农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2022年第11期

• 大豆醛酮还原酶超家族的鉴定及表达分析

  厉苏宁, 赵现伟, 孙丽萍, 赵朝森, 王瑞珍, 郭兵福

  醛酮还原酶(aldo keto reductases, AKRs)广泛分布于动植物中,与外源性和内源性毒素代谢有关,包括应激刺激产生的有毒物质,在类固醇、糖和其他羰基代谢中发挥着重要作用。目前已经在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)等植物中报道了一些参与逆境胁迫的AKR基因,但大豆中相关研究仍较少。本研究采用生物信息学方法和qPCR技术对大豆(Glycine max) AKR家族成员进行全基因组鉴定及表达特征分析。在大豆基因组中共鉴定到44个醛酮还原酶GmAKR基因,其编码的蛋白均具有Aldo-ket-red结构域。系统进化分析显示,GmAKR基因可以聚为5个家族,不均匀地分布在大豆的16条染色体上。GmAKR各成员启动子区域均存在数量不等的光响应、激素和逆境响应顺式作用元件,表明该家族基因可能参与大豆的多种生长发育调节过程。基因表达分析结果验证了GmAKR基因在不同组织中的表达模式,与Phytozome数据库收入结果基本一致。本研究为深入揭示大豆AKR家族基因的生物学功能提供了参考。

• 大白菜黄子叶突变体的遗传分析及其基因定位

  张妮南, 薛一花, 吴俊清, 和禹廷, 王亚秀, 张学芬, 刘小愿, 张鲁刚

  大白菜(Brassica rapa ssp. pekinensis)原产于中国,属于十字花科芸薹属二年生草本植物,是我国栽培面积最大的一种蔬菜作物。本研究以课题组前期在普通大白菜与紫心大白菜杂交后代中发现的黄子叶突变体,经自交分离获得了遗传稳定的黄子叶纯系(19YC-2)为研究对象,与正常绿子叶近等基因系(19GC-2)杂交构建F1和F2群体为实验材料,对大白菜黄子叶突变体进行遗传分析及基因定位。表型观测表明,黄子叶纯系与正常绿子叶近等基因系杂交的F1植株子叶表型均为正常绿色,F2群体中绿子叶单株数比黄子叶单株数符合3∶1分离规律,说明黄子叶突变是由单隐性核基因控制的质量性状。进一步用混合分离群(分组)分析法(bulked segregant analysis, BSA)筛选双亲多态性SSR引物,将黄子叶基因定位在大白菜A06连锁群上,通过在定位区间加密设计SSR引物,将黄子叶基因(Brassica rapa yellow cotyledon, Bryc)定位于SSR280-23和SSR280-39两个标记之间,遗传距离分别为0.04和0.96 cM, 物理距离为83.9 kb。本研究通过对大白菜黄子叶突变体进行遗传分析和基因定位,为黄子叶基因Bryc的克隆及其分子机理研究奠定基础。

• 海岛棉GbPIN1a基因的克隆与表达特性分析

  龙遗磊, 郑凯, 齐静潇, 蔡永生, 邓晓娟, 曲延英, 陈全家

  植物生长素转运蛋白之一的PIN针状蛋白(PIN-formed acicular protein, PIN)影响棉花(Gossypium spp.)纤维的品质。研究海岛棉(G. barbadense) GbPIN1a (GenBank No. KAB2059844.1)基因在棉纤维中的表达特征,可为今后探究棉花纤维品质发育机理提供参考。本研究借助PCR技术克隆该基因,进行生物信息学分析,构建了含GFP的瞬时表达载体,进行细胞定位分析。研究发现GbPIN1a基因编码区全长1 758 bp,编码585个氨基酸,氨基酸序列包含2个Mem trans保守结构域;GbPIN1a基因在纤维发育的15、20 DPA (开花后天数, days post anthesis)呈现高表达趋势且与同时期的生长素含量呈显著负相关(P<0.05);在根和茎中的表达量显著高于叶(P<0.05),存在组织特异性;在受到外源植物生长素刺激的情况下表达量会出现波动;表达产物被定位于细胞膜上。本研究结果初步表明GbPIN1a基因可能参与调控棉花的纤维发育,为今后研究PIN1a基因提供基础资料。

• 棕色棉R2R3-MYB类转录因子基因GhTT2的克隆及特征分析

  梅俊, 慕蓉蓉, 牛晴晴, 王晓丽, 赵艳艳, 蔡芳芳, 孙玉强

  彩色棉花包括棕色棉和绿色棉,天然具有颜色,无需化学印染即可直接纺纱成衣,是一种绿色环保、生态效益高的特种陆地棉(Gossypium hirsutum)。彩色纤维主要因不同花青素、原花青素及其衍生物累积于纤维而呈现不同色泽,而棕色棉纤维中主要色素成分为原花青素及其衍生物。基于前期转录组数据,本研究从棕色棉中克隆了1个在纤维发育过程中优势表达的R2R3-MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog, MYB)类转录因子基因GhTT2 (transparent testa 2);通过系统进化树构建、氨基酸序列多重比对、原核表达、qRT-PCR、烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时转化、酵母(Saccharomyces cerevisiae)杂交等对其基因及编码蛋白的结构、表达模式、亚细胞定位进行分析与功能预测。结果表明,GhTT2基因的开放阅读框为765 bp,编码254个氨基酸,预测蛋白的相对分子质量为28.863 kD,等电点为7.423, 具有典型的R2R3类MYB结构域;该基因可以在 37 ℃、1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导条件下高效表达;与白色棉相比,GhTT2在棕色棉纤维发育过程中优势表达,而且在纤维中的表达量显著高于其他组织;与GFP融合的重组蛋白GhTT2-GFP定位在细胞核,符合典型的转录因子特征;酵母转化结果表明,GhTT2编码蛋白具有明显的转录激活特征。本研究为进一步从分子层面验证GhTT2基因在棕色棉纤维色泽形成过程中的生物学功能及改良彩色棉纤维色泽多样性提供基础资料。

• 基于RAD-seq的西番莲系统进化分析及种间SSR标记开发

  田青兰, 刘洁云, 黄伟华, 夏秀忠, 杨行海, 覃柳燕, 张英俊, 牟海飞, 吴艳艳

  西番莲(Passiflora spp.)是中国南方重要的果树,其种间进化关系尚不清楚,且缺乏通用性分子标记。本研究基于酶切位点相关DNA测序(restriction site-associated DNA sequencing, RAD-seq)技术对西番莲属6个种共10份种质的系统进化、SSR位点及标记通用性进行了研究。结果表明：EcoRⅠ是西番莲基因组简化测序较为适应的酶;依据剩余读长数/读长数,以'紫果7号' (P. edulis)(P4)的部分组装序列为参考基因组,利用检测到的46 451个高质量SNPs构建系统发生树,结果显示,蓝冠西番莲(P. caerulea)(P6)、红花西番莲(P. coccinea)(P7)、版纳西番莲(P. xishuangbannaensis)(P8)和大果西番莲(P. quadragularis)(P9)为一支,绿皮百香果(P. edulis)(P5)和哥伦比亚激情果(P. ligularis)(P10)为一支,金陵紫果(P. edulis)(P1)、芭乐味黄金果(P. edulis var. flavicarpa)(P2)、云南黄果原生种(P. edulis var. flavicarpa)(P3)和'紫果7号'在亲缘关系上更近;以版纳西番莲为参考基因组,利用12 452个高质量SNPs构建系统发生树,云南黄果原生种、'紫果7号'、红花西番莲、版纳西番莲、大果西番莲和哥伦比亚激情果都单独为一支,金陵紫果和芭乐味黄金果聚为一支,绿皮百香果和蓝冠西番莲聚为一支;在10份西番莲种质的基因组中共鉴定到2 614个SSR,其核心基序为AT、GA和AAG等2~6个碱基,重复数为4~16次,并成功开发了2 515对SSR引物;利用50对SSR标记评估西番莲各种质间的标记通用率为54.22%,栽培种西番莲(P1~P5)明显高于其他5个种属(P6~P10),而中国云南野生种版纳西番莲的通用率为0,推测是由于版纳西番莲与其他种质的亲缘关系较远,基因组序列上存在着较大的差异。本研究明确了不同种西番莲间的亲缘关系,为西番莲遗传改良提供理论依据,为西番莲分子标记辅助选择育种提供实用的SSR标记。

• 拟南芥色氨酸氨基转移酶1的原核表达、纯化及活性分析

  李小芳, 方萍萍, 王卓毅, 徐沛

  表达获得有活性的纯化蛋白是开展蛋白特异性抑制剂筛选的前提。本研究对拟南芥色氨酸氨基转移酶1 (tryptophan aminotransferase of Arabidopsis 1, TAA1)进行了原核表达、纯化及活性分析。首先,通过GenBank查找拟南芥TAA1蛋白编码序列,根据大肠杆菌(Escherichia coli)密码子偏好性进行优化后,将目的序列合成并插入带有His标签的原核表达载体pET24a中,构建原核表达载体pET24a-GST-EK-His-TAA1。转化大肠杆菌BL21(DE3)后,分别给予不同诱导方式(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导/TB培养基, IPTG诱导/LB培养基, 自诱导)进行诱导和培养,诱导产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,发现利用自诱导表达系统、37 ℃条件下诱导表达16 h表达量最高,并且表达的融合蛋白主要为可溶性形式。选取此最优的表达方式进行放大表达和纯化,得到的融合蛋白经肠激酶(enterokinase, EK)酶解后进行镍离子亲和层柱纯化,最终得到大小正确的单一蛋白条带,纯度达78.7%,蛋白量达0.5 mg,说明His-TAA1蛋白被成功表达并纯化回收。体外酶活检测证明此蛋白具有转氨酶活性。该融合蛋白可用于下一步基于分子互作的TAA1蛋白特异性结合小分子化合物的筛选。

• 基于转录组的蔗茅EfPHD-finger家族基因鉴定及冷胁迫表达分析

  张蓉琼, 钱禛锋, 谷书杰, 饶席兵, 沈庆庆, 吕绍芝, 赵雪婷, 陈疏影, 王先宏, 何丽莲, 李富生

  蔗茅(Erianthus fulvus)是甘蔗(Saccharum spp.)的近缘野生种,在甘蔗抗逆性研究中起着重要的作用。PHD-finger (plant homeodomain finger)蛋白是一种转录调控因子,能对生物和非生物胁迫做出应答。本研究在对蔗茅EfPHD-finger家族基因进行转录组鉴定的基础上,进行生物信息学和冷胁迫表达模式分析。结果表明,在蔗茅中共鉴定到38个EfPHD-finger基因,其编码蛋白的氨基酸数目在145~2 268之间,分子量介于16.161 0~251.333 7 kD,等电点在4.35~9.66之间,平均亲水系数为-1.094~0.035。亚细胞定位显示,37个蔗茅PHD-finger蛋白均在细胞核内,只有EfPHD24位于细胞核和叶绿体。进化树分析表明,38个EfPHD-finger家族基因编码蛋白,共分为7个组群。基于转录组数据的冷胁迫表达模式分析显示,38个EfPHD-finger基因在不同程度的冷胁迫下呈现差异表达,其中,EfPHD13、EfPHD16、EfPHD21、EfPHD25、EfPHD28、EfPHD32、EfPHD34和EfPHD38这8个基因呈现上调表达,EfPHD13基因呈现持续上调,且上调倍数最大。对上调表达的8个基因进行qPCR表达验证,分析验证结果与转录组测序结果的相关性,结果显示,EfPHD25、EfPHD28两个基因的相关性较弱,其余基因相关性较强(R≥0.90)。本研究进一步克隆了EfPHD13基因(GenBank No. OK356615),其CDS全长为1 863 bp,编码620个氨基酸,含有PHD_MMD1_like结构域,有多个磷酸化位点,没有信号肽,不具有跨膜结构。本研究为进一步研究蔗茅EfPHD-finger家族基因的冷胁迫调控机理提供了参考。

• 蒙古马与杂交马耐力运动前后的血浆代谢组学研究

  魏睿元, 依波勒图, 韩海格, 白东义, 赵一萍, 王希生, 任秀娟, 陶克涛, 芒来, 李玉民

  运动代谢组学是对运动训练刺激导致的机体整体代谢反应进行评估的系统生物学研究,目前主要集中于人体(Homo sapiens)运动科学研究,而针对中国马匹(Equus caballus)的运动代谢组学研究鲜有报道。本研究应用1H-核磁共振(1H-nuclear magnetic resonance, 1H-NMR)技术,分析6匹蒙古马和6匹杂交马在30 km耐力运动前后的血浆代谢组学变化特征;通过R语言偏最小二乘判别分析(partial least square-discriminant analysis, PLS-DA)程序包及SPSS 20.0软件一维方差分析检验,鉴别组间代谢模式及差异代谢标志物。结果发现,蒙古马与杂交马运动前后的代谢模式有明显差异;蒙古马运动前后鉴定出10个差异代谢物,运动后出现葡萄糖、乙醇、甘氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、τ-甲基组氨酸下降,甲醇、肌酸升高;杂交马运动前后鉴定出15个差异代谢物,运动后出现葡萄糖、马尿酸盐、乙酸、谷氨酰胺、缬氨酸、甲醇、甜菜碱、τ-甲基组氨酸下降,乳酸、甘油、丙酮、3-羟基丁酸、3-羟基异丁酸、乙酰乙酸、肌酐升高。对代谢物变化结果进行综合分析显示,蒙古马能量供应方式以有氧代谢为主,而杂交马能量供应方式以磷酸原、糖酵解的无氧代谢为主,兼有脂肪酸酮体代谢。因此,蒙古马较杂交马具有更好的有氧耐力素质和爆发力潜质,故以蒙古马为基础培育耐力型赛马可行;谷氨酰胺、τ-甲基组氨酸可作为马匹耐力素质训练的监控指标进行开发应用。本研究结果为我国蒙古马耐力训练及育种工作提供了基础资料。

• COL1A1基因在贵州黑山羊性腺轴中的表达及其对产羔相关基因的影响

  周明帅, 温晓艳, 张艳, 李永, 徐畅, 杨秀远, 赵佳福

  Ⅰ型胶原蛋白α1链(collagen typeⅠα1 chain, COL1A1)作为Ⅰ型胶原蛋白的重要组成成分,在参与调控卵泡发育及卵巢细胞增殖中发挥作用,与动物繁殖性状密切相关。为探究COL1A1基因与贵州黑山羊(Capra hircus)繁殖力间的关系,及其不同表达水平对产羔相关基因的影响,本研究采集单羔、多羔贵州黑山羊性腺轴组织(子宫, 卵巢, 垂体, 下丘脑, 输卵管),采用qPCR检测COL1A1基因在单羔、多羔山羊性腺轴中的表达水平,随后分离培养卵巢颗粒细胞;通过RNA干扰技术,构建目的基因的干扰载体,并转染至卵巢颗粒细胞中,使用qPCR及Western blot方法检测COL1A1基因及其蛋白的表达量,筛选最佳干扰组,再通过qPCR方法检测干扰COL1A1基因后对产羔相关基因骨形态发生蛋白15 (bone morphogenetic protein 15, BMP15)、骨形态发生蛋白受体1B (bone morphogenetic protein receptor 1B, BMPR-1B)、生长分化因子9 (growth differentiation factor 9, GDF9)和促卵泡激素β亚基(follicle stimulating hormone β-subunit, FSHβ)表达的影响。结果表明,COL1A1基因在单羔和多羔子宫、卵巢、垂体、下丘脑和输卵管组织中均有表达。其中在多羔组卵巢、下丘脑中表达量最高,且极显著高于单羔组(P<0.01),在垂体和输卵管中显著高于单羔组(P<0.05),在子宫中无显著性差异;免疫荧光结果表明,实验中分离培养的细胞为卵巢颗粒细胞;qPCR及Western blot结果表明,shRNA-COL1A1-2为最佳干扰组,而且抑制COL1A1基因的表达后,产羔相关基因BMP15、BMPR-1B、GDF9和FSHβ的表达量均极显著低于shRNA-NC组(P<0.01)。本研究揭示了COL1A1基因在单羔、多羔贵州黑山羊性腺轴中的表达差异,其在多羔卵巢组织中的高表达及沉默COL1A1基因对产羔相关基因的抑制,说明COL1A1基因与卵巢发育及卵泡生长密切相关,可作为贵州黑山羊多羔品系选育的候选基因。

• α-TTP互作蛋白MYO1D介导肝细胞α-生育酚的转运

  薛瑛, 简路洋, 罗海玲

  维生素E在提高畜禽繁殖机能、提高免疫力及保护肝脏中起着非常重要的作用,其储存和代谢主要发生在肝脏中。α-生育酚转移蛋白(α-tocopherol transfer protein, α-TTP)是一种主要在肝脏中表达的蛋白质,可以特异性结合α-生育酚并促进其从肝脏转运到外周组织吸收利用。但有研究显示α-TTP在转运α-生育酚的过程中可能还需要其他互作因子的作用。本研究通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)和Pull-down筛选获得α-TTP的互作蛋白—肌球蛋白1D (myosin 1d, MYO1D),免疫荧光观察显示MYO1D与α-TTP存在明显共定位;利用Myo1d-shRNA慢病毒质粒,构建Myo1d基因的干扰载体,筛选获得稳定感染慢病毒干扰载体的肝细胞系;qRT-PCR检测结果显示,干扰组Myo1d基因表达极显著降低(P<0.01),干扰效率为46.83%,干扰组α-ttp基因表达无显著变化;试剂盒检测结果显示,Myo1d干扰组细胞内α-生育酚含量显著升高(P<0.05)。上述结果提示,MYO1D可以与α-TTP相互作用介导肝细胞中α-生育酚转运,可能在运输α-生育酚-TTP复合物的过程中提供动力。本研究为筛选α-TTP转运α-生育酚过程中的互作因子提供了实验基础,为进一步研究肝脏内α-TTP转运α-生育酚的机制提供了参考依据。

• 虹鳟TANK基因的克隆及其在传染性造血器官坏死病毒(IHNV)感染下的表达分析

  孙同振, 黄进强, 吴深基, 赵璐, 潘玉财, 雷明荃

  TRAF家族成员关联的NF-κB激活剂(TRAF family member-associated NF-κB activator, TANK)参与维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene I, RIG-Ⅰ)样受体介导的信号通路,在脊椎动物的先天免疫中发挥重要作用。为了解TANK基因的生物学特性及其在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)抗病毒免疫应答中的作用,本研究通过cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术获得虹鳟TANK的全长cDNA序列(GenBank No. OK605587),并进行了生物信息学分析,同时采用qPCR技术检测该基因在健康虹鳟头肾、皮肤、眼、鳃、脑、肠、肝脏、脾脏、心脏和肌肉10个组织中的表达模式,以及感染传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)后脾脏、肝脏、头肾、皮肤、鳃和肠6个重要免疫组织在不同时间点(0, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120和144 h)的表达变化。结果显示,TANK基因cDNA全长1 618 bp,包含1 107 bp的开放阅读框,编码368个氨基酸。生物信息学分析表明,TANK蛋白的分子量为41.41 kD,理论等电点为6.03,不稳定系数为70.60,亲水性平均值为-0.748,脂肪系数为65.54,属于不稳定亲水蛋白。对TANK蛋白的结构分析发现,该蛋白无跨膜结构域,含有保守的TBK1/IKKi结合结构域(TBK1/IKKi-binding domain, TBD)和coiled-coil区域。同源性比对及系统进化分析显示,虹鳟与大马哈鱼(Oncorhynchus keta)的同源性最高(95.92%)且进化关系最近。组织表达分析显示,TANK基因在健康虹鳟头肾、皮肤、眼、鳃、脑、肠、肝脏、脾脏、心脏、肌肉组织中均有表达,在肝脏中表达最高,脾脏和心脏次之,皮肤中最低;经IHNV感染后,TANK基因在脾脏、肝脏、头肾、皮肤、鳃、肠中的表达均极显著上调(P<0.01),以黏膜组织的皮肤和肠中变化最为显著,分别在48和72 h达到峰值,为对照组的3.14和3.16倍;除了脾脏组织的表达量整体表现为先升后降的趋势外,肝脏、头肾、皮肤、鳃和肠均呈现先降后升再降的表达趋势,且肝脏、头肾、皮肤、肠在96和120 h出现不同程度的回升。上述结果表明,TANK基因可能在虹鳟抵御IHNV感染的先天免疫应答中发挥重要作用。本研究结果为进一步探究TANK基因在硬骨鱼类中的抗病毒免疫调控机制提供了基础数据。

• 红螯光壳螯虾渗透压相关基因的克隆及其在不同盐度下的表达

  彭博浩, 张炎, 刘畅, 钟箫, 付德政, 张凯怡, 王艺磊

  红螯光壳螯虾(Cherax quadricarinatus)是淡水虾,盐度是影响其生长与存活的重要环境因素。为了扩大可用于红螯光壳螯虾养殖的水域,如盐碱地、河口半咸水区,需要了解其渗透压调节机制,为其在半咸水养殖的可行性及通过半咸水暂养改善其风味提供理论依据。本研究通过NCBI已发表的红螯光壳螯虾转录组数据库筛选出3个与渗透压相关基因：钠钾ATP酶(Na+/K+-ATPase, NKA)、钠钾氯共转运体(Na+/K+/2Cl--cotransporter, NKCC)和酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白(14-3-3),通过RT-PCR验证其ORF区。运用生物信息学在线网站对其蛋白结构进行预测,并将不同物种的同源蛋白序列进行多重序列比对和进化树构建,同时利用qPCR分析NKA、NKCC和14-3-3在红螯光壳螯虾不同组织的表达情况及在不同盐度胁迫24、48和96 h后,在鳃和肝胰腺中的表达变化情况。结果表明,NKA、NKCC、14-3-3蛋白在不同物种间具有较高保守性。NKA、NKCC和14-3-3基因在所检测的红螯光壳螯虾鳃、肌肉、心脏、肝胰腺、眼柄组织中均有表达。在不同盐度胁迫下,鳃组织中的NKA基因的表达量在5‰、10‰盐度下变化不显著,在15‰、20‰盐度组的48 h表达量显著提高(P<0.05),在肝胰腺中NKA基因表达量仅在20‰盐度组的48 h显著上升(P<0.05)。鳃组织中的NKCC基因表达量在10‰、15‰、20‰盐度组的24、48和96 h均显著上调(P<0.05),在肝胰腺中仅在15‰、20‰盐度组的48 h显著上调(P<0.05)。鳃组织中14-3-3基因表达量在10‰、15‰、20‰盐度组的48 h显著上调(P<0.05),在肝胰腺中其表达量在5‰、10‰、15‰盐度组的48 h均显著上调(P<0.05),在20‰盐度组的24和48 h显著上调(P<0.05)。结果表明,NKA、NKCC、14-3-3基因的表达与盐度变化相关,20‰盐度胁迫48 h可能是鳃和肝胰腺在高盐度下渗透调节的关键点。本研究为进一步探讨NKA、NKCC和14-3-3基因在红螯光壳螯虾渗透调节机制中的作用提供了参考依据。

• 不同有机物料还田后砂质土壤有机碳组分结构特征

  郝近羽, 陈源泉, 代红翠, 李超, 徐洁, 刘瑾, 隋鹏

  近年来固态13C核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)技术已成为土壤有机碳分子结构研究领域的应用热点,相比于壤土和黏土,砂质土对土壤碳组分变化的反馈机制更加敏感。为揭示不同外源碳输入对土壤有机碳组分及稳定性的影响,本研究利用13C-NMR技术,以秸秆还田、单施化肥为主、副对照,测定3种有机物料进行8年连续还田后对砂质土壤有机碳分子结构的影响。结果表明：1)猪粪、沼渣和生物炭处理的土壤有机碳组分与对照组相似,均以烷氧碳(45~110 ppm)为主,其中碳水化合物类碳(60~90 ppm)是其构成的主体。2)与秸秆还田(主对照)相比,沼渣与猪粪还田后土壤耐分解碳组分(烷基碳+芳香碳)比例分别降低了2.96%和3.77%,而生物炭处理则增加了8.12%;沼渣与猪粪处理的疏水性指数分别比秸秆处理降低了4.93%和6.25%,而生物炭处理则提高了14.65%;生物炭处理的芳香度约为沼渣和猪粪处理的1.7~2.0倍。3)冗余分析表明,土壤芳香碳的相对含量对土壤有机碳稳定性指标和有机碳含量的影响达到显著水平(P<0.01)。由于不同有机物料还田后土壤有机碳组分存在差异,沼渣和猪粪还田后增加了土壤易分解碳组分(以碳水化合物类碳为主)和羧基碳,意味着土壤有机碳的稳定性被削弱了;生物炭还田后增加了土壤耐分解碳组分(以芳香碳为主),提升土壤有机碳稳定性的效果更显著。本研究结果可为进一步提升农田土壤有机碳库稳定性提供参考。

• 植物腺苷酸环化酶研究进展

  袁野, 赵馨, 李佳敏, 刘志国, 刘孟军

  腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase, AC)作为合成重要功能性物质3',5'-环磷酸腺苷(3',5'-cyclicadenosine monophosphate, cAMP)的关键酶,是环磷酸腺苷第二信使系统的重要组成部分。在动物和微生物中,腺苷酸环化酶已有较为系统深入的研究,而植物中腺苷酸环化酶研究起步相对较晚。随着科学技术不断发展进步,最近几十年,植物AC活性验证、基因挖掘、蛋白结构特征及生物学功能等研究取得了明显进展,但尚未有系统的综述报道。因此,本文对植物中AC相关研究进行了系统综述,旨在为进一步开展植物中腺苷酸环化酶研究提供参考。

• 甘氨酸-N-甲基转移酶对肝脏代谢及相关疾病的调控机制

  杜雪儿, 王建国, 姚军虎, 曹阳春

  肝脏是人体重要的功能器官,能够进行多种物质的代谢并重新转运至机体其他部位进行利用和排泄,具有解毒及多种物质的合成、代谢、消化和储存等生理功能。其中脂肪与能量代谢尤为重要,如果该过程出现异常,包括脂肪合成过多、代谢减少及转运能力下降等,就会使非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化及肝硬化、胆汁淤积,甚至肝细胞癌等多种疾病的发生风险急速上升,且与其他代谢类疾病的诱发也紧密关联。最近的研究表明肝脏中的甘氨酸-N-甲基转移酶(glycine-N-methyltransferase, GNMT)作为调控S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)向S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosyl-homocysteine, SAH)转化的关键酶来影响SAM的在体水平,进而调控机体的甲基化状态,GNMT还能调控脂肪代谢与转运相关基因的表达,以及氧化呼吸复合物Ⅱ的活性来调控脂肪含量,降低疾病发生和进一步发展。本文对GNMT在肝脏中的脂代谢、糖代谢及氧化应激等调控作用进行阐述,同时还讨论了GNMT在多种肝脏疾病中发挥的治疗作用,期望可以为今后针对GNMT的治疗方法及靶点夯实理论基础。

• 槐耳WH5的分离鉴定及其液体发酵工艺优化

  唐少军, 雷平, 杨祎, 邵晨霞, 贺月林, 许隽

  槐耳(Vanderbylia robiniophila)是一种重要的药用大型真菌,因目前野生资源逐渐稀少,人工栽培周期长、成本高,造成槐耳子实体来源紧缺,阻碍了槐耳活性成分多糖的获取,从槐耳发酵液中提取活性多糖是一种重要途径。为丰富槐耳的菌种资源,提升发酵液中活性化合物多糖的产量,本研究对1株野生槐耳WH5进行组织分离获得纯培养物,结合形态与内部转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列分析对其进行鉴定,在单因素实验的基础上结合正交实验对槐耳WH5的液体发酵工艺进行优化;利用体外细胞实验分析发酵液中胞外多糖对肿瘤细胞的抑制活性。结果表明,获得的WH5菌株ITS序列长度为637 bp,与槐耳(GenBank No. KX081122.1)有最高相似性,为99%,且在系统发育树聚集在一个分支上,结合子实体和菌丝形态,确定WH5菌株为槐耳。WH5菌株的最佳液体发酵工艺为：可溶性淀粉30 g/L,蛋白胨15 g/L,MgSO4•7H2O 1.0 g/L,KH2PO4 2.0 g/L,pH 7.0,转速为160 r/min,发酵温度为30 ℃,发酵时间为9 d,菌丝和胞外多糖的产量分别为27.52和1.91 g/L。发酵液中的胞外多糖可以抑制B16和Hep-3B肿瘤细胞,其半数抑制浓度(IC50)分别为：24.12和13.25 mg/mL。本研究对丰富槐耳菌种资源以及促进槐耳发酵液中多糖的利用具有重要意义。

• FpgMBV1-P4基因的原核表达及多克隆抗体制备

  刘东伟, 宋嘉庆, 潘鑫, 闫书味, 李轲, 范沛, 高飞, 张晓婷, 代君丽, 李洪连

  假禾谷镰孢巨型双链RNA病毒1 (Fusarium pseudograminearum megabirnavirus 1, FpgMBV1)是从假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)弱毒菌株FC136-2A中发现的一种真菌病毒。FpgMBV1共编码4个蛋白质,其中FpgMBV1-P4由268个氨基酸残基组成,功能未知。本研究设计特异性引物,采用反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)方法从菌株FC136-2A的菌丝中扩增FpgMBV1-P4基因,构建原核表达载体pGEX4T-FpgMBV1-P4并转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)菌株,在25 ℃以0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达重组蛋白。结果表明,FpgMBV1-P4基因长为807 bp,重组表达的融合蛋白分子量约为60 kD,与预期大小相符。将该重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔(Lepus sinensis),获得抗血清,采用间接ELISA测定其效价达1∶160 000,能够特异性检测到假禾谷镰孢菌丝中约36 kD的FpgMBV1-P4蛋白。研究结果为深入分析FpgMBV1-P4的结构和功能及进一步探讨FpgMBV1与假禾谷镰孢菌的相互作用提供了基础。

• A型塞内卡病毒VP1蛋白单克隆抗体制备及胶体金试纸条的试制

  张涛, 王会宝, 孙燕燕, 翟国元, 崔燕

  A型塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)是近年新发现的一种病原体,严重危害着我国养猪业的健康发展。为制备SVA病毒结构蛋白1 (viral structural protein 1, VP1)单克隆抗体(monoclonol aitibody, McAbs)及建立一种快速、高效、简便的SVA检测方法,本研究利用RT-PCR方法扩增SVA VP1基因,将其克隆到表达载体pET-28a(+)中,诱导表达并纯化得到重组VP1蛋白。以重组VP1蛋白免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),筛选获得2株稳定分泌抗SVA VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2E10, 3E4)。通过2E10和3E4免疫小鼠获得腹水型McAbs并纯化,利用间接免疫荧光实验(indirect immunofluorescence assay, IFA)和Western blot鉴定McAbs。以2E10 McAbs作为捕捉抗体,山羊抗鼠IgG与3E4 McAbs分别作为质控线(C线)与检测线(T线)试制SVA胶体金试纸条。结果显示,重组SVA VP1蛋白主要以包涵体形式表达,分子质量约为43 kD。抗体亚型鉴定结果显示,2E10重链亚型为IgG2b,3E4重链亚型为IgG2a,轻链均为κ链。IFA和Western blot结果显示,制备的McAbs与SVA特异性结合。试纸条检测结果显示,试纸条能特异性地检测SVA,而与口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)、猪繁殖障碍与呼吸症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)和猪圆环病毒2型病毒(Porcine cirovirus type 2, PCV2)无交叉反应;最低检测病毒含量为5×101.13 TCID50/mL;该方法与qPCR方法检测临床样品的符合率达96.55%。以上结果表明,本研究制备的基于VP1单克隆抗体的胶体金试纸条为SVA的即时检测提供了新方法。