农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2019年第10期

• 小麦TaWTG1的原核表达、纯化及去泛素化酶活性分析

  张文静, 陈海超, 郭利建, 刘香利, 赵惠贤

  去泛素化酶是泛素化途径的逆调节酶,参与调控蛋白质的降解。为了探索小麦(Triticum aestivum)去泛素化酶家族成员WTG1 (wide and thick grain 1)基因的功能,本研究利用生物信息学方法对小麦TaWTG1编码蛋白的理化性质和结构进行了分析;进一步构建其原核表达载体pET28a-TaWTG1,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌株BL21(DE3),对重组蛋白His-TaWTG1诱导表达条件(包括培养温度, 异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)浓度和诱导时间)进行优化;进一步对重组蛋白进行可溶性分析和镍柱分离纯化,并对其去泛素化活性进行体外验证。结果表明,TaWTG1蛋白由319个氨基酸组成,理论分子量为35.38 kD,等电点为4.62;其三级结构主要由α螺旋构成,含有OTU (ovarian tumor-related proteases)相关蛋白酶家族的otubain保守结构域;重组蛋白His-TaWTG1的最佳诱导表达条件为0.4 mmol/L IPTG、28 ℃诱导6 h;该重组蛋白主要以可溶形式存在于上清液中。Western blot分析确定用镍柱分离纯化获得的重组蛋白为目的蛋白;体外活性分析实验表明,TaWTG1具有去泛素化酶活性,可以切割赖氨酸(K)48和K63连接的四聚泛素链。本研究为TaWTG1基因功能研究提供了基础资料。

• 玉米大斑病菌转录因子StMR1的结构特征及其表达模式分析

  贾慧, 张泽雪, 刘宁, 孟庆江, 曹志艳, 董金皋

  黑色素作为重要的致病因子直接影响植物病原真菌的侵染能力,而黑色素调控因子(melanin regulation factor, MR)在黑色素生物合成中发挥着重要作用。本研究通过比对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)基因组序列,鉴定并克隆得到调控黑色素合成的转录因子基因Stmr1 (GenBank No. NW007359937)。该基因全长3 282 bp,含有3个内含子和4个外显子,编码1 021个氨基酸,编码蛋白StMR1含有2个Cys2His2锌指基序和1个Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白基序,氨基酸序列分析发现,其与甘蓝链格孢(Alternaria brassicicola)和玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)的MR转录因子相似性最高。自激活活性检测表明,StMR1具有较高的转录激活活性,进一步荧光定位表明,该蛋白在细胞核中表达。qRT-PCR检测Stmr1基因在病菌分生孢子萌发到穿透过程的5个时期的相对表达量,结果显示,其表达水平具有明显差异且在侵入钉时期表达量明显上调(P<0.05),推测其参与病菌侵染及菌丝的扩展。本研究结果为深入探究玉米大斑病菌黑色素合成及StMR1转录因子在病菌侵染中的调控机制提供理论依据。

• GWAS结合共表达网络分析挖掘影响油菜种子硫苷积累的作用位点

  刘蔚, 姚敏, 康郁, 王美, 解盼, 何昕, 刘忠松, 官春云, 钱伟, 华玮, 钱论文

  降低菜籽油中硫苷(glucosinolate, GSL)的含量对菜籽油品质改良具有重要意义。本研究以203份中国半冬性油菜(Brassica napus)自交系为材料,利用芸薹属60K SNP芯片对油菜种子硫苷含量进行全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS),共检测到20个与硫苷含量显著关联的SNP位点,分别位于A02、A03、A09、C03、C08、C09染色体上。对这些显著关联的SNP位点侧翼序列进行连锁不平衡分析,检测到C03染色体上的单体型区域(57830409~58283210 bp; r2=0.96)与硫苷含量显著关联。在这个单体型区域检测到了一个拟南芥(Arabidopsis thaliana)的直系同源基因支链氨基转移酶4 (branched-chain aminotransferase 4, BCAT4),涉及硫苷的合成。同时,利用50个重测序材料对这个单体型区域进行了进一步的区域关联分析,揭示BnBCAT4-C03 (BnaC03g68450D)基因区域单体型结构变异影响了硫苷的积累。结合基因共表达网络分析结果,表明BnBCAT4-C03与其他硫苷合成的重要基因形成了分子网络,调节硫苷的合成与积累。本研究结果有助于开发单体型功能标记,为极端低硫代品种选育提供理论指导。

• 热纤梭菌嗜热阿魏酸酯酶在拟南芥中的异源表达

  倪幸楠, 王永丽, 武艳芳, 李霞, 高璐, 蒋建雄

  在植物细胞壁中,阿魏酸可与半纤维素和木质素共价交联形成木质素-阿魏酸-阿拉伯木聚糖复合物,是木质纤维素形成坚固抗降解屏障的重要分子基础。阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase, FAE)可以打破半纤维素之间及半纤维素与木质素之间的阿魏酸酯键。本研究将来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)的阿魏酸酯酶基因的密码子进行优化后,构建了该嗜热FAE基因在胞质、质外体、内质网、叶绿体和线粒体等不同亚细胞空间特异表达的植物表达载体,并转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。结果表明,在获得的不同类型转基因系中均可检测到有该嗜热FAE的表达,其中在胞质中表达的酶活性最高,且在高温预处理(70 ℃)条件下的酶活性都显著高于常温下的酶活性(P<0.05)。与野生型相比,各个拟南芥转基因系的株高、鲜重、种子百粒重差异不显著,但在叶绿体和线粒体中表达的转基因株系出现了花期提前的现象。本研究可为能源植物、牧草和农作物秸秆的高效资源化利用提供新的思路与方法。

• 香石竹DcHsfA4基因克隆及表达特性分析

  万雪丽, 冯依, 刘庆华, 王奎玲

  热激转录因子(heat shock transcription factors, Hsfs)是响应逆境信号的重要元件。以香石竹(Dianthus caryophyllus)品种'Fancy'为材料,克隆得到热激转录因子基因DcHsfA4的完整编码序列(GenBank No. MN096327),序列全长1 173 bp,编码390个氨基酸。生物信息学分析结果显示,DcHsfA4蛋白分子式为C1963H3051N577O625S8,分子量为44.99 kD,理论等电点为5.48,脂肪系数71.95,不稳定系数49.72,预测为不稳定蛋白。疏水性/亲水性预测表明DcHsfA4蛋白为亲水蛋白。蛋白跨膜性分析显示DcHsfA4属于非跨膜蛋白。二级结构预测显示,DcHsfA4氨基酸组成包括α-螺旋(42.56%)、延伸链(6.67%)、β-折叠(3.08%)和无规则卷曲(47.69%),属于不规则结构。氨基酸序列比对显示,DcHsfA4含有高度保守的DNA结合域,此外,还包含疏水7肽重复区,核定位信号序列和C末端激活域。系统进化分析表明,DcHsfA4与拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtHsfA4同源性最高。利用qRT-PCR技术分析了DcHsfA4在常温或不同非生物胁迫处理下的表达特性,结果显示,在42 ℃胁迫、ABA或甘露醇分别处理后DcHsfA4的表达水平显著提高(P<0.05),4 ℃胁迫下,不同时间点DcHsfA4的表达模式不同,干旱处理24 h或NaCl处理12 h诱导了DcHsfA4的转录本上调表达。该研究结果为进一步探究香石竹热激转录因子的特性及响应逆境的生物学功能提供了依据。

• 秋水仙碱诱导杉木胚珠基因的表达变化

  潘瑶瑶, 吴博慧, 童再康, 卢泳全

  杉木(Cunninghamia lanceolata)具有胚珠裸露的特点,为秋水仙碱快速进入胚珠内部从而提高诱导效率提供了有利条件。为研究秋水仙碱对胚珠的诱导效果,本研究采用转录组测序技术分析杉木胚珠在秋水仙碱处理后的基因表达变化,并利用qRT-PCR技术对相关基因进行表达验证。结果显示,对于秋水仙碱处理组和对照组,转录组测序分别获得6.39和6.96 Gb原始数据,从头组装共获得60 790条unigenes;两组间共筛选出1 430个差异表达基因,从中获得纺锤体形成相关基因4个,DNA复制相关基因8个,调控细胞周期相关基因6个,都呈现显著下调表达。qRT-PCR分析表明,NEDD1 (neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated gene 1)、MCM3 (minichromosome maintenance complex component 3)、MCM7、CDC6 (cell division cycle 6)和ATXR6 (trithorax-related protein 6)基因在秋水仙碱处理前后的表达趋势与转录组测序结果一致。本研究将秋水仙碱直接作用于胚珠并筛选得到差异表达基因,为深入研究秋水仙碱诱导多倍体的分子机理提供了基础资料。

• 运输应激对山羊肝脏和肾脏病理损伤及热休克蛋白表达的影响

  郑文亚, 章志涛, 梅婷, 刘犇, 胡威, 崔燕

  随着山羊(Capra hircus)产品需求的增加,山羊异地运输增多,运输应激会引起山羊体重和肉质下降、免疫力降低、引发疾病甚至死亡,运输过程中山羊的管理情况将直接影响盈利水平和动物福利。本研究针对运输应激对山羊肝脏和肾脏显微和超微结构及热休克蛋白(heat shock proteins, HSP)表达的影响进行探讨。实验随机选取了12只健康赣西公山羊随机分为对照组、2 h运输应激组和6 h运输应激组3组,采用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)、透射电镜技术、免疫组织化学和蛋白质印迹(Western blot)技术,分析不同运输时间山羊肝脏、肾脏的损伤程度以及HSP27、HSP70和HSP90在其中分布和表达情况。显微与超微观察结果显示运输应激组山羊肝脏、肾脏均发生不同程度的损伤,肝脏中肝细胞出现明显的颗粒和水泡变性,部分细胞胞核染色质聚集,肾脏中肾小管和集合小管结构崩解,肾小球充血肿胀明显,肾小囊腔变窄,并且二者细胞中的线粒体肿大变形、嵴断裂消失,数量减少,甚至部分线粒体因肿胀、空泡化导致膜结构裂解。其中6 h运输应激组更为严重,部分肝细胞出现核溶解现象,管腔和肾小球细胞损伤程度也更加严重。免疫组织化学结果显示,肝脏中3种HSP主要在中央静脉和门管区附近的肝细胞胞质中表达,而肾脏中主要在肾小管和集合小管表达,在运输应激组表达更强。此外,HSP27在运输应激组肝脏中血管内皮、胆小管细胞和肾小体处也出现较强的阳性结果。Western blot分析结果显示在肝脏和肾脏中2和6 h运输应激组间,对比3种热休克蛋白表达量无显著差异(P>0.05),且肝脏中HSP90表达量在运输组与对照组间无明显变化(P>0.05)。在肝脏中2和6 h运输应激组HSP27和HSP70表达量分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)高于对照组;在肾脏中2和6 h运输应激组HSP27和HSP90蛋白表达量都极显著(P<0.01)高于对照组,并且肾脏中HSP70表达量在2和6 h运输应激组分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)高于对照组。总之,运输应激对山羊肝脏、肾脏造成了较严重的病理损伤,并且随着运输时间的延长损伤加剧,3种热休克蛋白在肝脏、肾脏中分布有所不同,山羊肝脏、肾脏的HSP27和HSP70表达量在运输应激后均明显升高,提高了肝肾细胞的抗逆性。本研究为山羊运输应激的解决方案提供了一定的理论依据。

• 虹鳟Hsp40家族基因鉴定及其热应激下的表达分析

  马芳, 刘哲, 康玉军, 权金强

  虹鳟(Oncorhynchus mykiss)作为典型的冷水性鱼类,对较高水温的耐受能力差,随着全球气候变暖,夏季高温对其养殖的威胁越来越严重。为了进一步探寻热休克蛋白(heat shock proteins, Hsps)在虹鳟热应激过程中的作用及其机理,本研究通过对虹鳟基因组数据库和RNA-seq数据进行生物信息学分析,共鉴定出36个Hsp40家族基因,并在全基因组水平对虹鳟Hsp40家族基因进行了理化性质、系统发育、基因结构及基因水平表达谱的系统分析。结果显示,根据结构的相似性这些基因可分为3种不同的亚型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,编码氨基酸190~760个,理论等电点5.01~9.09;基因结构分析显示,虹鳟Hsp40家族基因都只有1个外显子;亚细胞定位分析表明,虹鳟Hsp40家族基因主要在细胞质、细胞核和线粒体中表达;二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主。通过RNA-seq数据对虹鳟Hsp40表达谱分析显示,虹鳟热应激后有8个Hsp40基因在肝脏中表达上调,10个基因在头肾中表达上调,在两个组织中均表达且上调的基因有7个。热应激后Hsp40家族基因的显著表达调控表明Hsp40家族基因参与了虹鳟热应激,该结果为研究Hsp40家族基因成员抗热应激的调控机制提供基础数据。

• 应用iTRAQ定量蛋白质组学技术分析Sip毒素蛋白处理后的大猿叶甲差异蛋白

  尹彦力, 沙君雪, 张悠然, 谭佳丽, 孙敬, 高泽平, 李海涛

  Sip毒素蛋白(secreted insecticidal protein, Sip)是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)杀虫家族中的分泌型杀虫蛋白,对鞘翅目幼虫表现出毒性。大猿叶甲(Colaphellus bowringi)是常见的十字花科害虫,Sip蛋白对大猿叶甲具有较高的杀虫活性。本实验运用同位素相对标记与绝对定量技术(isotope relative labeling and absolute quantification technique, iTRAQ)分析Sip蛋白处理后大猿叶甲的差异蛋白,同时对其进行功能注释、富集分析。通过ProteinpilotTM V4.5软件进行定量分析,在基因本体数据库(Gene Ontology, GO)、蛋白相邻类的聚簇数据库(Cluster of Orthologous Groups of proteins, COG)对其进行功能注释,并对其进行KEGG通路分析,同时对所有显著性差异表达蛋白进行GO及KEGG通路分析。与对照组比对后,在实验组中鉴定出具有定量信息的蛋白质47个,包含27个上调蛋白和20个下调蛋白。通过GO、COG功能注释和KEGG分析,发现这些差异蛋白主要涉及结合和催化活性等分子功能;主要参与细胞进程和代谢进程等生物过程;预测到这些差异性蛋白可能有的功能为翻译后修饰,蛋白质周转,伴侣、翻译,核糖体结构和生物合成等。通过富集分析,发现这些差异蛋白主要有核核小体、非包膜细胞器、细胞内非包膜细胞器、核小体、核糖体、COPI包膜囊泡、蛋白质-DNA复合物、分泌颗粒、核染色质、高尔基体堆等生物学功能。本研究发现,在经过Sip毒素蛋白处理后,Bt毒素常见的一些受体发生了差异性表达,如钙黏蛋白(cadherin),氨肽酶N (aminopeptidase N, APN),碱式磷酸酶(alkaline phosphatase, Alp),G蛋白(G-protein)。本研究结果为Sip毒素作用机理的研究提供参考,并为Sip毒素的蛋白质组学研究提供科学参考。

• 禽腺病毒4型Fiber2蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备

  郭浩然, 贾艳娥, 吉艳红, 李郁

  自2015年以来,国内鸡(Gallus domesticus)群因禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)感染引起的包涵体肝炎、心包积液的病例呈逐年上升趋势。为制备反应原性良好的FAdV-4血清学诊断抗原,本研究根据密码子优化后的FAdV-4 Fiber2全基因合成序列进行了体外扩增,再将其克隆入pCold表达载体,构建原核表达载体pCold-Fiber2。pCold-Fiber2重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli) PG-Tf2感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalac toside, IPTG)诱导表达后纯化Fiber2蛋白,用该蛋白免疫家兔(Oryctolagus cuniculus),成功制备了抗FAdV-4 Fiber2蛋白多克隆抗体。Western blot和间接免疫荧光试验(indirected immunofluorescence assay, IFA)结果表明,抗FAdV-4 Fiber2蛋白多克隆抗体纯化后可与Fiber2蛋白和FAdV-4发生特异性反应,证明Fiber2蛋白具有良好的免疫原性。建立的FAdV-4抗体间接ELISA检测方法显示该方法检测灵敏性为96%,特异性为100%。本研究成功制备了具有良好Western blot和IFA反应原性的多克隆抗体,建立了FAdV-4抗体间接ELISA检测方法,该方法反应特异性好、灵敏度高、操作简单、反应结果稳定可靠,适用于鸡群抗体水平的监测、评估和发现早期隐性感染,为研制FAdV-4的血清学诊断技术和防控该病提供了基础资料。

• 沼灌对土壤氨氮、总磷及细菌多样性的影响

  余薇薇, 张敏讷, 朱家悦, 杜邦昊, 杨硕, 谢明扬

  沼灌农田可一定程度解决养殖废水的后续消纳问题,但长期沼灌会产生氮磷流失,有引发地下水污染的风险。本研究采用不同介质装填的土壤柱模拟沼液灌溉,考察不同土壤介质条件下氨氮(NH3-N)、总磷的吸附迁移行为,并利用Illumina MiSeq高通量测序技术研究沼灌前后土壤细菌多样性变化。结果表明,不同土壤介质对NH3-N、总磷吸附能力不同,紫色土1吸附最强,河沙最弱。沼灌2 d,紫色土1表层土能快速吸附NH3-N,随时间推移下层土吸附减弱。沼灌完成后,NH3-N在紫色土1中迁移至-25 cm土层处,渗滤液中NH3-N浓度为11.52 mg/L;河沙中迁移至-45 cm土层,NH3-N浓度为211.80 mg/L,有继续向下迁移趋势;紫色土1和砂壤土在-35 cm土层渗滤液中总磷浓度分别为0.23 mg/L和0.63 mg/L,能吸附固定总磷,阻止磷向下迁移;同时沼液灌溉降低紫色土细菌多样性和丰富度,改变群落结构。沼灌后紫色土1的Shannon指数和Chao指数分别为5.510和1 122.408,TM7 (Saccharibacteria)最多,疣微菌门(Verrucomicrobia)最少。本研究为沼灌农田后土壤氮磷元素的吸附迁移过程提供一定的理论依据,揭示了沼灌对土壤细菌多样性的影响,有助于进一步了解沼灌对紫色土壤及周边环境产生的后续影响。

• 不同纯化程度豌豆水溶性多糖的电镜扫描分析

  张淑杰, 权威, 姜宏伟, 康玉凡

  我国豌豆(Pisum sativum)资源丰富,豌豆在食品、医药等领域具有重要的加工利用价值,近年来对其功能成份、活性物质的研究逐渐成为热点。本研究以豌豆粉为原料进行多糖超声辅助提取,采用硫酸苯酚法测定多糖含量,其多糖得率为7.26%。粗多糖经不同程度纯化处理,运用扫描电子显微镜对得到的豌豆可溶性多糖超微形貌进行观察,按照多糖不同纯化程度,将待考察的多糖种类分为：粗多糖(crude polysaccharides of pea, CPP)、脱蛋白多糖(deproteinization of polysaccharides, TPP)、DEAE Fast Flow离子交换柱层析多糖(水洗脱多糖(water elution -diethylaminoethyl fast flow- ion exchange column chromatography, W-DEPP); NaCl洗脱多糖(NaCl elution -diethylaminoethyl fast flow- ion exchange column chromatography, N-DEPP)、葡聚糖G-100凝胶柱层析多糖(water elution-G-100 sephadex gel chromatography, W-DE-GPP-a, W-DE-GPP-b; NaCl Elution-G-100 sephadex gel chromatography, N-DE-GPP1-a, N-DE-GPP1-b)四大类。通过对电镜扫描观察倍数进行调整,根据所得到的扫描电镜图对每个多糖的形貌特征从3个清晰度(×100, ×1000和×10000)进行分析和总结,解释了不同纯化程度下多糖颗粒超微结构的变化情况。本研究初步形成不同纯化程度的豌豆可溶性多糖形貌电镜照片,为豌豆多糖形貌特征及后续结构特性研究提供基础理论参考。

• 单碱基编辑工具—腺嘌呤碱基编辑器ABE的研究进展

  李广栋, 张鲁, 富俊才, 连正兴, 刘国世

  基因编辑技术CRISPR/Cas9自诞生以来,在基因敲除、敲入、碱基修复等领域得到了广泛的应用,但其效率低下,且存在非靶向切割,安全性较低,极大地限制了传统CRISPR/Cas9在高分辨率单碱基编辑中的应用。基于传统CRISPR/Cas9发展起来的碱基编辑器(base editor, BE)的出现则克服了这些弊端,其中,胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor, CBE)能够使C•G转换为T•A,腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor, ABE)能够使A•T转换为G•C,都可以在不引入双链断裂的情况下实现高效的单碱基置换,这就避免了传统的CRISPR/Cas9在进行非同源末端连接(nonhomologous end-joining, NHEJ)时引入不可控的插入或缺失突变(Indels)。人类(Homo sapiens)大部分遗传疾病是由于碱基突变造成的,而单碱基编辑工具的出现能够在一定程度上纠正一定比例的致病性SNP,因此,其在动物模型构建、功能基因组学研究、分子育种、临床医学、转化医学等领域应用前景广阔。本文针对发展较晚、脱靶效率更低的腺嘌呤碱基编辑器ABE的原理、发展历程、应用和所面临的机遇与挑战进行了综述,以期为单碱基编辑技术的研究与应用提供参考。

• 畜禽拷贝数变异研究进展

  金美林, 卢曾奎, 李青, 费晓娟, 储明星, 魏彩虹

  拷贝数变异(copy number variation, CNV)可能是影响动物表型多样性和进化适应的主要因素之一,通过多种机制对机体进行调节,如基因剂量和转录结构的改变。自首次构建出人类(Homo sapiens)基因组第一代CNV图谱后, CNV在人类和动物中的研究越来越多。研究表明,CNV与人类某些疾病的发病机制、动物的遗传变异以及家畜的重要经济特征有关。本文主要参考国内外相关的研究报道,对CNV的定义、形成机制、检测方法以及畜禽CNV的研究现状进行阐述,总结畜禽CNV研究目前所面临的问题并展望其在遗传育种方面的应用前景,为进一步对CNV的研究提供参考资料。

• 农用微生物菌剂固定化技术研究进展

  李琦, 杨晓玫, 张建贵, 冯影, 杨琰珊, 白洁, 姚拓

  近年来,随着固定化微生物技术的不断发展,其应用已延伸到了各个领域中。鉴于农用微生物菌剂固定化技术对农业领域重要意义,本文对近年来农用微生物菌剂固定化技术的研究进展进行了概述,并总结了固定化微生物技术的特点,归纳了农用微生物菌剂固定化载体的研究现状,介绍了农用微生物菌剂固定化技术的应用研究进展,对存在的问题和对未来的展望进行了评述。本综述为农用固定化微生物菌剂的制备技术、载体选择和应用途径提供参考。

• 利用TALEN技术构建猪内源性基因Tiki1打靶猪模型

  吴彩霞, 刘朝明, 颜泉梅, 欧阳振, 赵宇, 张全军, 樊娜娜, 赖良学

  Tiki1基因(TraB domain containing protein 2A)在蛙(Xenopus laevis)头部诱导发生过程中起着决定性的作用,但Tiki1在哺乳动物乃至人(Homo sapiens)的早期发育中的功能尚不清楚,与人类在生理学、病理学上都极为相近的猪(Sus scrofa)成为研究Tiki1功能的理想哺乳动物模型。本研究利用转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)基因编辑技术针对猪内源性基因Tiki1外显子4设计了1对TALEN质粒,并在猪孤雌激活胚胎水平上进行了TALEN质粒的体外活性检测,比较了设计的TALEN质粒以不同浓度注射时打靶效率及对胚胎发育的影响,并进行了细胞的转染和筛选,结合体细胞核移植技术构建了Tiki1基因打靶猪模型。本研究共计构建了1 922枚基因编辑克隆胚胎并植入8头代孕母猪子宫内,其中3头怀孕到期并顺利分娩,共计获得12头活猪和1头死胎,经酶切鉴定和测序鉴定结果表明其中有4头属于预期的Tiki1基因打靶阳性猪模型。将Tiki1基因打靶阳性猪模型和WT配种,经过足月后顺产分娩获得5头F1代成活仔猪,进一步测序鉴定基因敲除情况,结果表明构建的Tiki1基因打靶阳性猪模型是可以生殖系遗传的,不是嵌合体。本研究首次采用TALEN技术对猪基因组内源性基因Tiki1进行定点修饰,成功且高效率地构建了猪内源性基因Tiki1敲除的大动物模型,为实现大动物高效的基因编辑提供了有力的工具,也为将来建立各种生物医药模型和农业基因改良猪提供了技术基础。

• CRY1在雄性牦牛生殖轴中的表达与分布

  陈健楠, 王琪, 王媛媛, 吕琛, 赵彩英, 张勇, 马友记, 张全伟, 赵兴绪

  隐花色素1 (cryptochrome 1, CRY1)基因是哺乳动物生物钟基因之一,其表达蛋白既是光受体又是生物钟的组成部分,经体液和神经途径送达效应器,调节生理、生化和节律行为。本研究采集牦牛(Bos grunniens)的下丘脑、垂体、松果体及睾丸组织,通过反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技术对CRY1编码区序列进行克隆和序列分析,通过荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, qRT-PCR)、Western blot和免疫组织化学染色技术分析CRY1在成年雄性牦牛生殖轴系及不同年龄段(30日龄, 2, 4和6岁龄)雄性牦牛睾丸中的表达规律。结果显示,CRY1基因CDS全长为1 712 bp,ORF为1 257 bp (GenBank No. MN460656),共编码418个氨基酸残基,无跨膜结构区,编码的蛋白属可溶性蛋白;组织表达与分布结果发现,CRY1 mRNA和蛋白在雄性牦牛下丘脑、垂体、睾丸及松果体组织中均有表达,在松果体组织中的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01);免疫组织化学染色结果显示,在下丘脑室旁核细胞、垂体细胞、睾丸各级生精细胞、松果体细胞和神经胶质细胞上均有阳性表达;不同年龄段睾丸组织中表达结果发现,CRY1 mRNA和蛋白在30日龄睾丸中的表达量最低,随着年龄的增长,表达量逐渐增高。研究结果表明,CRY1在动物进化中比较保守,在雄性牦牛性腺轴和不同年龄牦牛睾丸中均有表达,推测其可能在牦牛生殖过程中起着重要作用。上述结果为牦牛生物节律基因CRY1的生物学功能及其在牦牛生殖生理调控的相关研究提供依据。

• HIF1α和Beclin1在成年牦牛脑组织中的表达与分布

  拜占春, 崔燕, 余四九, 马俊兴, 何俊峰, 张倩

  中枢神经系统是机体各器官活动的重要调节系统,而脑作为主要部分在畜体生长及适应低氧环境过程中发挥重要作用。为了探讨成年牦牛(Bos grunniens)脑组织适应低氧过程中低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF1α)和酵母ATG6同系物Beclin1的表达及其之间的相互关系,本研究利用qRT-PCR、ELISA及免疫组织化学技术,对HIF1α和Beclin1的表达与分布进行研究。qRT-PCR和ELISA结果显示,HIF1α和Beclin1的mRNA和蛋白水平在成年牦牛海马组织最高,然后依次为大脑皮质、四叠体、延髓及小脑。免疫组织化学染色结果显示,HIF1α和Beclin1阳性产物主要分布于细胞质;在大脑皮质多集中于锥体细胞类神经元,在海马位于分子层、颗粒层及多形细胞层的神经元,在四叠体、延髓集中表达于神经元;另外,HIF1α和Beclin1在小脑浦肯野氏细胞有分布,在颗粒层和分子层有少量细胞表达。上述研究结果提示,海马和大脑皮质可能对缺氧具有易感性;HIF1α可能促进Beclin1表达,从而提高脑组织对低氧的适应能力,具体机制有待深入研究。本研究为深入探讨高原牦牛脑组织的适应性机制提供了基础资料。

• 甘加藏羊发情周期子宫中FSHR和LHR表达及分布

  王霞, 葛闻博, 何玉琴, 杨大鹏, 周凯仁, 陈卫刚, 包莹莹

  甘加藏羊(Ovis aries)生长在高海拔地区,繁殖率较低。本研究旨在阐明甘加藏羊发情周期子宫中促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor, FSHR)和促黄体素受体(luteinizing hormone receptor, LHR)的基因表达及组织分布,探讨FSH和LH在藏羊繁殖活动中的调控作用。选取处于发情周期、健康未孕甘加藏羊32只,采集发情周期不同阶段的子宫组织。qRT-PCR检测结果显示,FSHR和LHR在甘加藏羊整个发情周期的子宫组织中均有表达,FSHR在发情期表达量最高,极显著高于发情前期和发情后期(P<0.01);LHR在间情期表达量最高,极显著高于发情前期和发情期(P<0.01)。免疫组织化学检测结果显示,FSHR和LHR在甘加藏羊发情周期的子宫颈、子宫体和子宫角中均有分布,并主要分布于基质细胞、腺体细胞、血管内皮细胞和肌层平滑肌细胞;FSHR在发情期子宫腺体细胞、基质细胞和肌层平滑肌细胞中分布最多,在间情期血管内皮细胞中分布最多;LHR在间情期子宫腺体细胞、基质细胞和肌层平滑肌细胞中分布最多,在发情后期血管内皮细胞中分布最多。上述结果表明,FSHR和LHR可能参与发情周期藏羊子宫生理功能的调控。本研究为在细胞和分子水平上研究藏羊生殖活动调控机理提供了参考数据。

• 甘加藏羊发情周期垂体和卵巢中PRLR基因表达与组织分布的研究

  周凯仁, 何玉琴, 葛闻博, 张全伟, 杨大鹏, 王霞, 陈卫刚, 包莹莹

  甘加藏羊(Ovis aries)为甘肃特有畜种,由于其生活环境的特殊性,繁殖率较低。为研究甘加藏羊发情周期垂体和卵巢组织中催乳素受体(prolactin receptor, PRLR)的基因表达及分布在生殖活动中的调节作用,选取32只处于发情周期的甘加藏羊,利用实时荧光定量PCR技术和免疫组织化学染色,分别对处于发情前期、发情期、发情后期、间情期的的甘加藏羊垂体和卵巢组织中PRLR基因表达及分布进行分析。结果显示,甘加藏羊发情周期垂体和卵巢组织上均有PRLR基因表达及分布。在垂体中,PRLR在发情期的基因表达量最高,显著高于发情后期(P<0.05);PRLR阳性细胞主要分布于腺垂体远侧嗜酸性细胞的细胞质中,PRLR在发情前期垂体中的分布最多,发情期最少。在卵巢组织中,PRLR在发情期基因表达量最高,显著高于发情后期、发情前期和发情间期(P<0.05);PRLR阳性细胞主要分布于卵泡颗粒层,PRLR在发情前期的分布最多,发情期最低,发情前期和发情间期显著高于发情期和发情后期(P<0.05)。甘加藏羊发情周期PRLR在垂体和卵巢组织中的基因表达及分布有差异,提示PRLR对甘加藏羊发情周期的调控可能存在差异性。本研究结果对甘加藏羊繁殖性能的调控研究提供了基础资料。