外,其余区段间均呈显著差异(P<0.05)。Western blot结果显示,AR在不同日龄及附睾5个区段中的蛋白表达丰度与mRNA水平呈现一致的变化趋势。免疫组化染色也呈现一致的变化趋势,AR主要定位于附睾上皮细胞的细胞核及精子上,并呈现附睾区段差异表达模式。总之,本研究发现AR的表达从15 d增强至60 d,并维持高表达至180 d,主要分布于附睾上皮细胞的细胞核和精子,表明附睾AR表达呈阶段特异性和区段特异性;此外,AR在180 d的高表达可能与该时期附睾内存在大量精子有关。本研究为深入探讨从江香猪附睾内精子成熟机制提供参考依据。

• miR-133a对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

  李燕, 杨旭, 陈明明, 郭宏, 丁向彬, 刘新峰

  miR-133a是骨骼肌和心肌特异性表达的microRNA (miRNA),对牛(Bos taurus)骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle-derived satellite cells, MDSCs)增殖分化有何作用尚不明确。为深入了解miR-133a对牛MDSCs增殖分化的影响、丰富牛肌肉生长发育的分子机制,本研究利用已建立的牛MDSCs体外诱导分化模型,采用qRT-PCR方法检测miR-133a和肌细胞分化标记因子—肌生成素(myogenin, MyoG)、成肌分化因子(myogenic differentiation, MyoD)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MHC)在牛MDSCs中的时序表达谱;利用miR-133a的mimic和inhibitor转染牛MDSCs,构建过表达或抑制miR-133a的牛MDSCs模型,采用增殖细胞的5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine, EdU)染色方法,检测过表达或抑制miR-133a对牛MDSCs增殖的影响,利用qRT-PCR、Western blot及免疫荧光技术检测MyoG、MyoD及MHC基因及其蛋白的表达水平。结果显示,miR-133a在牛MDSCs分化阶段的表达量显著上升(P<0.01);过表达miR-133a后,增殖细胞占比显著下降(P<0.01),肌细胞分化标记因子MyoG (P<0.05)和MHC (P<0.01)的基因表达量显著升高,MHC蛋白表达显著升高(P<0.01)且融合肌管数量增多;抑制miR-133a表达后,增殖细胞占比显著上升(P<0.01),肌细胞分化标记因子MyoG (P<0.01)、MyoD (P<0.05)及MHC (P<0.01)的基因表达量显著下降,MHC蛋白表达量显著下降(P<0.01)且融合肌管数量也显著减少。以上研究结果表明,miR-133a抑制牛MDSCs的增殖、促进牛MDSCs的分化。本研究丰富了牛肌肉生长发育的分子遗传研究内容,为进一步开展miRNA调控动物肌肉生长发育的功能研究提供了重要参考。

• 西藏牛与三江牛心脏组织低氧适应相关circRNA分析

  白佳灵, 王会, 钟金城, 陈智华, 柴志欣, 王吉坤, 王嘉博, 武志娟, 信金伟

  环状RNA (circle RNA, circRNA)是一种共价封闭的内源性生物分子,在高原动物低氧适应性中具有重要作用。高通量测序技术以成本低、通量高与速度快等优势,在哺乳动物与人类疾病研究中广泛应用,然而目前对西藏牛(Bos taurus)高原适应性相关circRNA的研究鲜有报道。本研究以西藏牛和三江牛为对象,选择对高原低氧环境敏感的心脏组织,使用Illumina HiSeqTM 4000平台对西藏牛与三江牛心脏组织circRNA进行测序,对其差异表达谱进行分析,并预测circRNA-miRNA-mRNA之间的靶向关系,构建circRNA-miRNA-mRNA可视化调控网络。在西藏牛和三江牛的6个样本中,共筛选得到差异表达circRNA 283个,其中显著上调的278个,显著下调的5个;GO功能富集分析显示,其来源基因被注释到45个功能条目;KEGG信号通路(pathway)功能富集分析表明,其来源基因主要显著富集在泛素介导的蛋白水解通路和cGMP-PKG信号通路等通路;novel_circ_018959与miR-142-x、miR-144-y、miR-1908-x、miR-2302-y、miR-1273-y等miRNA存在靶向关系,而这些miRNA的靶基因中包括ECE1、NFATC1、CAST、COX7C等低氧适应性候选基因,推测novel_circ_018959很可能参与西藏牛低氧适应性调控,其具体功能及调控机制有待进一步研究。本研究结果为深入揭示circRNA在西藏牛高原低氧适应过程中的分子机制提供了基础数据支持。

• 日粮中β-胡萝卜素水平对牦牛肠道BCMO1和BCDO2基因及相关代谢调控因子表达的影响及相关性分析

  任晓莹, 王树林

  具有黄色体脂的牦牛(Bos grunniens)表现出对类胡萝卜素明显的富集能力。β-胡萝卜素(β-carotene, β-C)为类胡萝卜素的一种,在牦牛类胡萝卜素代谢过程中发挥重要作用。本研究选取15头2~3岁牦牛为研究对象,随机分为5组：对照组饲喂基础日粮;实验组包括低、中、高剂量组,在基础日粮中添加β-C的量分别为720、1 440、1 620 mg/d;阳性对照添加β-C的量为3 440 mg/d。饲养90 d后,利用qRT-PCR分析肠道组织类胡萝卜素相关调控基因—β-胡萝卜素-15,15'-单加氧酶(β-carotene-15,15'-monooxygenase, BCMO1)和β-胡萝卜素-9',10'-双加氧脱氢酶(β-carotene-9',10'-dioxygenase, BCDO2)以及4个相关代谢调控因子基因—肠道特异同源框(intestine specific homeobox, ISX)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)、B类Ⅰ型清道夫受体(scavenger receptor class B typeⅠ, SR-B1)及视黄酸受体(retionic acid receptor, RAR)的表达差异;采用Pearson法对上述基因间的表达进行相关性分析。结果显示,在十二指肠中,中剂量组BCMO1表达量显著高于其余剂量组,低、中、高添加量对BCDO2表达无显著影响,低剂量β-C添加更有利于ISX表达,BCDO2与PPARγ、SR-B1间存在显著正相关。在空肠中,低、中剂量组BCMO1表达显著高于其余组,除阳性对照组外BCDO2表达基本不受添加量的影响,BCDO2与ISX、PPARγ、RAR之间存在显著正相关。在回肠中,BCMO1和BCDO2表达变化趋势较平缓,中剂量组有利于BCMO1和BCDO2表达;4个代谢调控因子的表达变化趋势不一,低剂量有利于ISX表达,中剂量有利于SR-B1表达;BCMO1与PPARγ、SR-B1之间存在显著正相关。在盲肠中,BCMO1和BCDO2表达基本不受添加量影响。在结肠中,随添加量的增加BCMO1表达下降;除阳性对照组外,BCDO2表达量不受添加量影响;ISX和RAR表达量都在低剂量组呈现最大值。本研究揭示了日粮β-C添加对牦牛肠道BCMO1和BCDO2及相关代谢调控因子基因表达的影响,为反刍动物体内类胡萝卜素代谢机制研究、牦牛的科学补饲以及优质牦牛肉生产提供基础资料。

• LEPR基因InDel检测及其与同羊尾脂和生长性状关联分析

  易晓华, 刘世荣, 张宇, 潘赟, 袁婷婷, 孙秀柱

  同羊是我国著名的肉毛兼用脂尾半细毛地方绵羊(Ovis aries)品种,脂肪组织是储存能量、为机体供应能量的器官,可分泌瘦素(leptin, LEP)、瘦素受体(leptin receptor, LEPR)和炎症因子等。脂肪细胞因子信号通路(adipocytokine)中LEP和LEPR基因可以协同调节脂肪沉积和能量代谢。本研究为了验证LEPR基因的插入/缺失 (insertion/deletion, InDels)变异,对同羊尾脂性状及生长性状的影响,通过Ensemble数据库筛选LEPR基因的InDel (插入/缺失)位点,根据数据库中筛选的InDels位点所在的序列设计引物,鉴定并分析了166只同羊健康个体。关联分析表明：LEPR基因17 bp InDel多态位点对同羊尾宽与尾长性状的影响均不显著(P>0.05),说明该位点对尾脂性状影响较小;该位点DD基因型公羊的胸深相对于ID基因型是显著升高的(P>0.05),在公羊体高、背高和荐高等生长性状上,DD基因型显著高于II基因型(P<0.05),该InDel位点II基因型母羊腰角宽显著高于DD基因型(P<0.05),表明该位点对部分生长性状有显著影响。以上结果为LEPR基因在同羊尾型的选育以及同羊的选种选育提供了理论依据,为同羊遗传育种改良提供重要参考。

• 山羊IGF1基因过表达载体构建及其对子宫上皮细胞的影响

  唐文, 陈祥, 洪磊, 周志楠, 杨沛方

  胰岛素样生长因子1 (insulin like growth factor 1, IGF1)是一类单链多肽类激素,在动物机体内可促进胚胎的发育和细胞增殖分化,对提升动物繁殖性能有重要作用。饲喂0.07% N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)可提高努比亚山羊(Capra hircus)(Nubian ibex)的产羔率且效果最好,并在山羊子宫角进行转录组测序的基础上筛选出差异显著基因IGF1,采集了努比亚山羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢组织并提取RNA,运用qRT-PCR对其转录组测序结果进行验证。同时克隆努比亚山羊IGF1基因CDS区,进行生物信息学分析;构建IGF1基因真核表达载体,转染至子宫上皮细胞,qRT-PCR检测努比亚山羊繁殖性状相关基因同源框基因A10 (homeobox A10, HOXA10)、白血病抑制因子(interleukin 6 family cytokine, LIF)、趋化因子14 (C-X-C motif chemokine ligand 14, CXCL14)的表达水平。结果表明：IGF1基因在被检测的5个组织中均有表达,实验组子宫、输卵管、下丘脑、卵巢中的表达量极显著高于空白组(P<0.01)。克隆所得努比亚山羊IGF1基因CDS区为471 bp,编码153个氨基酸;蛋白预测结果显示：努比亚山羊IGF1蛋白的分子式为C739H1178N212O215S15,相对分子质量为16.953 67 kD,等电点为9.36。遗传进化树分析表明,努比亚山羊IGF1基因与绵羊(Ovis aries)的遗传距离最近;qRT-PCR结果显示,转染重组质粒成功组细胞IGF1基因mRNA的表达水平极显著高于空白对照组细胞(P<0.01),转染重组质粒成功组细胞HOXA10、LIF、CXCL14基因的mRNA表达水平均显著高于空白对照组(P<0.05)。说明超表达IGF1基因可促进产羔相关基因HOXA10、LIF、CXCL14基因的表达。本研究成功构建pEGFP-N3-IGF1真核表达载体,检测IGF1基因对努比亚山羊繁殖相关基因的表达影响,为进一步研究IGF1基因对努比亚山羊繁殖性状的影响提供基础资料。

• 鸡Ash2l基因携带Flag标签的真核融合表达载体构建及表达分析

  张晨, 左其生, 邹艺琛, 赵娟娟, 张亚妮, 李碧春

  类ASH2蛋白(absent, small, or homeotic-like, ASH2L)是重要的组蛋白甲基化修饰酶,参与多种细胞发育过程。但其在雄性生殖细胞发生过程中的功能和分子机制尚不清晰。本研究旨在研究Ash2l在鸡(Gallus gallus)雄性生殖干细胞形成中的表达规律并构建Ash2l真核融合表达载体,利用NCBI保守结构域分析、UniPort、TMHMM Server v. 2.0和SignalP在线网站分析ASH2L的保守结构域、亲疏水性、跨膜结构域和信号肽表达。收集18.5 d鸡(Gallus gallus)胚不同组织和不同阶段的鸡细胞胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)、原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)、精原干细胞(spermatogonial stem cell, SSC)和鸡成纤维细胞(chicken embryonic fibroblast, CEF),qRT-PCR检测Ash2l的表达;双酶切和测序对重组载体pcDNA3.1-Ash2l-Flag进行鉴定;利用qRT-PCR和Western blot检测重组蛋白在PGC中的表达;通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)验证重组蛋白和互作蛋白的结合。结果显示,ASH2L蛋白含有2个保守结构域,SPRY (SPIa and ryanodine receptor, SPRY)-Ash2和PHD (plant homeodomain)-ash2p-like具有组蛋白甲基化酶特征结构域;其亲水性高、不含跨膜结构域且无信号肽表达。qRT-PCR检测结果发现,Ash2l在睾丸中表达最高,极显著高于其他组织(P<0.01),在PGC中表达极显著高于其他细胞(P<0.01)。双酶切结果表明,Ash2l正确插入pcDNA3.1载体,未发生移码和突变。qRT-PCR结果表明,PGC中重组载体可过量表达Ash2l基因;Western blot结果显示,PGC中成功表达重组蛋白。Co-IP结果发现,重组蛋白可与互作蛋白Dpy30组蛋白甲基化酶复合体调节亚基(Dpy-30 histone methyltransferase complex regulatory subunit, DPY30)和WD重复域5 (WD repeat containing protein 5, WDR5)结合,形成复合体。本研究结果为探明Ash2l在鸡雄性生殖细胞形成中的功能和机制研究提供参考依据和技术手段。

• 乌蒙乌骨鸡雌激素受体α (ESR1)与β (ESR2)基因多态性及其与蛋品质关联分析

  李未博, 郭徵力, 张勇, 王天松, 曾姗姗, 欧茂均, 张习本, 叶红英, 陈泽林, 张林达, 张建英, 李霞

  乌蒙乌骨鸡(Gallus gallus)是贵州省毕节地区畜牧科学研究所多年选育后形成的地方鸡种,该鸡种所产鸡蛋富含多种微量元素,具有较高的营养价值。雌激素受体(estrogen receptor, ESR)基因对畜禽繁殖性状具有重要的影响。为探究乌蒙乌骨鸡雌激素受体α (ESR1)与β (ESR2)基因SNP对其蛋品质的影响,以乌蒙乌骨鸡白壳蛋鸡与绿壳蛋鸡2个品系为材料,采用PCR产物直接测序法对ESR1、ESR2基因进行SNPs筛查,并与蛋品质进行关联分析。结果显示,在ESR1基因并未发现SNPs位点;在ESR2基因第8外显子及其附近内含子区域发现4个SNPs位点,分别为第7内含子的g.53223010 A>T突变、g.53223142 G>A突变,第8外显子的g.53223338 C>T突变,引起苏氨酸变为甲硫氨酸,属于错义突变,以及第8内含子的g.53223404 G>A突变。白壳蛋鸡的g.53223338 C>T突变为低度多态,其余位点均为中度多态,所有位点均未偏离Hardy-Weinberg平衡。连锁不平衡分析结果发现,两品系鸡ESR2基因SNPs位点g.53223010 A>T与g.53223404 G>A之间完全连锁平衡;SNPs位点g.53223142 G>A与g.53223404 G>A和g.53223010 A>T间在白壳蛋鸡存在连锁不平衡,而在绿壳蛋鸡不存在连锁不平衡。其余各位点间均不存在连锁不平衡。两品系均检测到相同的5种单倍型,白壳蛋鸡检测到8种双倍型,绿壳蛋鸡检测到11种双倍型。蛋品质关联分析结果表明,SNPs位点g.53223010 A>T和g.53223404 G>A、g.53223338 C>T可能分别是影响白壳蛋鸡蛋形指数、蛋黄相对质量的标记位点,SNPs位点g.53223142 G>A可能是影响绿壳蛋鸡蛋黄重的标记位点。白壳蛋鸡H5H5和H1H4双倍型分别在蛋形指数和蛋壳厚度上有显著优势(P<0.05),绿壳蛋鸡H3H4双倍型在蛋黄重上有显著优势(P<0.05),其他双倍型在某一蛋品质指标上有显著优势时该双倍型在另一指标上表现显著劣势,但均可作为影响蛋品质的潜在遗传标记。本研究为乌蒙乌骨鸡分子育种提供新的遗传标记。

• 瓯江高体鳑鲏线粒体基因组测序及结构特征分析

  刘凯, 冯晓宇, 吴燕琴, 储忝江, 谢楠

  高体鳑鲏(Rhodeus ocellatus)色彩艳丽、体型优美,是一种很有市场前景的观赏鱼。对高体鳑鲏线粒体基因组(mitochondrial genome, mtGenome)进行测序和分析、探讨不同地理群体高体鳑鲏的mtGenome差异以及高体鳑鲏在鱊亚科的系统发育地位,有利于高体鳑鲏的系统发育研究。本研究通过PCR扩增、测序、软件拼接等方法获得瓯江高体鳑鲏mtGenome (GenBank No. MW007386),长度为16 675 bp,碱基组成为A (28.98%)、G (17.09%)、C (26.51%)和T (27.42%),包含13个蛋白编码基因(protein-coding genes, PCGs)、22个tRNAs和2个rRNAs。瓯江高体鳑鲏mtGenome与PCGs的(A+T)含量分别为56.41%和56.27%,均具有明显的AT偏好性。在22个tRNAs中,除tRNA-Ser(AGY)外均可形成典型的三叶草结构。基于BLAST的比较表明,瓯江高体鳑鲏与东江高体鳑鲏的序列一致性为83.84%,与日本高体鳑鲏的序列一致性为95.07%,与GenBank No. DQ026430的高体鳑鲏序列一致性为93.11%,与图们江兴凯鱊(Acanthorhodeus chankaensis)序列一致性为99.03%,与黑龙江兴凯鱊序列一致性为83.72%,与沅江兴凯鱊序列一致性为83.84%。另外,瓯江高体鳑鲏与图们江兴凯鱊之间的遗传距离最近,与日本高体鳑鲏遗传距离次之,与东江高体鳑鲏则较远。基于25种隶属于3个属的鱊亚科鱼类mtGenome构建的系统进化树分析表明,瓯江高体鳑鲏与图们江兴凯鱊亲缘关系较近,而与东江高体鳑鲏亲缘关系较远。本研究为瓯江高体鳑鲏的遗传多样性保护与育种提供了参考依据。

• 与毛纤维性状相关的角蛋白相关蛋白研究进展

  和东迁, 陶金忠, 陈丽尧, 王俊奎

  羊毛纤维是绵羊重要的经济产物之一,羊毛市场的开拓激发人们对羊毛不同性状的需求。角蛋白相关蛋白(keratin-associated proteins, KAPs)基因KRTAPs、角蛋白中间丝(keratin intermediate filaments, KIFs)基因及其各自的变异基因是鉴定羊毛纤维差异遗传基础的候选基因。利用人类或山羊等其他哺乳动物角蛋白的同源基因对绵羊基因组的鉴定,可挖掘新的潜在的功能性KRTAPs或KIFs基因。本文介绍毛囊的形态学结构,回顾角蛋白相关蛋白基因的发展,并对KAP蛋白的在毛囊中的表达与定位进行了描述,最后总结了KRTAPs基因的多态性对羊毛性状的影响。本文为绵羊毛囊生长发育和毛纤维性状的分子选育提供理论依据。

• xCas9及SpCas9-NG切刻突变体的构建及活性评价

  张宁, 秦怀远, 辛京京, 赵金山, 包汉勋, 李和刚

  通常使用的CRISPR/Cas9系统仅能识别靶标序列为NGG的原间隔序列临近基序(protospacer adjacent motif, PAM),而进化的xCas9、SpCas9-NG系统可识别序列为NG的PAM,扩大了靶标的识别范围,但脱靶效应却一直阻碍CRISPR/Cas9系统的发展,而双切刻系统会增加DNA的靶向特异性。为了提高PAM为NG的CRISPR/Cas9系统基因编辑的特异性,本研究设计并构建xCas9-D10A、SpCas9-NG-D10A、xCas9-H840A、SpCas9-NG-H840A四个切刻突变体以及相应的单链向导RNA (single guide RNA, sgRNA)表达载体,与双荧光素酶报告基因载体SSA-DKK2、SSA-DKK1构成特定的组合,共转染绵羊(Ovis aries)成纤维细胞,通过双荧光素酶活性检测的方式来验证DNA切割效率。结果表明,SpCas9-NG-D10A、SpCas9-NG-H840A突变体针对多数靶标载体其报告基因活性显著大于对照组(P<0.05),xCas9-H840A突变体完全没有活性,而xCas9-D10A仅在DKK1基因中表现出切割活性。相对而言,SpCas9-NG-D10A突变体活性稳定,切割DNA单链效率较高,故此载体可用于进一步的研究应用。本研究结果对于PAM为NG的CRISPR/Cas9双切刻系统的进一步研究及应用提供了重要的参考数据。

• 草莓枯萎病和炭疽病的双重LAMP快速病原鉴定

  史芳芳, 王雷

  枯萎病和炭疽病是草莓(Fragaria ananassa)最为常见的主要病害,病原分别为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和炭疽菌(Colletotrichum spp.),目前的检测手段主要采用传统的病原菌培养法和常规PCR法,而环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术可用于草莓枯萎病和炭疽病的病原菌快速检测。本研究针对尖孢镰刀菌rDNA间隔区(intergenic spacer, IGS)的保守区域设计了1套LAMP扩增引物,并设计了炭疽菌内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)特异序列的LAMP引物,利用LAMP技术快速、准确地将草莓尖孢镰刀菌和炭疽菌进行分辨和检测。结果表明,建立的LAMP法能够特异性检测尖孢镰刀菌和炭疽菌,检测灵敏度为10×10-5 ng/μL,是普通PCR检测灵敏度的1 000倍。本研究建立的草莓枯萎病和炭疽病快速LAMP检测方法具有灵敏度高、快速及简便的优点,是可以向基层单位推广的检测手段,对于草莓病原菌实时监测和前期预警具有重要作用。

• 基于专利计量的转基因作物国际研发态势分析

  吴晓燕, 陈方, 丁陈君, 张娴, 朱月仙

  转基因作物(genetically modified crops, GMC)以其优良的性状和品质带来巨大的农业、社会经济和环境效益,被认为是缓解全球粮食危机的重要途径之一。本文基于incoPat数据库收录的专利数据,对转基因作物的专利研发情况进行分析。结合定量分析和定性研究,探讨转基因作物的全球专利研究态势、技术研发热点、主要国家的科研水平、重要专利申请人的研发布局。研究表明,近二十年,转基因作物专利数量不断增长,转基因大豆和转基因玉米是研发重点;美国是最主要的技术来源国,主导转基因作物专利研发;孟山都、先锋种业、斯泰种业、先正达是最主要的专利申请人,重点关注多种性状组合的转基因作物种质资源创制;中国研究者较多关注重要农艺性状基因挖掘。最后,本研究提出整合优势资源,抢占市场先机;促进院企合作,加速产业化进程;重视专利布局,完善防御体系的发展建议。本研究展现了转基因作物全球专利研发的全景图,为转基因作物领域研发布局和创新决策提供参考。