农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2022年第10期

• 基因编辑外源基因Cas9定性定量检测方法的研究

  丁霖, 王颢潜, 张敏, 王雨玲, 汪小福, 陈笑芸, 徐俊锋, 张秀杰, 彭城

  对基因编辑产品进行有效监管、消除公众疑虑是基因编辑产品在我国产业化的前提。目前,Cas9核酸内切酶是基因编辑技术中最常用的手段,因此需要建立针对Cas9核酸内切酶的定性定量检测方法。本研究以基因编辑中最常用的Cas9核酸内切酶外源序列为靶位点,设计和筛选引物、探针,进行PCR体系优化,确定最佳的引物浓度与退火温度,通过特异性、灵敏性等测试建立了检测基因编辑外源基因Cas9的普通PCR和qPCR检测方法。在检测方法特异性实验中,普通PCR和qPCR方法均只在含有Cas9等外源DNA的样品中扩增出了阳性结果,而其他不含有Cas9核酸内切酶的样品则均为阴性结果;在方法灵敏性测试中,普通PCR检测方法的检出限为0.1%,qPCR法检测下限(limit of detection, LOD)为16个拷贝;在方法稳定性实验中,普通PCR和qPCR方法在其相应最低检出限浓度下分别进行了67与60次重复实验,结果均为阳性。该定性定量方法适用于不同基因编辑作物,如水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)和油菜(Brassica napus)等。本研究建立的Cas9定性及定量检测方法特异性良好、灵敏度较高、稳定性较强。该方法的建立为将来实现对基因编辑产品的有效监测提供了一定的技术支撑。

• 铁皮石斛白绢病响应miR171b及miR171b靶标DcGRAS基因家族的鉴定及表达分析

  赖丹妮, 蔡翔, 陈东红, 韩之刚, 吴令上, 斯金平, 李聪

  铁皮石斛(Dendrobium catenatum)是多年生草本药用植物,具有益胃生津的功效。白绢病是翠雀小核菌(Sclerotium delphinii)引发的一种广谱性真菌病害,在铁皮石斛近野生栽培中一旦发病可造成全年绝收,危害巨大。本研究对翠雀小核菌侵染后的铁皮石斛进行Small RNA组和转录组测序,筛选到受microRNA171b (miR171b)调控并响应翠雀小核菌侵染的靶基因DoNSPL2-2和DoNSPL2-5,在翠雀小核菌侵染后,DoNSPL2-2与DoNSPL2-5的表达显著提高(P<0.05)。采用生物信息学对铁皮石斛GRAS (gibberellic acid insensitive (GAI), repressor of GAI (RGA), and scarecrow (SCR))基因家族成员进行了鉴定和分析。结果显示,铁皮石斛51个GRAS基因家族成员被分为11个亚族,其蛋白质序列长度为345~757个氨基酸;蛋白质的相对分子质量范围为39.274 0~85.661 6 kD,蛋白质理论等电点为4.59~7.52,均含有GRAS保守结构域。转录组数据显示,DoNSPL2-2与DoNSPL2-5在铁皮石斛的根中表达显著上调(P<0.05);干旱胁迫中,DoSCL21-2与DoSCL3-3的表达量随时间延长而显著上调(P<0.05);低温胁迫中,DoCIGR1与DoSCL23-like的表达量较对照组显著上调(P<0.05)。本研究对铁皮石斛miR171b及其靶基因GRAS家族进行了分析,初步阐明了miR171b-GRAS调控模型参与调控铁皮石斛防御白绢病的分子机制,为铁皮石斛抗白绢病育种提供理论依据。

• 牛恒定链与BoLAⅡ类分子β链活性片段的结合与定位分析

  陈芳芳, 于凤梅, 张俊, 谈阳, 刘翠艳, 桂亚萍

  牛白细胞抗原(bovine leukocyte antigen, BoLA),又名主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC),其Ⅱ类分子及其伴侣蛋白恒定链(invariant chain, Ii)在加工和递呈抗原肽中起关键作用。为了解在此过程中BoLAⅡβ链与Ii结合和在细胞内定位的特征,本研究提取了淮北黄牛(Bos taurus)血细胞mRNA并反转录为cDNA,应用PCR技术扩增牛Ii与BoLAⅡβ链及结构域的基因片段,并分别构建相应的真核和原核表达质粒。利用原核表达系统进行蛋白的表达和纯化,应用拉下法和Western blot检测Ii结合BoLAⅡβ及其片段的结合关系。应用激光共聚焦显微镜观察Ii与BoLAⅡβ链及其片段在细胞内共定位。结果显示,构建的含牛Ii、BoLAⅡβ、BoLAⅡβ(β1β2)和BoLAⅡβ(TC)基因的重组质粒转化细菌,经诱导能正确表达蛋白并得到纯化。BoLAⅡβ和BoLAⅡβ(β1β2)具有结合Ii的活性功能,而BoLAⅡβ(TC)却无此功能。同时,在真核细胞内Ii能与BoLAⅡβ及其主要结构域BoLAⅡβ(β1β2)和BoLAⅡβ(TC)共定位。综上所述,BoLAⅡβ的β1β2是结合Ii的关键结构域,而BoLAⅡβ的β1β2和TC结构域均具有与Ii在细胞内共定位功能。本研究为进一步研究牛BoLA分子与Ii在免疫应答中的转运及其机理提供了重要实验依据。

• 牛精浆中氨基酸含量与精子活力的关联性分析

  李欣, 韩碧莹, 杨明, 张学丽, 海超, 李光鹏, 赵跃芳

  精液冷冻保存在良种选育中发挥重要作用,但是精液冷冻会引起精子损伤。为了探寻精浆中决定精子冷冻耐受能力的关键因子,本研究采集了5头鲁西牛(Bos taurus)和5头蒙古牛的精液,系统地检测分析了精液体积、精子密度、精子活力等指标并通过HPLC技术定量分析了鲁西牛和蒙古牛的精浆中各氨基酸的含量。研究结果显示,10头牛的精液体积平均为4.85 mL,精子密度平均为13.76亿个/mL,鲜精和冻精活力分别为69.67%和35.68%,精浆中总氨基酸浓度为25~54 mg/mL,且蒙古牛高于鲁西牛;精浆中各氨基酸浓度与精子活力相关性分析结果表明,酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)的浓度与冻精活力存在显著相关性,Pearson相关系数r值分别为0.743、0.755、0.662、0.649、0.725、0.729 (P<0.05),脯氨酸(Pro)的浓度与冻精活力存在极显著相关性(r=0.768, P<0.01)。综上可知,精浆中氨基酸含量的检测可以作为牛精子冷冻耐受能力评价的潜在指标。本研究为冷冻精液质量的进一步提高提供了理论依据。

• Myostatin基因编辑牛骨骼肌组织学结构与转录组分析

  朱琳, 谷明娟, 王丽娜, 刘哲, 雷佳茹, 魏著英, 白春玲, 杨磊

  肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)主要在骨骼肌中表达,参与调控骨骼肌的生长发育。MSTN基因突变引起肌肉过度发育,出现双肌表型。本研究以MSTN基因编辑的鲁西牛(Bos taurus)骨骼肌为材料,探究MSTN敲除后对牛肌肉表型的影响,通过转录组挖掘MSTN基因调控肌肉发育的机制。分别取比目鱼肌、腓肠肌、半腱肌和最长肌4种典型的骨骼肌,通过4种骨骼肌的苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)切片,观察MSTN基因敲除后对骨骼肌的影响,qRCR、Western blot检测 4种骨骼肌中MSTN mRNA和蛋白表达量,最后通过转录组分析,探究MSTN敲除后对鲁西牛骨骼肌作用机制的靶基因。结果表明,与普通鲁西牛相比,MSTN基因编辑牛骨骼肌的肌纤维横截面积显著增大,肌间脂肪显著减少。转录组测序结果显示,MSTN基因编辑牛和普通牛的骨骼肌之间共鉴定出5 945个差异表达基因表达(FC>1.5, P<0.05),其中在MSTN基因编辑牛骨骼肌中表达量上调基因有672个,有表达量下调基因5 273个;这些差异基因主要集中在PI3K-Akt、MAPK、p53和AMPK等信号通路,参与肌卫星细胞增殖与分化等发育过程。研究表明,MSTN基因缺失促进了肌肉发育与分化相关基因的表达调控,增加了骨骼肌纤维的横截面积,由此产生肌肉肥大的表型。本研究为探究MSTN基因缺失牛骨骼肌肥大机制提供数据支持。

• 皮南牛与南阳牛脂肪组织差异表达lncRNA筛选及其调控网络构建

  朱运昌, 闪欣悦, 王豪靖, 赵雅迪, 景毓佳, 刘格格, 郝瑞杰, 马云, 魏雪锋

  长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)已知参与脂肪形成,但是其分子机制仍未明确。为进一步探索lncRNAs在脂肪沉积过程中的潜在作用,为肉牛(Bos taurus)改良提供理论基础,本研究利用高通量RNA测序技术在南阳牛和皮南牛背脂中共鉴定了3 040个lncRNAs,其中两种牛共同表达的lncRNAs有3 008 (98.9%)个。特征性分析发现,大多数(66.02%) lncRNAs长度集中在1 000~2 500 bp之间,且在所有染色体中均有分布;差异性表达分析显示,皮南牛与南阳牛相比共有67个差异表达的lncRNAs ,其中32个上调,35个下调。GO分析结果显示,差异表达的lncRNAs主要富集在脂类转运过程、膜的组成成分、脂质抗原结合等相关生物过程。KEGG通路分析显示,这些差异表达的lncRNAs基因主要富集在甘油磷脂代谢、醚脂代谢、甘油酯代谢、碳水化合物消化吸收等通路。为了探究lncRNA作用机制,初步构建了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,结果发现,LOC104972839/LOC107131703-miR-27b-磷脂酶A2组IVF (phospholipase A2 group IVF, PLA2G4F)/包含2A的主要促进子超家族结构域(major facilitator superfamily domain containing 2A, MFSD2A)可能与脂肪酸降解及脂肪沉积有重要关联,可作为候选目标进行脂肪发育机制研究。为了检测测序结果的可靠性,利用qRT-PCR进行表达水平鉴定,并利用在线软件进行编码能力预测,结果显示,差异表达lncRNAs表达水平与测序结果一致,且编码能力很低。本研究为脂肪沉积相关的lncRNA的发现和注释提供了新的见解,并为进一步阐明牛脂肪沉积的分子调控机制提供依据。

• 热应激应答过程中酪蛋白来源的环状RNA表达谱分析

  齐颖, 解春艳, 刑静, 李秋玲

  热应激会导致牛乳中酪蛋白含量减少,降低牛乳品质。本研究拟鉴定参与热应激应答的酪蛋白基因来源的环状RNA,为今后阐明热应激导致酪蛋白表达减少的分子机制提供理论依据。本课题组前期工作通过RNA-seq获取了环状RNA在非热应激及热应激奶牛(Bos taurus)乳腺组织中的表达数据。本研究随机挑选4个环状RNA,通过Sanger测序法验证了其反向剪接位点的存在;通过实时荧光定量PCR技术验证了其在非热应激及热应激组中的相对表达水平,所得结果与高通量测序分析结果一致。酪蛋白的编码基因包括αs1酪蛋白(casein alpha s1, CSN1S1)、αs2酪蛋白(CSN1S2)、β酪蛋白(casein beta, CSN2)以及κ酪蛋白(casein kappa, CSN3)。通过统计分析环状RNA的宿主基因数据,分别统计了来源于各个编码基因的环状RNA,通过聚类热图及韦恩图展示了这些环状RNA在不同样本及不同组别中的表达模式。最后,通过RNA-seq的TPM (transcripts per million)数据分析了酪蛋白基因来源的环状RNA的相对表达水平。本研究鉴定出源于酪蛋白基因的环状RNA共52个,其中来源于CSN1S1、CSN1S2和CSN2的环状RNA种类分别为29、16和7个,未检测到来源于CSN3的环状RNA。这些环状RNA中,与非热应激组相比,显著上调的环状RNA有5种,其中3种在热应激条件下特异性表达。所鉴定的酪蛋白来源的环状RNA,在热应激应答过程中显著差异表达(P<0.05),可能参与了热应激应答过程的乳蛋白合成调控。本研究鉴定了热应激应答过程中酪蛋白来源的环状RNA差异表达谱,有助于阐明热应激导致牛乳中酪蛋白含量减少的分子机制,为提高牛乳品质提供了理论依据。

• 雌二醇和孕酮对LPS诱导的犬子宫内膜基质细胞TLR4及炎性因子表达的影响

  倪珺, 邱靖淇, 李瑾, 冯忆秋, 刘飞燕, 芮荣

  子宫蓄脓是母犬(Canis lupus familiaris)常见的生殖疾病之一,其主要诱因包括激素分泌异常和细菌感染。子宫内膜是激素应答的靶器官,子宫内膜细胞的异常活化会导致大量炎性因子释放,引起炎症反应,然而在炎症环境下类固醇激素对犬子宫内膜基质细胞的免疫调控作用知之甚少。本研究旨在探讨类固醇激素雌二醇(estradiol, E2)和孕酮(progesterone, P4)调控体外培养的犬子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells, ESCs) Toll样受体4 (Toll like receptor 4, TLR4)及相关炎性因子的分泌规律。临床采集子宫蓄脓犬和健康犬的外周血血清,利用ELISA方法检测血清中E2和P4的浓度;应用胶原酶消化法分离获取健康犬子宫内膜基质细胞并进行免疫荧光鉴定;以检测到的E2 (0.2 nmol/L)和P4 (0.1 μmol/L)作用于细胞,利用噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)法测定E2和P4对细胞体外生长的影响;再分别与1 μg/mL的细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)共同处理细胞,通过qPCR检测LPS诱导6、12和24 h犬子宫内膜基质细胞中TLR4和炎性因子的基因表达。免疫荧光鉴定结果显示,犬子宫内膜基质细胞纯度较高。MTT检测结果显示,P4单独作用及E2和P4联合处理能显著促进细胞的体外增殖。qPCR结果显示,与对照组相比,LPS刺激后TLR4和炎性因子的基因表达量均显著上调(P<0.05);与LPS组相比,P4单独处理与E2和P4联合处理可显著下调LPS刺激引起的TLR4和炎性因子基因过量表达(P<0.05)。上述结果提示E2和P4可能在子宫内膜的免疫调节中发挥重要作用。本研究为阐明子宫蓄脓发生的分子机制及E2和P4对子宫内膜先天性黏膜免疫的影响提供基础资料。

• 双峰驼FcαR基因的原核表达、抗体制备及其在脾脏中的表达模式

  李沛轩, 刘晓霞, 刘丽萍, 王雯慧

  免疫球蛋白A (immunoglobulin A, IgA) Fc受体 (Fc receptor, FcαR)能够介导细胞发生免疫活化或免疫抑制,对维持机体免疫应答的稳态具有重要意义。双峰驼(Camelus bactrianus)脾脏作为FcαR主要表达部位之一,能够使机体迅速产生相应的免疫反应。本研究通过制备双峰驼FcαR多克隆抗体,并以幼年(1~2岁)、青年(3~5岁)和成年(6~8岁)双峰驼脾脏作为研究对象,探索FcαR阳性细胞在脾脏红髓区、白髓区及边缘区中的表达情况及其随年龄变化特征。首先截选出双峰驼FcαR的膜外区基因序列,合成后构建重组质粒,将其转入大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta感受态细胞中中诱导表达,并对诱导条件进行优化。接着用纯化的FcαR蛋白免疫家兔(Oryctolagus cuniculus),制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot测定抗血清的效价和特异性。最后应用免疫组织化学染色、苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)分析FcαR阳性细胞在不同年龄段双峰驼脾脏不同区域的分布特征,并对不同年龄段和不同区域的FcαR阳性细胞密度进行分析。结果发现FcαR质粒以包涵体的形式表达,最佳诱导条件为0.7 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导5 h,杂蛋白最佳洗脱浓度为5 mmol/L咪唑,抗血清效价达到1∶64 000,能特异性识别重组蛋白FcαR。FcαR阳性细胞在幼年、青年和成年双峰驼脾脏的分布位置相似,均集中分布于红髓区的窦壁和中央动脉管壁周围,阳性细胞类型以单核/巨噬细胞为主,中性粒细胞和树突状细胞上也有表达。此外,从双峰驼幼年到成年这一阶段,脾脏中FcαR阳性细胞密度呈明显的升高趋势。结果提示：FcαR阳性细胞在双峰驼脾脏中的表达部位不受年龄的影响,并且随着年龄的增长,脾脏中阳性细胞数量的增多为其免疫功能的完善提供了一定的生理基础。本研究可为进一步探索双峰驼免疫学功能提供参考。

• 农华麻鸭脑组织多胺含量及其代谢相关基因表达的研究

  康丽鹃, 周雪敏, 但红颖, 葛凡滋, 李硕, 王鑫, 王泽龙, 牛春阳, 郭永妮, 康波

  多胺主要包括腐胺、亚精胺和精胺,可参与调控神经系统发育和再生。为研究鸭(Anas platyrhynchos)脑组织多胺代谢发育性变化规律,本研究采用高效液相色谱技术,测定0~120日龄的农华麻鸭大脑和小脑组织多胺含量,应用qPCR检测多胺代谢关键基因表达量。结果表明,大脑和小脑中亚精胺和精胺含量均高于腐胺,且随着日龄增长多胺总量呈下降趋势。在大脑中,60日龄腐胺含量(30.80 mg/kg)显著高于其他日龄(P<0.05),0日龄亚精胺含量(643.26 mg/kg)显著高于其他日龄(P<0.05),0日龄精胺含量(1665.95 mg/kg)和120日龄精胺含量(1623.66 mg/kg)显著高于其他日龄(P<0.05)。在小脑中,0日龄亚精胺含量(54.09 mg/kg)和精胺含量(413.50 mg/kg)显著高于其他日龄(P<0.05),0日龄腐胺含量(26.46 mg/kg)和120日龄腐胺含量(22.03 mg/kg)显著高于其他日龄(P<0.05)。大脑和小脑中多胺代谢基因均在0日龄时高表达(P<0.05)。大脑多胺代谢关键基因表达量均呈30日龄时下降,60日龄升高,90日龄下降,120日龄上升的趋势。小脑中,各基因表达水平在0日龄时表达量均处于较高水平,表达量变化趋势不一致。本研究揭示了不同日龄的鸭脑组织中多胺含量变化规律及多胺合成代谢关键基因表达水平,为多胺调控脑生长发育提供基础数据。

• 中间球海胆SiPFK基因的克隆及酸化-高温胁迫对其表达的影响

  焦仁和, 崔东遥, 武博琼, 宋坚, 常亚青, 湛垚垚

  糖酵解途径中的关键酶磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK)在棘皮动物调节和适应海洋环境变化中发挥重要作用。为明确中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius) PFK基因的序列信息和表达规律,初步了解“酸化-高温”胁迫对其表达和生物活力的影响,本研究通过cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术获得中间球海胆磷酸果糖激酶基因SiPFK的全长cDNA序列(GenBank No. OM780114),并利用生物信息学软件分析其序列特征,在此基础上,比较分析了“酸化-高温”胁迫条件下,中间球海胆的肠和性腺组织中SiPFK基因的相对表达及其酶活力变化情况。结果表明,SiPFK基因的cDNA全长为2 787 bp,编码840个氨基酸,SiPFK蛋白理论等电点为7.48,蛋白质分子质量为92.01 kD;生物信息学分析显示,SiPFK蛋白氨基酸序列与紫球海胆(S. purpuratus) PFK氨基酸序列最为相似,相似度为96.20%;qPCR和酶活力测定结果显示,SiPFK基因的相对表达和总酶活力的组织特异性较为明显,“酸化-高温”胁迫60 d后,与对照组相比,处理组中间球海胆的肠和性腺组织中SiPFK基因的相对表达量和SiPFK酶活力均发生了改变,推测“酸化-高温”胁迫可能通过调控糖代谢关键酶活力对海胆的物质代谢过程产生影响。本研究为探究棘皮动物响应未来海洋环境变化提供重要参考依据。

• 玉米大斑病菌蛋白激酶A催化亚基StPKA-C1/C2的表达与互作蛋白筛选

  武建颖, 张燕, 孙贺贺, 赵玉兰, 董金皋, 申珅, 郝志敏

  蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)是真核细胞cAMP信号转导途径的核心元件,通过磷酸化多种活性蛋白调节丝状真菌的生长、发育及致病等生理过程。为明确玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica) PKA可能的互作蛋白,进一步解析其作用的分子机制,本研究以玉米大斑病菌cDNA作为模板,扩增StPKA-C1/2基因编码区的完整序列,构建pGS21T-StPKA-C1/2原核表达重组载体。利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统以异丙基β-D-硫代腺苷(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)作为诱导物诱导表达并通过亲和层析法纯化获得融合蛋白GST-StPKA-C1/2。通过GST pull-down实验筛选玉米大斑病菌中与StPKA-C1/C2有互作关系的蛋白质,利用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对所得蛋白质进行分析。结果表明,与StPKA-C1/2互作的蛋白中已有功能注释的蛋白包括催化活性蛋白、酶调节活性蛋白、运输活性蛋白、电子载体蛋白、分子伴侣蛋白、结构分子蛋白及代谢酶等。Venn分析发现,与StPKA-C1与StPKA-C2共有互作蛋白52个,仅与StPKA-C1互作的蛋白有17个,仅与StPKA-C2互作的蛋白有18个。其中,靶蛋白SETTUDRAFT_168881作为延伸因子(elongation factor G, EFG)家族中的一员,可能调控菌丝生长。靶蛋白SETTUDRAF_37808属于丝束蛋白(Fimbrin)家族,可能参与调控肌动蛋白细胞骨架、氧化应激反应和形态发生,推测StPKA-C1/2通过与这些靶蛋白相互作用发挥重要生物学功能。本研究初步明确了玉米大斑病菌StPKA-C1/2的潜在互作蛋白,为进一步解析玉米大斑病菌PKA调控病菌致病性的分子机制提供了理论基础。

• 基于基因缺失减毒单增李斯特菌的小鼠宫颈癌治疗性疫苗效果评估

  汪枫婷, 孙静, 刘晨, 程茵, 蒋昕, 祝艺然, 卫芳芳, 章先, 宋厚辉, 程昌勇

  减毒单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)作为一种安全高效的异源抗原递呈载体可用于肿瘤免疫治疗。缺失重要毒力基因是目前较为成熟的李斯特菌减毒策略。基因缺失减毒菌株ΔactAΔinlB (简称ΔAB)是其中一种较为成熟、安全的李斯特菌肿瘤免疫治疗疫苗载体。本研究旨在ΔAB基础上,利用肿瘤相关抗原与重要毒力因子融合表达的创新手段,构建一种能高效表达和递呈宫颈癌相关抗原E7的肿瘤疫苗载体(ΔAB-E7),以肿瘤生物学方法评估ΔAB-E7在小鼠(Mus musculus)宫颈癌模型中的免疫治疗效果。本研究利用细菌分子遗传操作技术构建ΔAB,在ΔAB基础上构建李斯特菌溶血素O (Listeriolysin O, LLO)和肿瘤抗原E7融合表达的ΔAB-E7;通过Western blot验证ΔAB-E7菌株中的E7抗原能否与LLO融合表达;利用细菌体外培养以及吞噬细胞内增殖实验研究体外生长能力,细胞内复制和增殖能力;通过小鼠脏器内细菌增殖实验评估ΔAB及ΔAB-E7在小鼠体内的增殖能力;构建小鼠宫颈癌模型,通过记录肿瘤模型在小鼠体内的生长趋势评价ΔAB-E7的免疫治疗效果。结果显示,ΔAB-E7菌株的E7抗原能与LLO融合表达并正常分泌;ΔAB及ΔAB-E7菌株在体外生长能力与野生型无显著差异,并且在吞噬细胞中保持稳定的增殖能力;ΔAB及ΔAB-E7感染小鼠后致病力显著下降,在小鼠脏器中的增殖能力显著降低,表明其毒力减弱,在小鼠感染模型中具有安全性;在小鼠宫颈癌模型中,ΔAB-E7免疫治疗组小鼠肿瘤的生长趋势明显较对照组更慢,表明ΔAB-E7抑制肿瘤生长,展现了良好的免疫治疗效果。本研究制备了一种基于减毒李斯特菌的小鼠宫颈癌治疗载体疫苗,为人类宫颈癌及其他恶性肿瘤的免疫治疗提供技术支持。

• 一株高效好氧反硝化菌DS2的分离鉴定及脱氮特性

  王贺, 衣萌萌, 王淼, 高风英, 可小丽, 曹建萌, 刘志刚, 卢迈新

  养殖水体中过量的氮元素会引起养殖环境恶化并严重影响养殖效益,生物脱氮是处理养殖水体氮污染的经济有效方法之一。为了获得高效的好氧反硝化菌,本研究以循环水养殖系统生物滤池填料为材料,分离获得1株高效好氧反硝化菌DS2 (GenBank No. PRJNA838789),经16S rRNA基因序列分析,结合生理生化特性鉴定,确定菌株DS2为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。采用单因素实验、脱氮实验和全基因组测序技术,研究菌株DS2的最佳生长条件、脱氮性能和脱氮机制。结果表明,菌株DS2在30 ℃、pH 7、250 r/min和盐度为10‰~20‰条件下生长状况最好;在异养硝化培养基(heterotrophic nitrification medium, HNM)、短程反硝化培养基(short-cut denitrification medium, SDM)、反硝化培养基(denitrification medium, DM)和同步硝化-反硝化培养基(simultaneous nitrification and denitrification medium, SNDM)中培养24 h后,总氮去除率分别为93.50%、55.60%、65.98%和90.10%;此外,菌株DS2基因组中存在narB、nirK、nirA、norB和nirB等与氮代谢相关的功能基因。最后,在实际养殖废水处理实验中,菌株DS2在12 h获得99.72%的硝酸氮去除率和89.52%的总氮去除率。本研究结果表明,恶臭假单胞菌DS2是一株高效的好氧反硝化菌,在养殖废水处理方面具有良好的应用前景。

• 内质网应激与氧化应激

  张雨欣, 周小杰, 于浩然, 董婉玉, 杨永春, 王晓杜, 周莹珊, 宋厚辉

  内质网是蛋白折叠的重要场所,对细胞稳态的变化十分敏感。蛋白折叠的环境发生变化会导致未折叠或错误折叠蛋白的聚集并影响细胞内信号通路,如Ca2+,氧化还原,炎症,凋亡等。当内质网发生应激,未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)通过一系列适应性反应来缓解蛋白错误折叠并恢复细胞稳态,如果不能重塑稳态,则会诱导凋亡。活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生被证实与内质网应激和未折叠蛋白反应有着密切的联系。ROS具有一定的毒性但也能作为信使分子介导生理过程。细胞质和不同的细胞器包括内质网和线粒体都会产生ROS。内质网中氧化还原状态的改变能够引起内质网应激,而内质网应激又能在内质网和线粒体诱导产生ROS。持续的氧化应激和内质网应激会启动凋亡程序。这些细胞反应在病毒感染中发挥了重要的作用。本文对内质网应激和氧化应激发生的机制、在诱导细胞凋亡中的相互联系、以及在动物病毒感染中发挥的作用进行了综述和展望。

• 去泛素化修饰在病毒侵染中的作用研究进展

  赵添羽, 韩成贵

  去泛素化修饰是泛素化修饰的逆进程,通过去泛素化酶(deubiquitinase, DUB)去除底物的泛素化修饰,进而调控各种生命进程。近年来,越来越多的报道表明去泛素化修饰能够调控病毒的侵染。本文从DUB的类型、作用特点、在体内的调控作用和在病毒侵染中的作用四个方面,综述了当前关于去泛素化修饰在植物病毒和动物病毒侵染中作用的研究进展,并就进一步深入研究去泛素化修饰在病毒侵染中的作用提出了对策建议。

• 超表达CD163的猪诱导性多能干细胞系构建

  岳威, 张炬庆, 杨昕淳, 吴晓龙, 沈巧艳, 于帅, 祝振硕, 王承宝, 张仕强, 华进联

  CD163作为清道夫受体蛋白,是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的最重要细胞受体。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是将外源转录因子导入体细胞后,经重编程获得的具有胚胎干细胞生物学特性的多能干细胞。本研究首先通过慢病毒载体系统将猪(Sus scrofa)源CD163基因转导入猪iPSCs (piPSCs),建立稳定表达CD163的诱导性多能干细胞系,将其命名为CD163OE-piPSC。病毒侵染实验证实,该细胞株对PRRSV高度易感。碱性磷酸酶染色和细胞群体倍增时间检测及5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine, EdU)细胞增殖检测证实,CD163基因过表达不影响iPSCs的多能性与增殖能力。本研究获得的细胞株可有效应用于PPRSV与宿主互作的致病机理研究及病毒性疾病的靶标分子筛选。

• 茄匍柄霉LAMP快速检测体系的建立及应用

  谢学文, 刘世程, 石延霞, 张胜丰, 陈利达, 柴阿丽, 范腾飞, 李磊, 李宝聚

  匍柄霉(Stemphylium solani)是一种重要的植物病原真菌,可侵染多种作物。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术具有简便、准确、快速等突出优点,在病原菌检测领域有广泛应用。本研究以SYBR GreenⅠ为指示剂,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-2-phosphate dehydrogenase, gpd)为检测靶标基因设计6条引物(2条内引物FIP/BIP, 2条外引物F3/B3, 环引物LF25/LB25)进行LAMP扩增,同时通过环引物加速反应,建立了一套茄匍柄霉LAMP快速检测体系。特异性验证结果显示,仅16株茄匍柄霉有阳性扩增,具有较高的特异性。灵敏度检测结果显示,该检测体系灵敏度达2.4 pg/μL,显著高于普通PCR检测技术。环引物加速LAMP反应结果表明,加入环引物能使反应时间缩短至27 min,可有效加速LAMP反应。通过钙黄绿素进行显色反应,在自然光下仅模板为茄匍柄霉的反应液变为绿色,其余反应液均为橙色。采用该体系检测茄匍柄霉接种后番茄(Lycopersicon esculentum)叶片病原菌含量动态变化,接种病原菌12 h时,该体系即有阳性显色反应,接种后颜色随时间推移逐渐加深,与接种病原菌后叶片发病情况的规律相同。该反应结果不借助其他仪器即可观察,环引物加速反应使检测时间进一步缩短至27 min,能够快速、准确反应病原菌含量。该体系在匍柄霉快速检测方面具有较强的优势,可用于病害潜伏、未显症期的快速检测,对及时、科学防治茄匍柄霉叶斑具有重要意义。

• 兔出血症病毒2型VP60蛋白特异性单克隆抗体的制备

  曾红梅, 庞雪晴, 唐诗, 杨泽晓, 罗燕, 王印, 姚学萍, 李丽

  兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease, RHD)又称兔瘟,是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)感染引起的兔(Oryctolagus cuniculus)急性出血性传染病。为制备RHDV2的特异性单克隆抗体(McAb),进而探索其与经典兔瘟病毒(RHDV)鉴别诊断技术,本研究原核表达纯化RHDV2 VP60蛋白(pET-32a-R2VP60蛋白)和RHDV VP60蛋白(pET-32a-R1VP60蛋白),以pET-32a-R2VP60蛋白免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),并分别以pET-32a-R1VP60蛋白与pET-32a-R2VP60蛋白为包被原建立特异性的RHDV2单克隆抗体筛选间接ELISA方法,采用常规杂交瘤细胞融合技术,通过克隆、亚克隆、腹水制备、效价测定、Western blot分析、血凝-血凝抑制试验以及亚型鉴定成功筛选出一株抗RHDV2的杂交瘤细胞株,命名为2A1。结果显示,2A1融合细胞的染色体约为100条,分泌IgG3亚型McAb,轻链为Kappa亚型;杂交瘤2A1的抗体分泌稳定,腹水纯化McAb效价高,特异性良好,其间接ELISA效价高达1∶128 000。Western blot分析显示McAb 2A1仅与RHDV2病毒粒子和pET-32a-R2VP60蛋白反应,与RHDV1病毒粒子和pET-32a-R1VP60蛋白反应阴性。血凝(hemagglutination, HA)与血凝抑制(hemagglutination inhibition, HI)实验表明2A1纯化McAb可有效抑制RHDV2的血凝作用,HI效价高达10log2。本研究制备的RHDV2特异性McAb 2A1,为RHDV2特异快速的血清学诊断方法建立和试剂盒研发提供了科学材料。