农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2019年第4期

• 陆地棉NAC转录因子基因GhSNAC1的克隆及其抗旱耐盐分析

  王立国, 傅明川, 李浩, 刘任重, 柳展基

  NAC (NAM/ATAF/CUC)家族是植物中特有的一类转录因子,其功能涉及植物生长发育调控、激素信号转导、逆境胁迫响应等重要生理过程。本研究利用反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)技术从陆地棉(Gossypium hirsutum)中克隆了1个逆境胁迫响应(stress-responsive) NAC类转录因子基因,命名为GhSNAC1 (GenBank No. KU759894)。该基因长度为1 104 bp,预测编码蛋白含有299个氨基酸,分子量为33.9 kD,等电点为6.18。蛋白序列分析表明,GhSNAC1具有典型的NAC转录因子特征,N端含有保守的NAC结构域。进化分析表明,GhSNAC1与拟南芥(Arabidopsis thaliana) ATAF1 (Arabidopsis transcription activation factor 1)高度相似。qRT-PCR结果显示,GhSNAC1受到干旱、高盐、低温和黄萎病菌(Verticillium dahliae)胁迫诱导,提示该基因可能参与生物和非生物胁迫响应。在烟草(Nicotiana tabacum)中过表达GhSNAC1,分析干旱或盐胁迫条件下转基因和野生型烟草株系种子的萌发率和幼苗生长差异,实验结果显示,在100 mmol/L NaCl或200 mmol/L甘露醇胁迫下,野生型烟草的种子萌发受到明显抑制,萌发率低于50%,而转基因株系显著优于野生型,其种子萌发率均在80%以上;野生型烟草幼苗弱小,而转基因株系长势强,其单株鲜重和根长分别是野生型的2倍和1.5倍以上。上述结果表明,过表达GhSNAC1可显著提高转基因烟草的抗旱耐盐能力。本研究为深入探究GhSNAC1抗旱耐盐的分子机制提供了基础资料。

• 拟南芥AtTERT基因特性分析及其对盐与过氧化氢胁迫的响应

  王杨, 孙玉萍, 董琦, 杨颖, 刘颖, 于婷乔, 吴晓飞, 卢存福

  端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)是真核细胞中具有逆转录酶活性的核糖核蛋白复合物—端粒酶(telomerase)的主要组成成分。拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtTERT是第1个被克隆的植物端粒酶逆转录酶基因。为了明确AtTERT的结构和功能特点,本研究利用生物信息学和软件对AtTERT的理化性质和蛋白质结构等进行了系统分析,探讨了不同物种间TERT的亲缘关系;同时对盐和氧化胁迫下端粒酶活性和AtTERT基因表达模式进行分析。结果表明：AtTERT属于不具有信号肽的亲水性蛋白,未发现明显的跨膜结构域。AtTERT磷酸化位点有125个,其中丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸位点分别为87、28和10个。无规则卷曲和α-螺旋是AtTERT二级结构的主要结构元件。保守结构域为端粒酶RNA结合功能域(telomerase RNA binding motif, TRBD)和逆转录酶功能域(telomerase reverse transcriptase motifs, RT)。端粒酶活性变化与AtTERT表达对盐与过氧化氢胁迫反应一致,均呈现先升高后降低的趋势。该研究结果为研究植物TERT的结构功能积累了新的资料。

• 根瘤农杆菌介导玉米ZmHDZIV13和ZmHDZIV14基因的遗传转化及干旱抗性分析

  闫慧萍, 赵小强, 彭云玲, 方鹏, 任斌, 庄泽龙, 高巧红, 曾文静

  同源异型域-亮氨酸拉链(homeodomain-leucine zipper, HD-Zip)转录因子在植物的生长发育、形态建成及抵抗各种逆境胁迫中起着十分重要的调控作用。本研究构建了植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-ZmHDZIV13/14-bar,利用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)茎尖转化法将玉米ZmHDZIV13和ZmHDZIV14基因转入玉米自交系'郑58',以Basta除草剂筛选阳性植株,以PCR及Southern blot方法对转基因玉米进行检测;在干旱胁迫下对T2代转基因玉米和非转基因玉米株系进行耐旱性分析。结果表明,正常处理下,转基因株系与非转基因株系均能正常生长,根和叶中丙二醛(malondialdehyde, MDA)、H2O2、脯氨酸(proline, Pro)、可溶性糖(soluble sugar, SS)含量、过氧化物酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性无显著差异;但在干旱胁迫条件下,转ZmHDZIV13和ZmHDZIV14基因玉米株系根和叶中的MDA和H2O2含量极显著降低(P<0.01),Pro、SS含量、POD、CAT及SOD活性极显著增高(P<0.01)。上述结果表明,导入ZmHDZIV13和ZmHDZIV14基因在一定程度上提高了玉米植株对干旱胁迫的耐受能力。本研究为深入探讨ZmHDZIV13和ZmHDZIV14基因功能和创制转基因抗旱材料提供了基础资料。

• 拟南芥吲哚族芥子油苷合成调控基因表达模式的分析

  盛宇欣, 彭疑芳, 朱星宇, 金峰, 孔稳稳, 李晶

  吲哚族芥子油苷(indolic glucosinolate, IGS)在植物对病原菌的防御反应中具有重要作用,MYB (myeloblastosis) 34、MYB51和MYB122是调控IGS合成的重要转录因子。本研究拟系统研究3个转录因子基因的时空表达模式及其对激素的响应,为深入探讨吲哚族芥子油苷的抗病机制提供数据参考。首先以拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA为模板,克隆MYB34、MYB51和MYB122基因的启动子序列,构建由启动子驱动报告基因GUS (β-glucuronidase编码基因)的植物表达载体,转入拟南芥后获得PMYB34::GUS、PMYB51::GUS和PMYB122::GUS转基因株系。通过GUS活性信号检测,对基因的空间表达模式及激素响应性进行分析。基因表达分析显示,上述3个基因的时空表达模式呈现一定的相似性,即在生长发育的各个时期及各种不同组织中均有表达：在幼苗的子叶、胚轴和胚根及成熟植株的根、茎、叶、花和角果的维管束等处均有表达;但是基因表达也存在明显差异,其中MYB51基因在地上部分的表达水平显著高于根,MYB34和MYB122则主要在根中表达。激素响应性分析显示,MYB51受到水杨酸强烈诱导,MYB34则对茉莉酸甲酯最为敏感,处理后表达水平显著提高;与MYB51和MYB34相比,MYB122对各种激素的响应相对不敏感,在本研究的实验条件下,几种激素处理后其基因表达水平未发生大幅度变化。上述研究结果提示,IGS代谢在植物不同部位可能受到不同信号途径调控。本研究初步揭示了MYB34、MYB51和MYB122的基因表达特点和激素响应特性,为深入揭示IGS合成调控机制提供了基础资料。

• 怀黄菊CmPAN基因的克隆与表达分析

  赵喜亭, 刘克, 朱玉婷, 马孟丹, 吕萌, 宋灵雨, 蒋丽微, 王苗, 李明军

  怀菊花(Chrysanthemum morifolium)是著名的四大怀药之一,具有很高的观赏、食用及药用价值,但其花器官发育缺乏相关研究。为探究PERIANTHIA (PAN)基因在怀菊花花发育中的功能,首先利用同源克隆与cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术成功克隆获得怀菊花优良种质怀黄菊(Ch. morifolium cv. Huaihuang)中CmPAN的cDNA序列,全长为1 484 bp,其中CDS区为1 314 bp,5' UTR和3' UTR分别为64和106 bp。预测其编码437个氨基酸,与其他植物的PAN序列具有较高同源性,且C末端具有碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper motif, bZIP)家族D亚族的特征区和2个谷氨酰胺丰富区,与拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtPAN的亲缘关系最近,故命名为CmPAN (GenBank No. KX380854)。生物信息学分析显示,CmPAN蛋白质的预测分子量和等电点分别为48.265 kD和8.82;CmPAN为非分泌性蛋白,并具有核定位序列,无序化程度小于AtPAN。qRT-PCR检测结果表明,CmPAN在花与茎中的表达量高于根与叶;在花发育的现蕾期至透色期表达量较高,之后呈下降趋势;在花器官中表达水平从高至低依次为管状花瓣、管状花雄蕊、舌状花瓣、舌状花心皮、花托。上述结果提示,CmPAN可能在花发育初期发挥重要作用,并且与管状花的花瓣和雄蕊的发育密切相关。本研究为进一步探究CmPAN基因的功能提供了参考依据。

• 桃PpmMDH基因克隆及采后激素处理下的表达分析

  张姗姗, 王滨, 李静媛, 沈俊岭, 马春晖, 黄永红, 段艳欣

  苹果酸脱氢酶在植物的生长发育中发挥重要作用。本研究克隆了桃(Prunus persica)苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, mMDH)基因(PpmMDH),分析了其序列特征及其在硬肉和软肉桃品种不同桃组织及果实成熟前后的表达情况,并探讨了不同激素处理对桃果实中PpmMDH基因表达的影响。结果表明,克隆得到了PpmMDH基因,GenBank登陆号为KF017594,该cDNA片段长度为1 239 bp,具有1个1 020 bp的ORF,编码339个氨基酸,序列分析表明,PpmMDH编码的氨基酸序列与其他植物的mMDH蛋白有较高的相似性,系统进化分析结果表明PpmMDH与梅(Prunus mume)和甜樱桃(Pr. avium)同源关系最近。qRT-PCR结果表明,PpmMDH在雄蕊中表达量较高(P<0.05),其次是花瓣,在叶片、幼果和雌蕊中表达量较低。果实成熟软化后期,PpmMDH在硬肉桃'双久红'果实中的表达量高于软肉桃'川中岛白桃'的。脱落酸(abscisic acid, ABA)、萘乙酸(1-naphthylacetic acid, NAA)、乙烯利(ethephon, ETH)处理桃果实得出,软肉桃果实成熟软化过程中PpmMDH的表达与乙烯有拮抗作用,硬肉桃与软肉桃在果实成熟与贮藏过程中内源激素动态不同,PpmMDH表达水平与酶活动态不同。上述结果表明,PpmMDH不一定是维持果实硬度的上游基因,但是在软肉桃与硬肉桃不同材料间表现出了与生理差异同步的酶活差异。本研究结果为进一步探索PpmMDH在桃果实成熟软化中的作用提供了科学依据。

• 茶树CsANS基因的克隆及在转基因烟草中的功能分析

  齐勇, 赵德刚, 吕立堂

  花青素合成酶(anthocyanidin synthase, ANS)是合成植物花青素末端的重要催化酶,能够使无色花青素催化为有色花青素。本研究以茶树全长转录组测序数据为依据,利用反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)克隆了编码茶树(Camellia sinensis)ANS基因的cDNA序列(GenBank No.AY830416),编码区全长1 068 bp,编码355个氨基酸。构建载体pSH-CsANS,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染烟草(Nicotiana tabacun)进行遗传转化,组织培养获得35株转基因植株。选取3个经PCR验证的阳性烟草株系TP-1、TP-2和TP-4进行基因表达以及花青素和原花青素含量分析。qRT-PCR分析显示,转基因烟草植株中原花青素生物合成途径基因查儿酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)、黄烷酮-3-羟化酶((2S)-flavanone 3-hydroaylase, F3H)和二羟黄酮醇还原酶(dihydroflavonol4-reductase, DFR)表达上调,黄酮醇合成酶(flavonol synthase, FLS)基因表达下调。结果表明,超量表达茶树CsANS基因能够促进烟草花青素的合成,花青素含量比野生型提高45%左右。而且,超量表达CsANS基因能增加原花青素合成前提物质黄烷-3-醇含量,使转基因植株中原花青素含量比野生型升高34%左右。本研究结果为进一步对该基因的表达规律和功能分析提供理论基础。

• 一个毛竹LTR转座子PHRE9的全长鉴定与转录活性分析

  郑浩, 季航, 蒋政勤, 徐芷馨, 周明兵

  反转录转座子作为毛竹(Phyllostachys edulis)基因组中重要组成部分,可以通过自身转座参与毛竹生长发育的调控,获得具有活性的毛竹转座子,对竹子突变育种有着重要意义。本研究鉴定了1条结构完整的毛竹LTR反转录转座子PHRE9 (Phyllostachys edulis retrotransposons 9),系统地分析了PHRE9结构特征和进化模式以及在逆境下的表达模式。通过对PHRE9转座子全长PCR扩增以及生物信息学分析,表明PHRE9全长为6 370 bp,属于Ty1-copia大类中的Tork分支。利用qRT-PCR技术检测了在DNA甲基化抑制剂、辐照、高盐、高温、低温等不同处理条件下,PHRE9的3个结构域的基因转录活性水平。结果表明在DNA甲基化抑制剂处理、辐照、高盐、高温(42 ℃)、低温(4 ℃)胁迫处理下PHRE9表达水平均有上调的现象,表现出转录激活特性。本研究为毛竹逆境适应机制研究以及竹子突变育种提供了基础资料。

• 利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除猪肠上皮细胞(IPEC-J2) ace2基因及其功能分析

  王凯, 王换换, 刘颖, 纪晓霞, 张源淑

  关于血管紧张素转移酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)的研究目前主要集中于啮齿类动物和人类(Homo sapiens),猪(Sus scrofa domesticus)方面的资料较少。ACE2在不同组织器官中良好的抗炎、抗损伤作用已被广泛认可,但在肠道中的作用尚不明确。本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪肠上皮细胞(porcine intestinal epithelial cell, IPEC-J2) ace2基因敲除方法,探究ace2缺失对细胞炎性损伤的影响。首先通过Western blot和免疫荧光染色方法证实所选取的IPEC-J2细胞有ACE2蛋白表达;然后以猪ace2基因为敲除靶点,设计合成3对单导向RNA (single guide RNA, sgRNA),并插入含有Cas9骨架的pX330质粒,构建ace2基因打靶载体pX330-ace2-1、pX330-ace2-2和pX330-ace2-3。将测序正确的重组质粒pX330-ace2-2转染至IPEC-J2细胞,Western blot和免疫荧光染色结果显示ACE2蛋白表达缺失;以酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测ace2敲除细胞的炎性因子水平,结果显示,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)处理组的促炎因子白介素(interleukin, IL)-1β和IL-8显著升高(P<0.01)、抗炎因子IL-10显著降低(P<0.05),细胞炎性损伤加剧,提示肠道ACE2具有一定的抗炎作用。本研究利用CRISPR/Cas9系统建立了靶向敲除猪肠上皮细胞ace2基因的方法,并初步探讨了ACE2在猪肠道的抗炎作用,为深入开展ACE2相关功能和作用机制研究提供了基础资料。

• siRNA干扰CAT基因表达对猪皮下前体脂肪细胞分化的影响

  单保森, 刘鑫, 罗武, 邵勇钢, 韦伟, 陈杰, 张立凡

  皮下脂肪沉积作为影响猪(Sus scrofa)生长和肉质的主要因素之一,在养猪生产中一直都是被关注的焦点问题。过氧化氢酶(catalase, CAT)是一种广泛存在于机体氧化代谢过程中的关键抗氧化酶,在动物的脂肪沉积中发挥着重要的作用。为了探究CAT基因在猪皮下前体脂肪细胞分化中的作用,本研究首先通过qRT-PCR检测CAT基因在二花脸猪皮下前体脂肪细胞分化过程中的表达变化,以及在二花脸猪不同组织的表达谱变化;通过小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)抑制内源CAT基因表达,运用油红O染色检测皮下前体脂肪细胞的分化能力;同时qRT-PCR检测沉默CAT基因后,前体脂肪细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α基因(CCAAT enhancer binding protein α, C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白4基因(fatty acid binding protein 4, FABP4)、载脂蛋白E基因(apolipoprotein E, ApoE)、脂联素基因(adiponectin, C1Q and collagen domain containing, ADIPOQ)、围脂滴蛋白1基因(perilipin 1, PLIN1)和激素敏感脂肪酶基因(hormone-sensitive lipase, HSL)等脂肪分化相关基因的表达变化;并进一步检测超氧化物歧化酶2基因(superoxide dismutase 2, SOD2)、谷胱甘肽合成酶基因(glutathione synthetase, GSS)、过氧化物酶3基因(peroxiredoxin 3, PRDX3)等抗氧化酶相关基因的表达变化。结果显示,CAT基因主要在猪皮下脂肪、肾脏和肝脏组织中表达,且在猪皮下脂肪组织的表达极显著高于肌内脂肪组织(P<0.01)。在二花脸猪皮下前体脂肪细胞分化过程中,CAT基因的表达均显著升高(P<0.05或P<0.01),其中第4 d表达量最高。降低CAT基因的表达可显著增加细胞中的过氧化氢(H2O2)含量(P<0.01)和抑制猪皮下前体脂肪细胞的甘油三酯水平(P<0.05),尽管其对PPARγ、C/EBPα、FABP4、ApoE等基因的表达没有显著影响(P>0.05),但可以显著降低ADIPOQ (P<0.05)、PLIN1基因的表达(P<0.01)和升高HSL基因的表达(P<0.05),而对抗氧化酶相关基因SOD2、GSS、PRDX3的表达则没有显著影响(P>0.05)。上述结果表明,干扰CAT基因可以抑制二花脸猪皮下前体脂肪细胞的分化和脂质沉积,这可能与其能够降低ADIPOQ和PLIN1等成脂基因的表达,同时促进HSL基因表达有关。本研究为进一步揭示CAT基因对猪脂肪生成的作用机制,以及通过氧化调控降低猪的皮下脂肪沉积提供新的科学依据。

• 印楝素对猪睾丸ST细胞的生长和基因表达的影响

  卢圣菲, 冉雪琴, 牛熙, 黄世会, 王嘉福, 李升, 代新兰, 马鑫芮

  印楝素(azadirachtin)是从印楝(Azadirachta indica)种子提取的植物杀虫剂,广泛应用于农田害虫防治。为了明确印楝素是否影响公猪的繁殖力,本研究采用猪(Sus scrofa)睾丸ST细胞(swine testis cells),通过MTT(3-(4, 5-dimethyl thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide)方法和流式细胞术,研究印楝素对猪睾丸细胞生长的影响,以实时荧光定量PCR方法检测印楝素对繁殖相关基因的影响。随着印楝素处理浓度的增加,ST细胞变圆脱落聚集;MTT实验证明印楝素以剂量依赖方式抑制ST细胞的生长,表现出细胞毒作用,24 h的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)为7.646 mg/L;流式细胞术检测到印楝素诱导ST细胞凋亡,8 mg/L印楝素引起的早期凋亡率明显高于5 mg/L处理组(P<0.05);基质金属蛋白酶15 (matrix metallopeptidase 15, MMP15)、蛋白激酶Cα相互作用蛋白(protein interacting with Cα kinase, PICK1)、骨形态发生蛋白6 (bone morphogenetic protein 6, BMP6)基因的表达量随印楝素处理浓度的增加而下降;突变同源蛋白4 (MutS homolog 4, MSH4)基因的表达量随印楝素处理的浓度而增加。综上所述,印楝素可抑制猪睾丸细胞的生长,诱导细胞凋亡,并影响繁殖相关基因的表达,提示印楝素可影响公猪的繁殖力。本研究为饲料中印楝素残留控制提供了理论依据。

• FecB突变对小尾寒羊卵泡发育及AMH和AMHR2基因表达的影响

  陶林, 郭晓飞, 文禹粱, 狄冉, 刘秋月, 胡文萍, 张效生, 张金龙, 王翔宇, 储明星

  小尾寒羊(Ovis aries)是我国拥有高繁殖力的优良品种,其骨形态发生蛋白受体1B(bone morphogenetic protein receptor 1B, BMPR1B)基因发生FecB突变能提高排卵数和产羔数,但具体机制尚不清楚。本研究旨在探讨小尾寒羊不同FecB基因型(突变纯合型BB和野生型++)对卵泡数量和直径以及抗苗勒氏激素基因(anti-Müllerian hormone, AMH)和抗苗勒氏激素Ⅱ型受体基因(anti-Müllerian hormone receptor Ⅱ, AMHR2)表达模式的影响。基于TaqMan探针分型技术,运用同期发情方法,统计卵泡期++型(n=21)和BB型(n=16)直径在3 mm以上的卵泡数量和直径。利用qRT-PCR技术检测BB型小尾寒羊(n=3)卵泡期14种组织(下丘脑, 垂体, 卵巢, 心脏, 肝脏, 脾脏, 肺脏, 肾脏, 大脑, 肾上腺, 小肠, 输卵管, 子宫, 甲状腺)以及BB型和++型小尾寒羊黄体期和卵泡期(n=3, 3, 3, 3)下丘脑-垂体-卵巢性腺轴中AMH和AMHR2的表达量。结果显示,FecB突变极显著增加了卵泡数量(P<0.01)和降低了卵泡直径(P<0.01)。AMH和AMHR2在BB型小尾寒羊卵泡期各组织中均有表达,其中下丘脑-垂体-卵巢性腺轴中两者均高表达,卵巢中AMH表达量最高,肾上腺中AMHR2表达量最高。AMH在不同发育阶段不同FecB基因型小尾寒羊下丘脑-垂体-卵巢性腺轴的表达差异不显著(P>0.05)。AMHR2在卵巢中表达量无显著差异(P>0.05),在垂体中表达量BB型极显著高于++型(P<0.01),卵泡发育阶段和基因型对下丘脑AMHR2的表达量存在极显著影响(P<0.01)。综上表明,FecB突变可以引起小尾寒羊卵泡发育和AMHR2表达时空的改变,AMHR2在下丘脑-垂体-卵巢性腺轴系统的特定表达可能参与FecB突变调节卵泡发育,这为我国高繁殖力肉羊育种提供了新的理论依据。

• 山羊CPT1B基因的克隆、表达及其与肌内脂肪含量的相关性分析

  俞雨阳, 林亚秋, 梁计峻, 王永, 朱江江

  肌内脂肪含量是动物育种的关键指标,利用分子生物学手段研究脂代谢调控机制是一项重要工作。本研究旨在克隆山羊(Capra hircus)肉碱脂酰转移酶Ⅰ肌肉亚型基因(carnitine palmityl transferase 1 B, CPT1B)序列,并利用qRT-PCR技术检测山羊不同组织和肌内前体脂肪细胞中CPT1B基因的表达模式,为深入探讨CPT1B基因在山羊脂肪酸代谢调控中的功能提供实验数据。首先选取1周岁的健康简州大耳羊(Jianzhou Big-eared goat) 7只,采集心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、股二头肌、臂三头肌、皮下脂肪和腹间脂肪并保存于液氮中,以索氏提取法检测背最长肌、股二头肌、臂三头肌的肌内脂肪含量;利用Trizol试剂提取上述保存的组织样品总RNA,利用反转录PCR方法克隆CPT1B序列并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR方法检测CPT1B基因在山羊各组织的表达,分析其表达水平与肌内脂肪含量的相关性。结果显示,克隆得到山羊CPT1B基因序列2 619 bp (GenBank No. MH340532),包含完整的CDS区2 313 bp、5'UTR序列52 bp、3'UTR序列254 bp,编码771个氨基酸。各组织qRT-PCR结果显示,CPT1B在简州大耳羊心脏、背最长肌、股二头肌和臂三头肌有较高水平的基因表达,在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪和腹间脂肪的表达水平较低;肌内前体脂肪细胞的检测结果显示,前体脂肪细胞分化期间的CPT1B表达量均极显著高于分化前和分化后(P<0.01);相关性分析显示,CPT1B基因表达量与各肌肉组织肌内脂肪含量均显著正相关(P<0.05)。综上所述,CPT1B可能在山羊肌内脂肪沉积过程中具有调控作用,上述结果为CPT1B基因在肉用山羊育种中的应用提供了基础资料。

• SFRP5基因遗传变异对长顺绿壳蛋鸡胸肌肌肉品质的影响

  覃媛钰, 张依裕, 罗华伦, 吴磊

  分泌型卷曲相关蛋白5(secreted frizzled related protein 5, SFRP5)通过Wnt信号通路调节脂质代谢,改善胰岛素抵抗,维持炎症平衡,是白色脂肪组织分泌的抗炎症脂肪因子之一。为了探讨SFRP5基因多态性与长顺绿壳蛋鸡(Gallus gallus domesticus)肌肉品质的关系、寻找与蛋鸡肌肉品质的相关分子标记、本研究采用直接测序法检测SFRP5基因外显子的单核苷酸多态,分析其对长顺绿壳蛋鸡胸肌肌肉品质的遗传效应。结果表明：在SFRP5基因外显子3上共检测到2个突变位点,g.23253254 G>A的优势基因型和优势等位基因为GG基因型和G等位基因,频率分别为0.569和0.756;g.23253269 T>G的优势基因型和优势等位基因为TT基因型和T等位基因,频率分别为0.681和0.812,且2个位点的突变并未引起氨基酸的变化,为同义突变。2个多态位点的多态信息含量(PIC)均处于0.25~0.5之间,属于中度多态位点,卡方(χ2)检测显示：2个突变位点的基因型分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡。连锁不平衡分析发现,SFRP5基因的2个突变位点间均不存在强连锁不平衡。2个SNPs位点在长顺绿壳蛋鸡群体中发现了3种单倍型H1、H2和H3,其频率分别为0.569、0.187和0.244;6种双倍型H1H1、H1H2、H1H3、H2H2、H2H3和H3H3,频率分别为0.313、0.200、0.313、0.056、0.063和0.056。关联分析表明,SFRP5基因的g.23253254 G>A位点对胸肌粗脂肪含量有显著影响(P<0.05);2个SNPs位点组成的双倍型中,双倍型H3H3(AATT)对胸肌粗脂肪含量的影响达到显著水平(P<0.05),显著高于其他5种双倍型(P<0.05),揭示SFRP5基因的遗传变异能影响长顺绿壳蛋鸡胸肌脂肪沉积,g.23253254 G>A和g.23253269 T>G变异位点可能作为提高长顺绿壳蛋鸡胸肌脂肪的分子标记。本研究为进一步探明SFRP5基因变异调控家禽肌肉品质的分子机制提供了理论依据。

• 白背飞虱中肠内与SRBSDV P6蛋白互作的介体因子鉴定

  赵忠豪, 潘慧, 杜娇, 陈建斌, 刘勇, 章松柏, 郑立敏

  南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)由白背飞虱(Sogatella furcifera)以持久增殖型方式进行传播。该病毒能够在白背飞虱体内大量增殖并使昆虫终生带毒,是因病毒在介体昆虫内能够诱导形成病毒复制工厂-病毒原质所致。SRBSDV病毒原质主要由病毒编码的P5、P6和P9-1 3个非结构蛋白及其介体因子参与形成。其中,P6蛋白分别和P5、P9-1蛋白及其介体因子相互作用,在病毒原质形成过程中发挥重要作用。为了揭示哪些介体因子参与调控SRBSDV在昆虫体内的增殖过程,本实验利用酵母双杂交技术,将SRBSDV P6基因构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7上,并转化酵母感受态细胞Y2HGold,Western blot分析显示P6蛋白在酵母感受态细胞内成功表达,表达的P6蛋白对细胞无毒性和自激活活性。本研究以携带SRBSDV的白背飞虱中肠cDNA文库为筛选对象,初探介体昆虫内与SRBSDV P6蛋白相互作用的蛋白。在酵母Y2HGold细胞内经大量筛选和回转验证,最终获得5个可能与P6蛋白互作的介体因子。这些介体因子主要参与基因的转录、蛋白质翻译、蛋白翻译后修饰和蛋白质的合成过程。本实验为深入解析介体因子调控病毒的复制过程和白背飞虱高效传播病毒的分子机制提供了理论基础。

• 高等植物CCD亚家族基因研究进展

  刘玉成, 张超, 董彬, 赵宏波

  类胡萝卜素是植物中一类重要的色素群,经类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dixoygenases, CCDs)或非酶作用合成的阿朴类胡萝卜素及其衍生物在植物中可以作为着色剂、植物激素、芳香物质和信号物质。CCD基因家族包括CCD和NCED两个亚家族。到目前为止,植物中克隆得到的CCD亚基因家族成员有5个,包括CCD1、CCD2、CCD4、CCD7和CCD8;其中CCD1和CCD4参与了多种植物花、果实的着色及其香气物质(如α-紫罗酮、β-紫罗酮)的形成;CCD2仅在藏红花属(Crocus)植物中发现,参与藏红花属植物的花香和花色物质(如藏花酸)的形成;CCD7和CCD8参与激素独脚金内酯的合成。本文概述了高等植物中各类CCD亚家族基因成员的结构、表达特性和功能等,并展望了进一步的研究方向和重点,以期为该基因家族功能研究和今后的应用提供参考。

• 鱼类促性腺激素释放激素3 (GnRH3)来源、进化及功能研究进展

  孙静, 孙爱, 吴立新, 胡红霞

  GnRH3 (gonadotropin releasing hormone-3)是促性腺激素释放激素家族成员之一,是鱼类所特有的GnRH类型。鱼类GnRH3具有经典的十肽结构,通过与促性腺激素释放激素受体的结合,在鱼类的性腺发育成熟和感觉调节中起着至关重要的调控作用。本文主要从以下四部分进行了论述,一、GnRH3的结构：其由3个内含子和4个外显子组成,非编码区及内含子与脊椎动物不同,但编码区高度保守;二、鱼类GnRH3的来源：产生于两轮基因组复制事件,最终在鱼类中保留下来;三、GnRH3的产生迁移：嗅区和胚胎外胚层的GnRH3神经元最终迁移到达视前区、腹端脑;四、GnRH3的研究功能进展。本文综述了GnRH3的研究进展,并对未来的发展前景进行展望,旨在为鱼类繁殖调控提供理论依据。

• 美国花生种质资源果腐病抗性分子标记的筛选及分析

  刘阳杰, 何美敬, 崔顺立, 杨鑫雷, 穆国俊, Charles Y CHEN, 刘立峰

  花生(Arachis hypogaea)果腐病(pod rot)是一种由真菌引起的严重病害,直接影响花生的产量及品质。抗病育种是该病害防治最经济、有效的途径,而抗性相关分子标记的筛选和利用又是提高选择效率和加快育种进程的重要手段。本研究以引进的77份美国花生种质资源为材料,利用12对SSR标记和48对插入缺失(insertion-deletion, InDel)标记,通过Pearson相关分析和多元线性逐步回归筛选与花生果腐病抗性相关的标记,并利用构建的分离群体对相关标记进行了验证。结果表明,美国种质资源遗传多样性丰富,具有不同抗性级别的材料。利用12对SSR引物对77份美国种质资源进行扩增,共获得103条多态性条带,多态性比率在20%~100%,平均79.23%。从受害指数进行相关和多元线性回归分析,获得了4个与花生果腐病抗性显著相关的SSR标记,分别为3A8、GM1760、PM163和14H6。分离群体验证结果表明获得的4对SSR标记可用于花生果腐病抗性分子标记的深入研究。15对InDel标记在材料中具有多态性,通过果腐病抗性-标记相关性分析获得了2对InDel标记,分别是InDel-004和InDel-020。花生果腐病抗性相关分子标记的获得为分子辅助选择育种及抗病相关基因的挖掘提供了重要参考。

• 竹花叶病毒SYBR GreenⅡ反转录实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

  朱丰晓, 陈家璐, 张智俊

  竹花叶病毒(Bamboo mosaic virus, BaMV)是目前为止被发现感染竹类植物唯一的RNA病毒,严重影响竹类植物经济价值。因此,快速准确检测BaMV,对其预防和控制具有重要意义。本研究参考BaMV外壳蛋白基因(coat protein, CP)保守区设计2对特异性引物,运用反转录实时荧光定量PCR (reverse transcription real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)法对该病毒进行定性和定量分析,建立了一套基于SYBR GreenⅡ的BaMV的RT-qPCR检测体系。该检测体系的标准曲线循环阈值(Ct)与模板浓度的对数呈现良好的线性关系,扩增效率和相关系数分别为100%和0.999。重复性实验表明组内及组间变异系数均在1.5%以内。同时,利用此方法首次检测到8个不同竹种中亦存在BaMV。结果表明,SYBR GreenⅡRT-qPCR检测竹花叶病毒的方法灵敏、特异、重复性好,可用于竹花叶病毒的快速检测。