农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2021年第11期

• 茭白ZlRPM1.1和ZlPRM1.2基因克隆及其对菰黑粉菌菌丝侵染的响应

  晏牧熙, 崔海峰, 李帅, 赵金兰, 虞悦, 张雅芬, 俞晓平, 叶子弘

  茭白是我国重要水生蔬菜,是菰黑粉菌(Ustilago esculenta)菌丝侵染菰(Zizania latifolia)植株茎部而诱导形成的膨大肉质茎。RPM1 (resistance to pseudomonas maculicola 1)作为抗病相关基因,能够识别病原菌的入侵信号并激活植物自身的防卫反应。本研究从茭白提取基因组DNA,采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)方法克隆获得2个响应菰黑粉菌侵染的基因ZlRPM1.1 (GenBank No. KP729626)和ZlRPM1.2 (GenBank No. KP729627),经氨基酸序列比对推测其属于CC-NBS-LRR (coiled coil-nucleotide binding site-leucine rich repeat)类植物抗病相关基因,与栽培水稻(Oryza sativa)的同源基因遗传距离较近,ZlRPM1.1和ZlRPM1.2与栽培水稻的相似性分别为61%和79%。采用菰黑粉菌体外人工侵染菰植株幼苗,对茎部进行qPCR分析的结果显示,外源菰黑粉菌菌丝侵染能够显著诱导菰植株茎部ZlRPM1.1和ZlRPM1.2基因的增强表达。膨大发育初期不同膨大表型茎部的qPCR分析发现,2个ZlRPM1基因在充满菰黑粉菌孢子的灰茭中的表达量均显著高于正常茭白,可能与两种膨大表型茎部中T型与MT型菰黑粉菌菌丝的侵染能力相关。正常茭白茎部膨大发育期间的qPCR分析表明,茎部膨大发育中后期,2个ZlRPM1基因均有显著增强表达,并在茎部膨大发育至茎长15 cm时表达量最高;但ZlRPM1.2基因在茎部8叶期(膨大起始)表达量显著升高,茎部表达量显著高于叶片;而ZlRPM1.1基因在茎部膨大起始时表达量升高不显著,叶片表达量显著高于茎部。上述结果表明,2个ZlRPM1基因均参与菰黑粉菌菌丝侵染诱导的茎部膨大发育调节,其中ZlRPM1.2可能是菰茎部参与响应菰黑粉菌菌丝侵染的重要调节基因。本研究为深入探讨菰植株响应菰黑粉菌菌丝侵染及茎部膨大发育的调节机制提供参考依据。

• 祁连山高寒草地扁蓿豆和黄花棘豆耐冷PGPB的筛选及促生特性研究

  李明源, 王继莲, 姚拓, 王振龙, 张惠荣, 柴加丽, 刘晓婷, 李青璞

  耐冷的植物促生菌(plant growth-promoting bacteria, PGPB)对于研制在低温环境下应用的微生物菌肥具有重要意义。为获得具有耐低温能力的PGPB资源,本研究采用选择性培养基在15 ℃下从祁连山高寒草地2种优势豆科植物扁蓿豆(Melissitus ruthenica)和黄花棘豆(Oxytropis ochrocephala)根际和根内筛选固氮、解磷菌株,并定量分析菌株的固氮、解磷、分泌吲哚-3-乙酸(IAA)、合成铁载体和1-氨基环丙烷-1-羧酸(l-aminocyclopropane-l-carboxylic acid, ACC)脱氨酶等促生特性。结合16S rRNA的限制性片段长度多态性PCR技术(PCR-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)与16S rRNA基因测序方法进行菌种鉴定,并挑选促生性能突出的优良菌株接种祁连山退化天然草地补播主要牧草品种—垂穗披碱草(Elymus nutans)幼苗,验证其对垂穗披碱草在低温下生长的影响。结果共筛选到87株PGPB,其中45株在4 ℃仍有促生活性,所有菌株分属5个菌属,以假单胞菌属(Pseudomonas)占绝对优势,兼具2种以上促生功能的占63.22%。接种不同功能特性的PGPB对垂穗披碱草的地下部分(根长, 根表面积, 平均根直径, 根尖数, 根干重)和地上部分(株高, 茎粗, 茎干重)均表现出一定促生效果,接种固氮菌株和分泌IAA菌株的促生效果最突出。本研究筛选到的耐冷PGPB菌种资源具备在高寒地区农牧业生产中开发应用的潜力,对研制适用于青藏高原退化草地修复的微生物菌肥有重要意义。

• 马铃薯StERF109基因的生物信息学及表达分析

  王芳芳, 杨江伟, 朱熙, 李世贵, 刘维刚, 张宁, 司怀军

  乙烯响应因子(ethylene responsive factors, ERFs)属于APETALA2/乙烯响应因子(APETALA2/ethylene responsive factor, AP2/ERF)超家族,是植物中最大的转录因子家族之一。研究表明,ERFs参与植物的生长发育、信号转导、生物和非生物胁迫等多种生物学过程。为了研究马铃薯(Solanum tuberosum) StERF109基因(GenBank No. XM_006355301.2)的功能,本研究对其进行了生物信息学分析,构建了StERF109的亚细胞定位融合表达载体StERF109-EGFP,并对StERF109基因进行了定位;利用qPCR技术对StERF109进行了组织特异性表达分析。结果表明：StERF109含有1个典型的AP2结构域,为亲水蛋白,不含跨膜结构;亚细胞定位结果显示StERF109定位于细胞核和细胞膜上;组织差异性表达分析显示StERF109基因在马铃薯根中表达量最高,茎和叶中表达量存在品种差异,在干旱和盐胁迫下均上调表达,提示StERF109基因在干旱和盐胁迫中发挥重要功能。本研究为进一步深入研究马铃薯StERF109基因的功能提供了参考。

• 山葡萄F3'H基因及其启动子的克隆与表达分析

  张宇, 徐智慧, 任邵琦, 杨铭慧, 陈蒙, 刘海峰

  类黄酮-3'-羟化酶(flavonoid-3'-hydroxylase, F3'H)作为花青素合成路径第二阶段的关键酶,在花色苷的合成途径中至关重要。为探究F3'H在山葡萄(Vitis amurensis)花色苷形成中的作用机理,本研究以山葡萄品种'双红'为材料克隆得到F3'H基因及其启动子序列,对其进行了生物信息学和原核表达分析,并以F3'H基因不同长度缺失片段启动子转化烟草(Nicotiana tabacum)叶片进行瞬时表达。结果显示,F3'H基因ORF全长1 530 bp,启动子序列长1 051 bp。生物信息学分析发现,'双红'与'双丰'品种相比较,F3'H'的等电点、分子量和二级结构组成上有所差异。启动子顺式作用元件预测显示,启动子序列中除具有核心启动子元件 CAAT-box 和 TATA-box外,还有光响应元件及一系列与逆境胁迫、激素调节相关的元件。不同长度缺失片段启动子转化烟草叶片的瞬时表达结果显示,F3'H启动子随着缺失片段启动子长度的增加,GUS酶活性呈现上升的趋势。通过原核表达载体的构建发现,F3'H重组蛋白在条件分别为温度30 ℃,培养时间11 h,异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)浓度0.8 mmol/L的条件下,目的蛋白在上清液样品均中有与预测重组蛋白相对分子质量大小一致且较高浓度的表达带。本研究可为后续深入研究山葡萄F3'H基因在花色苷合成过程中的调控机理及启动子转录作用机理提供基础资料。

• 牛ATP10A基因组织特异性印记研究

  刘晓倩, 董艳秋, 靳兰杰, 谷书凯, 李冬杰, 李世杰

  基因组印记是存在于哺乳动物中的一种重要的表观遗传修饰机制,与生物体的生长发育密切相关。ATP10A (ATPase phospholipid transporting 10A)基因位于PWS/AS印记区域的一端,该印记区域与人类(Homo sapiens)的PWS (Prader-Willi syndrome)综合征和AS (Angelman syndrome)综合征发生有关。ATP10A基因在人中表现为大脑特异性的印记基因,而在牛(Bos taurus)中的印记状态未见报道。本研究首先对32头牛心脏组织和15个牛胎盘基因组DNA进行PCR扩增,通过产物直接测序鉴定基因组中的单核苷酸多态位点,在牛ATP10A基因外显子20上鉴定出A/G杂合的SNP位点(rs136134264)。然后对杂合子牛各组织及胎盘总RNA进行RT-PCR,产物测序结果与上述杂合SNP位点进行对比,确定了ATP10A基因在牛大脑组织中为单等位基因表达,而在其他组织和胎盘中为双等位基因表达。进一步利用亚硫酸氢盐测序法,分析ATP10A基因启动子区在牛组织和胎盘中的DNA甲基化状态,发现所检测区域的46个CpG位点在牛组织和胎盘中均呈现轻甲基化状态,说明ATP10A基因启动子区的DNA甲基化修饰不参与调控ATP10A基因在牛中的印记表达。本研究可为深入探讨牛ATP10A基因功能和印记的分子机制提供参考依据。

• 不同绒细度的西藏绒山羊皮肤组织miRNA分析与鉴定

  付雪峰, 赵冰茹, 索朗达, 巴贵, 德吉, 阿旺措吉, 吴玉江, 田可川

  微小核糖核酸(microRNA, miRNA)作为重要的基因调控元件,在多种哺乳动物皮肤及毛囊中均有表达,并在转录后水平调节皮肤和毛发的生长和发育过程。本研究旨在对西藏绒山羊(Capra hircus)皮肤组织miRNA进行分析与鉴定,探讨miRNA在绒毛纤维直径性状中可能发挥的作用及调控机制。分别选取细绒(平均纤维直径(12.04±0.03) μm)和粗绒(平均纤维直径(14.88±0.05) μm)的西藏绒山羊各4只,对肩胛部皮肤组织提取RNA建立文库进行高通量测序。对原始序列进行过滤,并与参考基因组(ARS1)比对;根据miRBase中已知miRNA和参考基因组中其他非编码RNA (non coding RNA, ncRNA)的位置信息,对miRNA和其他小RNA进行鉴定,筛选出不同绒毛细度的西藏绒山羊皮肤组织差异表达miRNA,并进行靶基因预测及功能分析;进一步利用qPCR验证5个miRNAs与测序结果的一致性。结果表明,每个样本至少获得20.09 M条原始读长,过滤后至少得到19.46 M条有效读长(clean reads),共鉴定出426个已知miRNAs和119个新miRNAs;筛选获得12个差异表达miRNAs,其中5个miRNAs在细绒型西藏绒山羊皮肤组织中显著上调表达,7个miRNAs显著下调表达;差异表达miRNAs共预测到621个靶基因,KEGG分析显示靶基因富集到B细胞受体信号通路、FcεRI信号通路、T细胞受体信号通路等生物学通路中;同时,选取的5个miRNAs的qPCR验证结果与测序分析的表达趋势一致。本研究结果提示,西藏绒山羊的绒细度可能受不同miRNAs调控,这些miRNAs进一步影响靶基因的表达并参与调控不同的信号通路。本研究为深入揭示调控山羊绒细度的miRNAs和相关信号通路提供参考依据。

• 鸡脂肪细胞因子NRG4基因的克隆、表达及启动子分析

  郭亚琦, 王伟佳, 高智慧, 牟芳, 徐海冬, 李辉, 王宁

  神经调节蛋白4 (neuregulin-4, NRG4)是在哺乳动物棕色脂肪组织高度表达的一个细胞因子。NRG4激活ErbB4信号通路参与调控能量平衡和糖脂代谢等。由于鸡(Gallus domesticus)缺乏棕色脂肪组织,目前鸡NRG4的组织表达和功能还不清楚。本研究以鸡脂肪组织cDNA为模板,PCR扩增了NRG4基因全长编码区序列,构建了NRG4真核表达载体;以东北农业大学高、低脂双向选择品系肉鸡(NEAUHLF)为实验材料,采用qPCR方法开展了高、低脂系肉鸡NRG4基因的组织表达谱分析;以基因组DNA为模板,PCR扩增了鸡NRG4基因的4个启动子区片段,构建了其启动子报告基因载体,并进行了启动子片段的活性分析。结果显示,鸡NRG4基因编码一个由112个氨基酸组成的蛋白,鸡与人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus) NRG4氨基酸序列的相似度均较低,分别为57.76%和52.59%。组织表达谱分析显示,鸡NRG4基因在多种组织中表达,其中在肾脏的表达量最高,而在脾脏的表达量最低。高、低脂系肉鸡脂肪组织表达差异分析显示,NRG4基因在高脂系肉鸡嗉囊周围脂肪组织、腹部脂肪组织及肌胃周围脂肪组织中的表达水平都显著高于低脂系肉鸡(P<0.01或P<0.05)。生物信息学分析结果表明,鸡与人和小鼠NRG4基因启动子序列的相似度都很低,但均存在PPARγ和C/EBPα结合位点。启动子报告基因活性检测结果显示,与pGL3-basic空载体相比,NRG4启动子报告基因载体pGL3-NRG4 (-2854/-2076)、pGL3-NRG4 (-1451/+117)均具有较强启动子活性(P<0.01或P<0.05)。本研究为进一步开展鸡NRG4基因在鸡脂肪生成和脂肪组织发育中作用和机制的研究奠定了基础。

• 静原鸡和浦东鸡肌肉组织中肌苷酸特异性沉积相关基因的表达模式

  张娟, 禹保军, 朱继红, 虎红红, 王卫振, 蔡正云, 顾亚玲, 辛国省

  肌苷酸(inosine monophosphate, IMP)作为肉质风味的重要物质基础,已经成为评价肉质鲜味和新鲜程度的重要指标。为探究静原鸡(Gallus gallus)和浦东鸡肌肉组织肌苷酸沉积过程中关键调控基因的作用,为品种间肌肉品质研究提供理论支持,本研究在测定静原鸡和浦东鸡肌苷酸、肌苷及部分物理指标的基础上,通过转录组测序筛选两个品种间与肉质相关的差异表达基因,采用qPCR方法检测与细胞周期蛋白A1相互作用的蛋白质(protein interacting with cyclin A1, PROCA1)和体轴抑制蛋白1 (axis inhibition protein 1, AXIN1)基因在静原鸡和浦东鸡胸肌组织中的表达差异。结果表明,静原鸡肌苷酸含量高于浦东鸡,静原鸡和浦东鸡胸肌肌苷酸含量均显著高于腿肌(P<0.05)。根据转录组测序结果,在甘油磷脂代谢途径、花生四烯酸代谢、Wnt (wingless/Integrated)信号通路中筛选出两个品种间差异表达基因PROCA1和AXIN1。qPCR结果分析显示,静原鸡胸肌组织中PROCA1和AXIN1基因的表达量均高于浦东鸡,其差异表达趋势与转录组测序结果一致。综上,PROCA1和AXIN1基因可能为静原鸡和浦东鸡肌肉组织中影响肌苷酸特异性沉积的候选基因,研究结果为进一步探究PROCA1和AXIN1基因调控机制提供参考。

• 鸡Chemerin基因的真核表达载体构建与启动子转录效率分析

  王鹏, 殷晓航, 谢垚垚, 陈曼雨, 张景, 路青爽, 钱丹凤, 徐璐, 郁建锋, 顾志良

  Chemerin是由脂肪组织分泌的脂肪因子,可以调节脂肪细胞的代谢和免疫应答等生物学过程。本研究以鸡(Gallus gallus)肝脏组织总RNA为模板,采用逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)方法获得鸡的Chemerin基因全长cDNA序列,应用qPCR检测鸡Chemerin基因mRNA在不同组织中的表达情况;构建Chemerin-Myc真核融合表达载体并转染LMH (Leghorn male hepatoma)细胞,用Western blot检测Chemerin-Myc融合蛋白表达情况;通过启动子片段截短实验,构建双荧光素酶报告基因载体,检测鸡Chemerin基因不同长度启动子片段的转录效率。结果表明,成功克隆鸡Chemerin基因,其cDNA全长为733 bp,编码162个氨基酸,其中5'UTR长度为55 bp,3'UTR长度为189 bp;Chemerin基因主要在肝脏、肾脏和脂肪组织中表达;成功构建真核融合表达载体pCMV-3Tag-9-gga-chemerin-Myc,转染鸡LMH细胞后,经Western blot检测发现,成功实现Chemerin和Myc的融合表达;构建的pGL3b-chemerin-F1/F2/F3/F4四个报告基因载体均显示荧光素酶活性比对照组极显著增加(P<0.01),F1和F3启动子中段的转录效率最高,pGL3b-chemerin-F1中的KLF5 (Kruppel-like factor 5)结合位点定点突变后,pGL3b-chemerin-mutF1的荧光素酶活性极其显著降低(P<0.001),在LMH细胞中干扰KLF5表达基因后,Chemerin基因的表达量极显著下降(P<0.01),初步证明在鸡Chemerin基因启动子区F1片段中存在正调控因子KLF5结合的顺式元件。本研究为进一步探讨鸡的Chemerin基因的功能提供了基础资料。

• 金定鸭生长分化因子9 (GDF9)基因多态性及其与产蛋性能的相关分析

  秦玉萍, 操勇清, 芦治学, 周玮, 林玉梅, 刘国发, 李国勤, 曾涛, 李昂, 卢立志

  生长分化因子9 (growth differentiation factor 9, GDF9)是由卵母细胞分泌的生长因子,参与调控哺乳动物的卵巢发育,但在禽类中的研究较少。为研究金定鸭(Anas platyrhynchos domestica) GDF9基因的SNPs,找出与产蛋性能相关的分子标记,本研究采用直接测序的方法,检测GDF9基因在458只金定鸭母鸭中的SNPs,并分析各个多态位点的不同基因型与金定鸭开产日龄和300日龄产蛋量的相关性。结果显示,金定鸭外显子1和外显子2上共发现10个突变位点,其中有6个位点为错义突变位点,所有位点均具有3种基因型;遗传学分析显示,7个位点为中度多态(0.25<PIC<0.5),Hardy-Weinberg平衡检验显示位点C344T和G557A处于平衡状态(P>0.05);连锁不平衡分析结果显示,10个位点间不存在完全连锁不平衡;多态位点与产蛋性能的相关性分析显示,位点C2111T和G2261T与300日龄产蛋量显著相关(P<0.05),位点T2345C和C2390T与开产日龄显著相关(P<0.05)。综上所述,GDF9基因的这10个位点可作为金定鸭产蛋性能选择的遗传标记,为标记辅助选择提供参考依据。

• 雌二醇对鹅等级卵泡颗粒细胞的效应分析

  苏行, 兰刚, 胡深强, 欧阳清渊, 甘翔, 陈禧, 王继文

  雌二醇(estradiol, E2)对颗粒细胞的生长发育起着重要的调控作用,为探究不同浓度雌二醇对鹅(Anser cygnoides domestica)等级卵泡颗粒细胞(hierarchical follicle granulosa cells, HFGCs)的影响及其效应,本研究将'天府'肉鹅母系母鹅等级卵泡颗粒细胞随机分为实验组(E5, E7, E9)和对照组(NC),使用不同浓度(1×10-5, 1×10-7和1×10-9 mol/L)雌二醇处理实验组颗粒细胞。处理结束后,收集样品分别用于MTT法检测细胞活性、油红O染色检测细胞脂质沉积和转录组测序分析。MTT结果显示,实验组的细胞活性均显著高于对照组(P<0.05);油红O染色结果显示,随着E2浓度的降低,颗粒细胞脂质沉积减少,E2浓度为1×10-9 mol/L时差异显著(P<0.05);转录组测序分析结果显示,E5、E7、E9与NC比较,在差异倍数(fold change, FC)>1.2或<0.83且P<0.05的条件下,分别筛选到267、79、162个差异表达基因;KEGG富集分析结果显示,差异表达基因分别显著富集于鞘脂代谢、胰岛素信号和Wnt信号、ABC转运蛋白等通路中。鞘脂代谢通路中的3-酮二氢鞘氨醇还原酶(3-ketodihydrosphingosine reductase, KDSR)、神经酰胺合酶6 (ceramide synthase 6, CERS6)及神经酰胺合酶4 (ceramide synthase 4, CERS4),胰岛素和Wnt信号通路中丝裂原活化蛋白激酶8 (mitogen-activated protein kinase 8, MAPK8)、肌醇多磷酸磷酸酶样1 (inositol polyphosphate phosphatase like 1, INPPL1)及硬骨素(sclerostin, SOST)均参与调控颗粒细胞活性;鞘脂代谢及ABC转运蛋白通路中的半乳糖-3-O-硫转移酶1 (galactose-3-O-sulfotransferase 1, GAL3ST1)、鞘氨醇-1-磷酸裂解酶1 (sphingosine-1-phosphate lyase 1, SGPL1)、ATP结合盒亚家族A成员2 (ATP binding cassette subfamily A member 2, ABCA2)及ATP结合盒亚家族A成员5 (ATP binding cassette subfamily A member 5, ABCA5)在E2浓度为1×10-9 mol/L时参与调控颗粒细胞脂质沉积。研究结果表明,外源E2处理通过影响鞘脂代谢、胰岛素信号、Wnt信号及ABC转运蛋白通路中相关基因的表达水平提高了鹅等级卵泡颗粒细胞活性并抑制了脂质沉积,此结果为探究雌二醇调控鹅卵泡颗粒细胞生长发育的分子机制研究提供了基础资料。

• 基于重组毕赤酵母的鲫鱼c型溶菌酶生物合成及其特性

  宋玉芳, 陶妍, 谢晶, 钱韻芳

  c型溶菌酶是鲫鱼(Carassius auratus)先天性免疫机制中的关键性免疫蛋白,是绿色饲料添加剂或天然抗菌剂开发的良好候选者。本研究通过反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)技术克隆鲫鱼c型溶菌酶的cDNA,再经3次PCR获得目的基因CrCLm (crucian carp c-type lysozyme mature peptide)。以pPICZɑA为表达载体、毕赤酵母(Pichia pastoris) X-33为工程菌,构建重组菌株X-33/pPICZɑA-CrCLm;在初始pH 6、28 ℃和250 r/min条件下,以1.0%甲醇诱导重组菌株表达96 h;表达产物经镍离子亲和层析纯化后进行Western blot分析和LC-MS/MS质谱鉴定。另外,对重组菌株产物的抑菌活性和稳定性进行分析,结果显示,在上述发酵培养条件下获得18.3 mg/L重组蛋白,纯化后的质谱分析显示其为重组CrCLm (预期分子量为14.5 kD)。抑菌试验显示,重组CrCLm对革兰氏阳性菌—蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(B. subtilisi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)以及革兰氏阴性菌—大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有明显的抑菌活性;不同酸性环境和高温处理后并不影响其抑菌活性;此外,重组CrCLm对胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的水解具有良好的耐受能力。本研究为鲫鱼c型溶菌酶的规模化制备及应用提供技术支持。

• 西伯利亚蝗酚氧化酶原2 (PPO2)基因的克隆及表达分析

  阿地拉·阿吉, 廖杰杰, 马爱霞, 魏笑佳, 叶小芳, 季荣, 扈鸿霞

  虫酚氧化酶(phenoloxidase, PO)是一类重要的免疫效应分子,属于3型铜蛋白家族,具有氧化还原酶活性。PO通常以其非活化状态的前体酚氧化酶原(prophenoloxidase, PPO)的形式存在于昆虫血淋巴中,经蛋白酶水解激活催化黑色素合成和酚类氧化成醌。西伯利亚蝗(Gomphocerus sibiricus)是新疆高山、亚高山草原地区的优势种。本研究采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆了西伯利亚蝗PPO2基因的全长cDNA序列。该序列全长2 439 bp (GenBank No. KY981766);生物信息学分析结果显示PPO2基因与东亚飞蝗(Locusta migratoria)和红褐斑腿蝗(Diabolocatantops pinguis)的酚氧化酶原的同源性最高;有两个铜绑定位点及保守的组蛋白残基,具有保守的酪氨酸酶结构域和蛋白水解酶的作用位点。PPO2基因表达分析结果表明,该基因主要在成虫后肠表达,其次为中肠,在蝗虫马氏管和唾液腺中的表达没有差异,在脂肪体中表达最少。本结果为研究PPO在蝗虫体内的组织分布及免疫防疫功能提供了基础数据。

• 福建省甜玉米小斑病菌群体遗传结构和致病性分析

  代玉立, 甘林, 廖蕾, 滕振勇, 卢学松, 杨秀娟

  由异旋孢腔菌(Cochlibolus heterostrophus)引起的玉米小斑病(southern corn leaf blight, SCLB)是严重影响玉米(Zea mays)产量和品质的叶部真菌病害。为明确福建省甜玉米小斑病菌不同地理群体的群体遗传结构和致病性,本研究采用简单序列重复区间扩增多态性(inter-simple sequence repeat, ISSR)分子标记技术和致病性测定法分析福建省7个甜玉米小斑病菌群体(南平, 宁德, 福州, 三明, 莆田, 龙岩和漳州)的遗传结构和致病性。利用优化的13条ISSR引物共扩增出198个位点,DNA多态性位点比例(percentage of polymorphic loci, PL)为100.0%,福州群体的DNA多态性水平最高(PL=73.7%),龙岩和漳州群体的DNA多态性水平最低(58.6%和56.6%);从福建省7个地理群体中共检测到126个多位点单倍型(multilocus haplotype),未检测到共享单倍型,南平群体的多位点单倍型多样性(multilocus haplotype diversity, HS)最丰富(HS=0.323),龙岩群体的单倍型多样性较低(HS=0.157)。南平与宁德、莆田与三明以及龙岩与漳州两两群体间的遗传分化水平较低(ΦPT<0.088),群体内基因交流频繁(Nm>5),而其他群体间的遗传分化水平较高。遗传相似系数为0.768时,福建省126个多位点单倍型菌株被划分为8个遗传类群,相同地理来源的菌株相对较集中。分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)显示群体内和群体间的遗传变异分别占总变异的81.9%和18.1%,表明福建省玉米小斑病菌群体遗传分化主要来源于群体内。主坐标(principal coordinates analysis, PCoA)和群体遗传结构分析表明福建省玉米小斑病菌分为2个遗传类群。致病性测定表明,7个地理来源病菌群体对4个抗感甜玉米品种均有较强的致病性,平均病情指数范围为36.42~59.23。病菌的致病力与菌株个体、地理来源以及玉米品种间存在极显著的差异(P<0.001),但是,其致病力与菌株×品种(P=0.999)以及地理来源×品种(P=0.361)互作因子间在99%水平上的差异不显著。本研究为深入研究玉米小斑病菌的遗传变异及其抗病育种提供了理论参考。

• 大丽轮枝菌VdKeR基因的克隆及功能分析

  陈睿, 李彪, 王媛, 黄家风

  由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病(cotton verticillium wilt)是威胁我国棉花(Gossypium hirsutum)生产的一种重要土传真菌维管束病害。本研究从棉花黄萎病菌强致病力菌株V592的基因组中克隆得到大丽轮枝菌的一个假定蛋白基因全长;根据同源重组原理和农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化获得该基因的敲除突变体及其互补菌株,并对突变体表型、致病力进行了分析,利用逆转录荧光定量PCR (reverse transcription qPCR, RT-qPCR)对其他4个致病相关基因的表达情况进行了研究。结果显示,该基因全长1 439 bp,编码蛋白含有Kelch重复结构域和1个半乳糖氧化酶结构域,Kelch重复形成6叶螺旋桨结构,因编码蛋白含有Kelch重复(Kelch repeat, KeR),将该基因命名为VdKeR (GenBank No. MZ855770)。与野生型菌株V592和互补菌株相比,VdKeR基因敲除导致棉花黄萎病菌在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基上的菌落生长速率降低、气生菌丝增多、产孢量减少、对棉花的致病力下降;RT-qPCR分析结果表明,VdKeR基因敲除后,cAMP依赖的蛋白激酶PKA的C亚基基因(C subunit gene of cAMP-dependent protein kinase A, VdPKAC1)、G蛋白β亚基基因(G protein β subunit gene, VGB)、类Nep1蛋白(necrosis-and ethylene-inducing-proteins (Nep1)-like protein, NLP)家族基因VdNLP1和VdNLP2的表达量降低。本研究表明,VdKeR基因与棉花黄萎病菌生长发育和致病性有关,并影响其他致病相关基因的表达。研究结果为深入研究大丽轮枝菌致病机制提供了基础资料。

• 长非编码RNA基因MEG3在肿瘤发生、发展和诊断中的作用

  刘晓倩, 董艳秋, 靳兰杰, 李冬杰, 李世杰

  长非编码RNA (lncRNA)作为一种重要的调节因子,参与调控细胞的各种正常生理过程,并在肿瘤的发生发展中发挥作用。母源等位基因表达的MEG3 基因(maternally expressed gene 3),位于人(Homo sapiens)14号染色体q32.2的DLK1-DIO3印记区域内,34.9 kb的基因编码长度大约为1.6 kb的lncRNA。MEG3基因在多种癌变的组织和细胞中表达缺失或下调,表现出抑癌功能。MEG3通过调控肿瘤抑制基因和癌基因,如与p53、RB、MYC和TGF-β相互作用,从而调控肿瘤的发生。MEG3基因还通过调控Wnt-β-catenin信号通路,影响上皮-间质的转化。此外,位于MEG3基因位点的甲基化修饰和多态位点也与患癌的风险以及药物的治疗效果有关。本文针对MEG3基因在肿瘤发生中的作用机制,以及MEG3基因在作为癌症诊断和预后的生物标志物,以及作为治疗的靶标中的价值进行了论述。本文为后续研究MEG3在人类肿瘤治疗中的作用提供基础。

• 玉米黑粉菌效应因子研究进展

  夏文强, 高丽丹, 张雅芬, 俞晓平, 叶子弘

  玉米黑粉菌(Ustilago maydis)专性寄生玉米(Zea mays)及其野生祖先类蜀黍,菌丝型营严格的活体寄生。由于其易于人工培养和遗传转化等特点作为模式生物受到广泛研究。玉米黑粉菌与寄主植物建立了复杂的互作关系。其最大特点是玉米黑粉菌可以分泌数量庞大的效应因子,这些效应因子具有抑制植物防御反应、调控植物代谢、促进植物组织膨大等功能,使寄主植物更有利于玉米黑粉菌的生长与发育。由于缺少可识别的结构域,并且效应因子间存在功能冗余,效应因子的功能鉴定十分困难。得益于近期快速发展的高通量测序技术,基因表达、遗传进化等多角度联合比较分析极大促进了效应因子的相关研究。本文总结了近年来关于玉米黑粉菌效应因子的生物功能、表达调控以及翻译后修饰等方面的研究,重点讨论了效应因子在阻止细胞壁强化、抑制活性氧 (reactive oxygen species, ROS)累积与细胞程序性死亡、调控植物激素代谢以及诱导植物组织膨大等过程中的作用与机制。本文有助于更好地分析和理解活体营养型真菌侵染策略,为鉴定相关效应因子提供参考。

• 转基因棉花COT102品系双重定量检测方法研究

  潘志霖, 左翠花, 吴启明, 钱昌元, 尹璐, 刘月明, 李想

  棉花(Gossypium hirsutum)是一种重要的经济作物,截至2019年底,全球转基因棉花的种植面积占棉花总种植面积的76%。瑞士先正达公司研发的具有抗虫性状的转基因棉花COT102品系已获得我国批准,但目前我国相关检测标准中均缺乏该品系的检测方法。为了保障我国棉花产业的顺利发展和进出口贸易的有序进行,针对转基因棉花COT102品系,建立行之有效的检测方法至关重要。本研究基于多重实时荧光PCR技术,根据转基因棉花COT102品系外源插入片段与基因组DNA的两端旁邻序列设计多套引物和探针,经对反应条件、引物探针比例等指标进行筛选和优化后,建立了转基因棉花COT102品系特异性双重实时荧光定量PCR检测方法。对方法的特异性、灵敏度及可重复性进行测定,结果显示,该方法特异于转基因棉花COT102品系检测,无非特异性扩增;方法的灵敏度高,检测下限和定量下限均低至5拷贝棉花基因组DNA;多次PCR扩增重复之间偏差小,可重复性好。对4个含有不同百分比含量转基因棉花COT102品系成分的样品进行定量检测,结果表明,百分比含量测定值与设定的真实值间的偏差(bias)介于-0.42%~4.63%之间,标准偏差(standard deviation, SD)小于0.5,相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)小于25%,均在可接受范围内。因此,本研究建立的双重实时荧光定量PCR检测方法,适用于棉花及其制品中转基因棉花COT102品系成分的定性和定量检测。高通量检测方法可有效提升检测效率,降低检测成本,提升通关效率,为进境转基因棉花及其制品的有效监管和我国转基因产品标识制度的顺利实施提供有效的技术支撑,为进出口贸易的顺利有序进行提供必要的技术保障。

• EMS诱变创制小麦叶锈病菌致病性变异菌株

  韦杰, 周宗悦, 齐悦, 张娜, 孟庆芳, 杨文香

  小麦叶锈病是小麦(Triticum aestivum)的主要病害之一,创建小麦叶锈菌(Puccinia triticina, Pt)的单碱基突变体对于毒性基因及致病机制的研究具有重要意义。为此,本研究以甲基磺酸乙酯(ethyl methyl sulfonate, EMS)为诱变剂,筛选小麦叶锈菌突变菌株。结果发现,以0.04 mol/L的EMS处理小麦叶锈菌夏孢子8 min可以抑制夏孢子萌发,抑制率达到83.69%。采用该方法对小麦叶锈菌2008-5-9-2 (KHHT)、2013-5-72-1 (THSN)、2013-5-28-1 (JHKT)和2017-8-1465 (PHST)进行EMS诱变,经过处理的20个菌株中,19株遗传稳定的菌株致病表型发生改变,突变率达到95%。用18个小麦抗叶锈病近等基因系检测突变菌株的侵染型,发现突变菌株在15个小麦抗叶锈病近等基因系上的侵染型发生改变,其中获得了对小麦抗叶锈基因24 (leaf rust resistance gene 24, Lr24)表现高毒的突变菌株Mu2008-5-9-2②及对Lr2a、Lr14a、Lr16、Lr17和Lr33表现低毒的突变菌株Mu2013-5-28-1④、Mu2008-5-9-2②、Mu2008-5-9-2④、Mu2008-5-9-2⑤、Mu2013-5-28-1③、Mu2013-5-28-1⑥、Mu2013-5-28-1①和Mu2013-5-28-1②。本研究为今后开展小麦叶锈菌突变位点的分析及对Lr24、Lr2a、Lr14a、Lr16、Lr17和Lr33对应无毒基因的研究提供基础材料。