农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2024年第3期

• 水稻DUF1771基因家族的全基因组鉴定与表达谱分析

  肖秀文, 杜强, 王志龙, 高芙蓉, 杜文, 唐文帮, 陈秋红

  未知功能结构域1771 (domain of unknown function 1771, DUF1771)基因家族是植物中一个功能未被鉴定的家族。本研究通过生物信息学技术在水稻(Oryza sativa)中鉴定了5个DUF1771家族成员,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴定到的4个DUF1771家族成员进行系统进化树分析,9个DUF1771家族成员可分为2个亚族,保守基序分析发现motif 1和motif 2在所有的DUF1771家族成员中存在。5个OsDUF1771基因家族成员的启动子中与各类胁迫响应和激素响应相关的顺式作用元件整体相对较少,以OsDUF1771-1为最少。实时荧光定量PCR分析显示,OsDUF1771家族成员在各类激素处理前后水稻中的表达水平变化幅度整体上不大。在低温、干旱和稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)处理水稻时,OsDUF1771-1, 2, 3, 5虽然有一些响应变化,但变化幅度亦不大,OsDUF1771-4对低温处理具有相对最大的响应,在处理12 h的表达水平是未处理样品的4.54倍。在4个OsDUF1771家族成员的启动子中均发现了种子储存蛋白代谢调控相关元件O2-site,仅OsDUF1771-1的启动子中未发现此元件,这与各成员的组织表达谱检测结果相吻合,OsDUF1771-2, 3, 4, 5均在穗中具有最高的表达水平,而OsDUF1771-1在叶中具有最高的表达水平,且OsDUF1771-1编码蛋白预测定位于叶绿体。此外OsDUF1771-3的启动子中还含有胚乳特异表达元件GCN4-motif,进一步说明OsDUF1771-3在水稻种子的胚乳储存蛋白代谢中发挥功能,本研究为深入解析OsDUF1771家族成员的生物学功能提供了重要线索。

• 玉米热激转录因子ZmHsf06的耐热功能及其调控通路研究

  李冉, 马贞玉, 张世昌, 李国良, 孟祥照, 段硕楠, 刘子会, 吕爱枝, 郭秀林, 张华宁

  玉米(Zea mays)不同生育期遭遇高温热浪渐成常态,严重影响产量和品质。热激转录因子(heat shock transcription factor, Hsf)能够激活下游多种耐热途径,调控耐热相关基因表达从而提高植株耐热性。本研究在前期对玉米HsfA1亚族基因ZmHsf06特性及耐热性功能初步研究的基础上,通过创制ZmHsf06过表达玉米株系,深入研究该基因的耐热功能,进一步通过染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation, ChIP-seq)和蛋白互作及转录激活活性实验,分析并确定ZmHsf06的下游靶基因和高富集通路。结果表明,ZmHsf06能自身互作形成同源多聚体,具有转录激活活性;与野生型相比,ZmHsf06过表达玉米株系的耐热性明显提高。ChIP-seq分析表明,热胁迫下共富集差异基因2 218个,其中受ZmHsf06诱导特异上调的基因有1 169个,主要富集在电子载体活性、光合作用、内质网蛋白加工和热激响应等通路中。ZmHsf06结合基序同时含有热激元件、C2C2、TEAD、MADS等其他转录因子的结合元件和一些未知元件。凝胶迁移实验表明,ZmHsf06蛋白与筛选出的3个代表性基因(Zm00001d000260, Zm00001d000272, Zm00001d033987)的启动子热激元件互作。本研究为深入研究玉米Hsf家族的耐热功能及其分子机制提供依据。

• 东方百合'索邦' LoSorNINJAs基因克隆与表达分析

  朱云涛, 赵一燃, 陈明辉, 胡钧舒, 杨捷, 刘筱林, 孙婷婷, 孔祥红, 骆远方, 聂玉微, 高雪, 何恒斌

  茉莉酸(jasmonic acid, JA)是一种重要的植物内源激素,在植物生长发育和防御响应中发挥重要作用。NINJA (novel interactor of JAZ)蛋白是JA信号转导途径的抑制子。本研究基于转录组数据,从东方百合'索邦' (Lilium hybrid divisionⅦ cv. 'Sorbonne')中鉴定到2个NINJAs基因,分别命名为LoSorNINJA1 (GenBank No. OQ715340)和LoSorNINJA2 (GenBank No. OQ715341)。生物信息学分析表明,LoSorNINJA1和LoSorNINJA2蛋白均含有保守的EAR基序和Jas结构域,符合NINJA基因家族的特征。系统进化分析表明,LoSorNINJAs与深圳拟兰(Apostasia shenzhenica)、桃红蝴蝶兰(Phalaenopsis equestris)和铁皮石斛(Dendrobium catenatum)的NINJA亲缘关系最近。烟草(Nicotiana tabacum)亚细胞定位结果表明,LoSorNINJA1和LoSorNINJA2均定位于细胞核。对于不同组织进行的基因表达分析表明,LoSorNINJA2在外花被及花药中表达量较高,LoSorNINJA1在上部叶中表达量较高。收集低温贮藏及温室定植后的'索邦'鳞茎茎尖进行qRT-PCR分析,LoSorNINJA1在冷藏2和6周有2个表达量高峰,LoSorNINJA2在冷藏6周有1个表达量高峰。利用GENIE3构建的潜在基因调控网络表明,LoSorNINJA1可能参与组织发育和胚胎后发育等过程,LoSorNINJA2可能参与对外界环境的响应。上述结果提示,LoSorNINJA1与LoSorNINJA2可能发生了功能分化,发挥功能的部位和发育时期也可能不同。本研究结果为深入解析NINJAs在百合休眠解除中的功能提供了基础资料。

• 钩吻GeCYP85A1基因的克隆与表达分析

  章瑶, 陈文强, 潘丽梅, 穆德添, 周宇, 林孝东, 刘兆颖, 唐其

  钩吻(Gelsemium elegans)是我国一种极具价值的传统中药材,全株剧毒,但具有抗肿瘤、镇痛等作用,还对猪等禽畜有增肥之效,其主要的活性成分为萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids, TIAs),其中最有代表性的成分为钩吻素己,其毒性最强、活性最高。本研究根据钩吻基因组和转录组数据,筛选出细胞色素P450 (cytochrome P450, CYP450)相关的209条基因序列,结合代谢组数据,通过“基因组+转录组+代谢组”共表达分析方法,筛选出与钩吻素己生物合成途径相关的重要候选基因GeCYP85A1 (GenBank No. OQ653843),通过PCR技术对该基因进行克隆,并对其进行生物信息学分析,利用qPCR技术分析了GeCYP85A1在钩吻不同组织的表达模式。结果显示,GeCYP85A1基因全长1 392 bp,编码463个氨基酸,其理论相对分子质量为53.390 06 kD,理论等电点为9.07;亚细胞定位于叶绿体,有一段跨膜区,无信号肽,为非分泌性蛋白;含有16个糖基化位点和37个磷酸化位点,为亲水性蛋白质;与阿拉比卡咖啡(Coffea arabica)、欧基尼奥伊德斯种咖啡(Coffea eugenioides)、黄色猴面花(Erythranthe guttata)、烟草(Nicotiana tabacum)、木樨榄(Olea europaea subsp. europaea)、松蒿(Phtheirospermum juttata)、丹参(Salvia miltiorrhiza)、芝麻(Sesamum indicum)和河岸葡萄(Vitis riparia)九个物种的同源CYP85A1氨基酸序列相似度高,属于CYP450家族的一类亚族。通过qPCR技术,检测发现该基因在不同部位的表达模式与钩吻素己在不同部位的相对含量趋势一致,均为根>花>茎>叶。本研究为进一步阐明钩吻TIAs类生物碱的生物合成途径提供了一定的参考依据。

• 铁皮石斛蔗糖合酶DoSUS2基因克隆与表达分析

  刘羽佳, 理雅, 姜雅涵, 何彬荣, 陈嘉仪, 于白音, 李翔, 刘博婷

  蔗糖合酶是调控蔗糖代谢的关键酶,催化蔗糖进入各种代谢途径,在植物生长发育、信号转导和逆境抵御等过程中发挥重要作用。为探究铁皮石斛(Dendrobium officinale)蔗糖合酶2 (sucrose synthase 2, DoSUS2)在多糖合成代谢及非生物胁迫响应中的调控机制,本研究从铁皮石斛叶组织中克隆了DoSUS2基因,并对其进行了生物信息学分析和表达特性研究。结果显示,DoSUS2基因(GenBank No. OQ657188) ORF全长2 424 bp,编码807个氨基酸,与参考序列(基因ID: LOC110110417)有36个碱基差异,全部为同义替换。DoSUS2蛋白理论分子量92.05 kD,理论等电点为5.97,为疏水性稳定蛋白,无跨膜区域,含有1个信号肽和69个磷酸化位点,具有SUS蛋白保守的蔗糖合酶和糖基转移酶结构域,与拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtSUS1蛋白的氨基酸序列同源性高达73.82%,属于单子叶植物SUSⅠ型亚组。DoSUS2基因在不同组织中的表达水平存在明显差异,在根和花器官中的表达量相对较高,在叶和茎中的表达量较低。DoSUS2基因启动子序列含有多个非生物胁迫响应相关元件,且低温、干旱和脱落酸(abscisic acid, ABA)能够诱导DoSUS2基因表达。在低温和ABA处理6 h后,DoSUS2基因表达量极显著上调(P<0.01),分别达到处理前的267倍和233倍;在干旱处理9 h后,DoSUS2基因表达量也达到最高值,为处理前的18.6倍(P<0.01),推测DoSUS2基因可能通过ABA信号通路参与低温和干旱胁迫响应过程。DoSUS2蛋白与多个糖代谢密切相关的酶存在互作关系,推测该基因可能通过调节相关酶基因的表达和糖的代谢途径,在非生物胁迫应答过程中发挥作用,从而提高铁皮石斛对逆境胁迫的耐受能力。本研究为后续进一步研究DoSUS2基因功能及其在多糖合成代谢和非生物胁迫响应中的作用机制提供理论依据。

• 共轭亚油酸对肉牛肌内前脂肪细胞增殖与分化的影响

  万荣, 农斯伟, 周振明, 孟庆翔

  前脂肪细胞广泛存在于牛肉的肌纤维中,同时,在肌束间也分布有大量前脂肪细胞,其增殖以及分化水平在牛肉大理石花纹的形成过程中影响较大,可直接影响牛肉品质。本研究旨在探究共轭亚油酸(conjugated linoleic acid, CLA)对鲁西黄牛(Bos taurus)肌内前脂肪细胞增殖与分化的影响,通过构建体外细胞模型,设计0、50、100和150 μmol/L CLA处理培养于基础培养基中的肉牛肌内前脂肪细胞4 d,研究CLA对肉牛肌内前脂肪细胞增殖的影响。流式细胞术分析显示,与对照组相比,100 μmol/L CLA显著增加了S期细胞比例(P<0.05, 增幅1.63倍),减少了G0/G1期细胞比例(P<0.05, 降幅9.2%),其余处理组差异不显著(P>0.05),表明100 μmol/L CLA显著促进肉牛肌内前脂肪细胞的增殖(P<0.05)。不同剂量的CLA处理培养细胞6 d,细胞内脂肪含量测定和qRT-PCR分析表明,100和150 µmol/L CLA显著增加了肌内前脂肪细胞胞质内脂肪含量(P<0.05);其中,50、100和150 µmol/L CLA可使得过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)、增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα)的表达显著提升(P<0.05),其中,100 μmol/L CLA处理组同对照组相比,PPARγ基因的表达水平升高幅度约3倍,C/EBPα基因的表达水平升高幅度约2倍。设计CLA (100 µmol/L)、胰岛素(10 μg/mL)和地塞米松(0.25 μg/mL) 4种组合的分化培养基诱导培养细胞6 d,CLA、胰岛素和地塞米松同时加入培养基时,处理细胞的胞质中脂肪含量显著增加,而当分别去除地塞米松、胰岛素或CLA后,细胞质中脂肪的含量分别下降了74%、68%和31%。以上结果表明,CLA可有效促进肉牛肌内前脂肪细胞增殖,诱导细胞胞质内脂滴的生成,且能升高PPARγ和C/EBPα基因的表达水平,从而刺激肉牛肌内前脂肪细胞的分化。本研究为优良肉质地方黄牛培育及营养调控肉牛肌内脂肪沉积提供理论基础。

• 日粮添加不同种类和比例复合益生菌对湖羊瘤胃微生物群落的影响

  王智伟, 田林涛, 刘林丽, 杨雨鑫, 叶丙奎, 张恩平

  高精料日粮舍饲肥育在提高肉羊(Ovis aries)日增重的同时也导致其瘤胃产酸发酵过快,机体代谢失衡。复合益生菌可以利用多种益生菌的协同作用维持反刍动物胃肠道菌群平衡,促进机体生长和发育。为研究日粮中添加不同种类和比例复合益生菌对湖羊瘤胃微生物群落的影响,将体重日龄接近的健康雄性湖羊羔羊60只随机分为4个处理组,对照组饲喂基础日粮,实验1、2、3组分别在基础日粮中添加2%、4%复合益生菌FA1和2%复合益生菌FA2。饲喂第60天,称量实验羊体重、采集瘤胃液测定pH,通过细菌16S rRNA测序,检测瘤胃液微生物组成。结果表明：与对照组相比,添加益生菌的各实验组平均日增重有增加趋势,但差异不显著,平均料重比均显著降低(P<0.05)。瘤胃微生物Alpha多样性和Beta多样性指数组间差异不显著。实验1组丰度显著升高的菌群为梭状芽胞杆菌属(Clostridia_UCG-014),实验2组丰度显著升高的菌群为细小杆菌属(Solobacterium),实验3组丰度显著升高的菌群为毛螺菌属(Lachnospiraceae_NK3A20_group)和氨基酸球菌属(Acidaminococcus),实验2组纤维降解(cellulolysis)功能通路显著降低,且粪便中粗纤维含量显著升高(P<0.05)。本研究表明,在日粮中添加不同种类和比例复合益生菌均能够提高瘤胃液pH和厌氧益生菌丰度,进而提高湖羊生长性能,但4%复合益生菌FA1对于日粮粗纤维表观消化率具有负向作用。该研究为复合益生菌的理论研究和生产应用提供了参考。

• 奶山羊转录因子FoxO1启动子克隆及活性分析

  赫秋亚, 罗军, 高梁嘉慧, 邬娇, 姚玮玮

  叉头框蛋白O1 (forkhead box protein O1, FoxO1)是调控脂肪酸代谢的关键转录因子。尽管在非反刍动物中已经证明FoxO1启动子受上游转录因子的调节,但FoxO1启动子在奶山羊(Capra hircus)泌乳过程中的调控机制尚不清楚。本研究根据云南黑山羊基因组序列设计引物,克隆FoxO1基因5'侧翼序列;利用在线软件对FoxO1启动子序列进行生物信息学分析,预测转录因子的结合位点;利用缺失突变方法构建包含不同长度FoxO1启动子片段的双荧光素酶报告载体,利用重叠延伸PCR方法构建包含顺式作用元件突变的双荧光素酶报告载体,与内参载体共转染山羊乳腺上皮细胞(goat mammary epithelial cell, GMEC),利用双荧光素酶系统检测启动子活性。结果显示,从奶山羊血液基因组中克隆得到1 500 bp FoxO1启动子序列;生物信息学分析发现,FoxO1启动子上存在2个FoxO1结合位点;缺失突变结果表明,FoxO1启动子的活性中心位于转录起始位点上游-95~-24 bp;过表达FoxO1可显著上调FoxO1启动子活性;突变近侧的FKH1 (forkhead transcription factor 1)结合位点(-359 bp),FoxO1启动子活性显著下降,同时突变FKH1和FKH2位点后,FoxO1启动子活性与FKH1位点单突变无显著变化。上述结果表明,FoxO1通过与启动子上FKH结合元件的顺式作用促进FoxO1转录。本研究为FoxO1基因启动子的功能研究提供理论参考,为构建奶山羊乳腺组织中脂肪酸代谢网络提供基础资料。

• 山羊CIDEa基因过表达对乳腺脂质合成的影响

  孙雨婷, 李佩韦, 苏丽娜, 胡罕, 吴晓民, 李君

  诱导细胞死亡的DNA片段化因子-α样效应因子a (cell-death-inducing DNA fragmentation factor-α-like effector a, CIDEa)是一种脂滴相关蛋白,参与调节脂代谢和维持机体能量平衡。为了进一步探讨CIDEa在奶山羊(Capra hircus)乳腺脂质代谢中的功能,本研究以奶山羊乳腺上皮细胞为模型,通过构建pcDNA3.1-CIDEa过表达载体研究CIDEa基因对乳腺细胞脂质合成的影响。结果发现,乳腺上皮细胞转染pcDNA3.1-CIDEa过表达载体48 h后,CIDEa基因表达量上升了近10倍(P<0.01);甘油三酯(triacylglycerol, TAG)检测和油红O染色结果显示,过表达CIDEa基因后乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量显著升高(P<0.05)且脂滴积累增多;实时定量PCR检测结果显示,过表达CIDEa基因后脂代谢相关基因乙酰辅酶A羧化酶α (acetyl-CoA carboxylase alpha, ACACA)、抗原分化簇36 (cluster of differentiation 36, CD36)和固醇调节元件结合蛋白1 (sterol regulatory element binding protein1, SREBP1)的表达量显著升高(P<0.05),二酰基甘油酰基转移酶2 (diacylglycerolacyltransferase2, DGAT2)的表达量极显著升高(P<0.01)。以上结果表明,CIDEa基因能促进乳腺上皮细胞脂质的合成。本研究为深入研究CIDEa基因在奶山羊乳脂代谢调控中的作用提供了理论参考。

• 重组猪α干扰素/白细胞介素-2的可溶性表达及体外活性研究

  冯桂丹, 闫若潜, 马震原, 柴茂, 周建浩, 康台生, 王淑娟, 杨海波, 刘影, 谢彩华, 赵雪丽, 王翠

  猪(Sus scrofa) α干扰素/白细胞介素-2 (porcine interferon α/porcine interleukin-2, PoIFN-α-linker-PoIL-2)在大肠杆菌(Escherichia coli)中多以包涵体形式表达,为在大肠杆菌系统中获得可溶性表达的具有活性的重组猪α干扰素/白介素2 (rPoIFN-α-linker-PoIL-2)蛋白,本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因进行可溶性改造并合成。将改造后的PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因克隆到表达载体pET-32a(+)进行原核表达,采用镍铬亲和层析柱对表达的可溶性rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白进行纯化。分别采用淋巴细胞增殖检测法、ELISA方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白体外促猪外周血T淋巴细胞(peripheral blood T lymphocyte, PBLC)增殖活性,及其与抗猪白介素2单抗、抗猪α干扰素单抗发生特异性免疫反应的活性;采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在不同细胞系上抑制不同病毒的增殖活性。结果显示,PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因可在大肠杆菌中高效可溶性表达,表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白分子量大小约55 kD。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白经镍铬亲和层析柱纯化后纯度达90%以上。rPoIFN-α-linker-PoIL-2具有显著的促PBLC增殖活性(P<0.05);可以与抗PoIL-2、PoIFN-α单抗发生特异性免疫反应。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在不同细胞上抑制不同病毒的增殖活性效价有差异,在猪肾细胞(porcine kidney cells, PK)-15、人羊膜细胞(human amniotic cells) WISH上抑制水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)增殖的活性单位分别为1.8×106和2.5×106 IU/mg;在PK-15细胞上抑制伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)、塞内卡病毒(Seneca virus A, SVA)增殖的活性单位分别为2.2×104、1.3×105 IU/mg;在非洲绿猴肾细胞(Verda Reno, Vero)上抑制猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)增殖的活性单位为3.2×104 IU/mg。本研究获得了可溶性表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白,该蛋白在不同细胞上具有抑制VSV、PRV、SVA及PEDV等病毒增殖的活性,为进一步研究rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在猪体内的活性提供了基础资料。

• 氧化应激对公鸡睾丸组织结构及睾酮合成相关基因表达的影响

  吴冰燕, 曹原, 刘思丽, 刘亚美, 丁香, 凌义强, 胡威, 方满新, 刘犇, 王小月

  禽类生长繁殖过程中易受各种应激因素的影响,其中以氧化应激最为突出。为探究氧化应激对鸡(Gallus gallus)睾丸组织结构及睾酮合成相关基因表达的影响,本研究利用敌草快(diquat)作为氧化应激诱导剂,将60只180日龄的健康康乐黄公鸡随机平均分成4组：对照组、敌草快5 mg/kg组、敌草快15 mg/kg组和敌草快20 mg/kg组。待21 d处理结束后采集鸡睾丸组织样品,利用qRT-PCR技术和抗氧化功能检测试剂盒分别检测氧化应激相关基因核因子红细胞2相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)、半氧合酶1 (hemeoxygenase-1, HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶1 (glutathione peroxidase 1, Gpx1)的表达水平和过氧化氢酶(catalase, CAT)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)的活性及丙二醛(malondialdehyde, MDA)的浓度,确定氧化应激发生情况;利用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE staining)检测氧化应激对睾丸组织结构的影响,利用Western blot技术分别检测细胞凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)和半胱氨酸蛋白酶3 (Caspase3)的表达量变化,通过qRT-PCR和Western blot技术分别检测睾酮合成相关基因类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1, Cyp11a1)和3β-羟基类固醇脱氢酶1 (3β-hydroxysteroid dehydrogenase 1, Hsd3b1)的mRNA和蛋白表达量变化。结果显示,与对照组相比,不同剂量敌草快组睾丸中氧化应激相关分子HO-1、Nrf2和Gpx1的mRNA水平显著下调(P<0.05),CAT和T-SOD酶活性显著降低(P<0.05),MDA浓度显著升高(P<0.05);HE染色结果表明,睾丸经敌草快诱导作用后结构受到损伤,曲精小管中的精子发生受到明显抑制,随着敌草快处理浓度的升高,曲精小管中的生殖细胞发生严重凋亡;Bax和Caspase3的蛋白表达量显著上调(P<0.05),Bcl-2显著下调(P<0.05);睾酮合成相关基因StAR、Cyp11a1和Hsd3b1的mRNA及蛋白表达量均发生显著下调(P<0.05)。以上结果表明,氧化应激对鸡睾丸组织结构造成一定程度的损伤,促进睾丸生殖细胞的凋亡,对睾酮合成相关基因的表达具有显著抑制作用。本研究可为探讨氧化应激损伤鸡繁殖性能的机制提供基础资料。

• 斑点叉尾鮰伪雌鱼卵巢发育评估及比较转录组研究

  徐思琪, 张世勇, 王明华, 刘洪岩, 钟立强, 陈校辉

  培育XY型伪雌鱼是获得生长更快的全雄品系斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的必要环节。为探究17β-雌二醇诱导后的斑点叉尾鮰XY型伪雌鱼成鱼卵巢发育情况及性别分化期内转录组表达变化,本研究根据遗传性别鉴定结果,利用组织学、解剖学方法观察供试鱼卵巢发育情况及卵母细胞发育水平,统计性腺指数,评估3龄XY型伪雌鱼性腺发育情况,并对60日龄XY型伪雌鱼和正常雌鱼进行转录组测序。结果显示,不同规格(500~2 000 g)的3龄XY型伪雌鱼个体性腺指数差异较大,而大规格3龄的XY型伪雌鱼和正常雌鱼的性腺指数和发育程度均无显著差异,卵巢组织呈长囊状,血管密布,卵内充满卵黄;卵母细胞均以卵黄生成期卵母细胞为主,并伴有皮层滤泡期卵母细胞和少量初级卵母细胞。转录组测序发现,60日龄XY型伪雌鱼和正常雌鱼卵巢之间存在11 288个差异表达基因,差异基因富集在多个与免疫学相关的生物过程和信号通路;根据GO富集和KEGG信号通路,在前30个GO富集通路中筛选到了雌性结合体通路(female gamete generation),该通路中32个基因出现差异表达,其中孕酮受体(progesterone receptor, pgr)和雄激素受体(androgen receptor, ar)基因表达下调。本研究为斑点叉尾鮰性控育种提供繁殖生物学技术方法及理论依据。

• 近江蛏溶质载体6 (SLC6)基因家族的鉴定及其在盐胁迫下的表达分析

  王莎莎, 姚韩韩, 何琳, 何京, 董迎辉, 林志华

  膜转运蛋白的溶质载体6 (solute carrier 6, SLC6)基因家族被称为神经递质转运体,在水生生物应激胁迫调控、渗透调节中发挥着重要作用。本研究对近江蛏(Sinonovacula rivularis) SLC6基因家族成员(SrSLC6)进行了鉴定和生物信息学分析,并分析了其在盐胁迫下的表达模式。结果表明,近江蛏共有29个SrSLC6基因家族成员,分属于4个亚家族,具有12个保守基序和2个保守结构域SLC6sbd-TauT-like和SLC5-6-like_sbd;在高、低盐度胁迫下,16个SrSLC6基因呈现不同的表达响应,表达量随盐度变化呈现不同程度的上调或下调;与盐度适应相关的近江蛏氨基酸转运体4 (amino acid transporter 4 of S. rivularis, SrAAT4)蛋白主要定位在鳃中鳃丝侧面的侧纤毛柱状细胞和扁平细胞,表达模式与转录组表达谱趋势相同,即在低盐胁迫不同时间点表达量均显著下降(P<0.05),在高盐胁迫不同时间点表达量均显著升高(P<0.05)。综上结果表明,SrSLC6基因家族成员氨基酸转运体(amino acid transporters, AATs)和神经递质转运体(neurotransmitter transporters, NTTs)可能在近江蛏渗透压调节中发挥关键作用。本研究为深入开展SLC6基因家族在双壳贝类渗透压调节和盐度适应研究提供理论依据。

• 长期有机种植模式下日光温室蔬菜栽培土壤真菌多样性研究

  曾广娟, 王晗, 赵美微, 彭红丽, 冯阳, 耿世刚

  有机种植能够通过保护土壤有机质来提高土壤肥力和生物多样性;温室栽培可以人为控制植物生长环境,保护作物免受病虫害、极端天气条件和农药漂移等室外干扰。本研究以2种不同土地利用方式(日光温室和露地)(0~15) cm表层土壤和(15~30) cm深层土壤为研究对象,采用Illumina高通量测序技术分析土壤真菌群落结构的差异,基于距离的冗余分析(distance-based redundancy analysis, dbRDA)明确影响真菌群落结构的土壤环境因子,结合FunGuild分析土壤真菌功能对日光温室栽培的响应。结果表明,温室有机栽培显著降低了表层土壤真菌群落的丰富度和多样性(P<0.05)。不同土地利用方式的优势真菌均为子囊菌门(Ascomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和担子菌门(Basidiomycota),不同土地利用方式没有改变土壤优势真菌的种类,但显著影响了其相对丰度。日光温室栽培增加了Chaetomium、Mortierella、Orbilia、Acaulospora等有益真菌的数量和丰度,抑制了表层土壤中植物病原菌Fusarium的生长。组间群落差异分析(LEfSe)表明,温室及露地土壤分别检测到22和21个显著差异物种。温室土壤中的被孢霉门(Mortierellomycota)、罗兹菌门(Rozellomycota)及Chaetomium、Mortierella、Humicola 3个真菌菌属为显著差异菌群;露地土壤中Fusarium、Stachybotry、Cephaliophora 3个菌属起主导作用。dbRDA分析表明,全钾(total potassium, TK)、土壤有机质(soil organic matter, SOM)、pH、全氮(total nitrogen, TN)、全磷(total phosphorus, TP)是显著影响温室土壤真菌群落的环境因子。FunGuild功能预测分析显示,温室土壤中最优势的功能类群为土壤腐生菌,露地土壤中最优势的功能类群为病理-腐生菌。综上,有机种植模式下温室蔬菜栽培能显著影响真菌群落结构和功能,提高土壤有益真菌相对丰度,降低病原真菌丰度,真菌生态功能的改变与不同土地利用方式带来的环境变化相适应。本研究揭示了有机种植模式下日光温室蔬菜栽培对土壤真菌群落结构及其功能的影响,可为温室条件下土壤真菌的群落组成和长期有机耕作提供理论依据。

• 内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EndoEf)的固定化及催化特性分析

  王璐, 穆思宇, 王云霄, 李学俊, 徐全乐, 陈鹏

  酶法去糖基化是研究糖蛋白结构与功能的重要手段。传统的酶法去糖基多使用游离酶,反应体系残留的去糖基化酶成为后续糖蛋白分析(如质谱)潜在的污染信号来源,探索去糖基化酶新的利用方式对于糖蛋白糖链结构的分析具有重要价值。本研究对粪肠球菌(Enterococcus faecalis)来源的内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(endo-β-N-acetylglucosaminidase, EndoEf)进行了重组表达和纯化,以Sepharose CL 6B为固定化载体,采用环氧氯丙烷法活化,对EndoEf的固定化方法进行优化,并对固定化EndoEf的催化特性进行分析。研究结果表明,EndoEf可在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 Star (DE3)中高效表达,每升菌液可纯化186.5 mg EndoEf。EndoEf固定化的最优条件：在pH 8.0的50 mmol/L磷酸缓冲液中,按每克载体加入4.0 mg酶蛋白,4 ℃偶联12 h;固定化酶能去除核糖核苷酸酶B (ribonuclease B, RNase B)和鸡卵白蛋白(ovalbumin, Ova)的N-糖链,在4 ℃保存60 d仍具有活性;固定化EndoEf在30~40 ℃和pH 6.0~7.0的范围内具有良好的水解活性,对蛋白质变性剂二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)及十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)的耐受性较游离酶明显提高,可耐受12.0 mmol/L DTT和2.0% SDS的变性条件,并耐受1.0 mol/L NaCl高盐条件。基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)分析显示,离心可完全去除反应体系中的固定化EndoEf。固定化体系的建立及酶学性质的分析为该酶在糖蛋白研究中的实践应用提供了基础资料。

• miR-2779-x对MDCK细胞生长特性的影响及靶基因筛选验证

  黄玲巍, 杨迪, 靳莉武, 杨雅雯, 王家敏, 乔自林, 阿依木古丽•阿不都热依木

  犬肾细胞系MDCK (Madin Darby Canine Kidney)是生产流感病毒疫苗最常用的细胞系之一,miR-2779-x作为非编码RNA能够抑制MDCK细胞的自发肿瘤转化。本研究基于慢病毒系统构建过表达及敲低miR-2779-x的稳转细胞株,利用细胞增殖检测试剂盒CCK-8 (Cell Counting Kit-8)、细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒以及细胞划痕试验、软琼脂克隆试验对稳转细胞株进行检测。结果显示,miR-2779-x过表达使细胞增殖能力和相对迁移率显著降低(P<0.01)、侵袭能力增加(P<0.01),敲低细胞株的结果与之相反;过表达细胞株的早期凋亡率显著提高(P<0.01),敲低细胞株的晚期凋亡率显著提高(P<0.01);miR-2779-x过表达使细胞在S期发生阻滞,敲低细胞株在G0/G1期发生阻滞。半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose, TCID50)检测结果显示,转入过表达及敲低miR-2779-x慢病毒的MDCK细胞对甲型H1N1流感病毒株的敏感性无显著变化。通过qRT-PCR和Western blot验证miR-2779-x靶基因的表达变化,发现多个与转化致瘤和生长相关的基因受到miR-2779-x负调控,推测靶基因CASP9 (caspase 9)可能作为凋亡通路因子与PI3K/AKT信号通路共同调控MDCK细胞增殖。本研究为建立新型MDCK细胞系提供了新思路,可为流感疫苗生产提供更好的细胞基质。

• 假酶在植物生长发育和逆境胁迫中的作用

  李施祺, 朱祝军, 茹磊

  假酶(pseudoenzyme)是一类没有催化活性的蛋白,其氨基酸序列与具有正常功能的酶家族相似,但因已被证实或预测的保守催化氨基酸的突变,从而缺乏催化活性。但假酶可能促进或抑制活性酶的活性、竞争活性酶的底物、调节信号通路,或者作为蛋白骨架形成蛋白复合体等。假酶在医学领域中研究较多,在植物领域中的研究尚显匮乏。最近的研究表明,假酶在植物生长发育和逆境胁迫响应方面发挥重要作用。本文从假酶的定义、鉴定方法和进化过程,以及假酶在植物中的生物学作用等方面介绍假酶,并讨论了假酶在植物发育调控中的潜在作用。本综述为利用假酶调控植物生长发育提供新的思路。

• 全球基因编辑技术产业化发展分析及其在农业动物育种中的应用

  张萌萌, 蒋颖, 李宁

  为了解全球农业动物基因编辑技术专利及其产业化态势,本研究利用专利计量法,统计2015~2022年基因编辑技术领域专利数据,对该领域主要研发机构、主要研发团队、研究前沿热点及针对不同农业动物基因编辑技术的概况进行系统分析。结果显示,全球基因编辑技术专利在近8年呈上升趋势;中国申请公开的基因编辑技术专利数量排全球第1,但就整体而言,美国在基因编辑技术领域领跑全球;我国核心技术创新、论文专利质量、顶级研发机构和团队、知识成果转化及产业化机制等方面有待进一步提高。我国基因编辑技术专利在农业动物育种领域中数量较少,有些相关企业已完成千万级首轮融资。本研究对全球农业动物基因编辑产业化发展动态进行系统分析,为我国利用基因编辑技术破解农业动物育种重大难题提供参考。

• 籼型三系不育系'福农A'的选育及其综合农艺性状分析

  涂诗航, 连玲, 洪永河, 周鹏, 郑菲艳, 郑家团, 张建福

  杂交水稻(Oryza sativa)不育系是选育优良品种的重要前提之一,因此培育优异的不育系对杂交稻育种具有重要意义。本研究以高抗稻瘟病且优质的水稻品种'华航丝苗'作为供体亲本,与综合农艺性状优良但米质和稻瘟病抗性不佳的籼稻三系保持系'福稻B'进行杂交,在F3代中,选择优异单株做父本,用不育系'谷丰A'做母本进行测交;测交后代不断在三亚和沙县基地进行穿梭育种选择。经过多个世代的淘汰和选择,最终选育出了育性稳定的三系不育系'福农A',其对应的保持系定名为'福农B'。综合农艺性状分析发现,'福农A'株叶形态好,茎秆粗壮,剑叶挺直,其午前开花率达85%,茎秆的直径和厚度明显大于亲本。田间测试及显微观察结果显示,其不育株率为100%,花粉不育度为99.99%,柱头外露率为57.12%。'福农A'的茎秆倒三节直径明显较大,茎秆壁也明显较厚,且茎秆中半纤维素和硅含量较高。高密度芯片分析表明,'福农A'含有半矮秆基因Sd-1 (semi dwarfing gene 1)和Sdt97 (semi dwarfing mutant gene 97)、直穗基因qNGR9及粒重基因OsSPL16 (squamosa promoter-binding-like gene 16)。同时,'福农A'成功聚合了3个稻瘟病菌抗性基因Pi5 (Pyricularia oryzae resistance-5)、Pid2和Pid3,室内鉴定其抗病株率达81.82%。此外,利用'福农A'所育成的7个水稻品种均表现出产量高、米质好、中抗稻瘟病等特征。由此可见,'福农A'具有较强的开发潜力,能为配组和选育抗性好、产量高、米质优的杂交稻提供种质资源。

• 梯棱羊肚菌促生恶臭假单胞菌X14的分离鉴定

  雷潇, 周冰玉, 周宇, 唐少军, 杨迪, 任锐, 马文杰, 马文华, 邵晨霞, 杨祎, 许隽

  羊肚菌(Morchella spp.)是全球著名的珍稀食药用菌,羊肚菌在人工栽培过程中必须覆土才能出菇,目前土壤微生物影响羊肚菌生长发育的机理仍未知。本研究从梯棱羊肚菌(Morchella importuna)菌基土壤中分离得到132株细菌,平板对峙试验发现有15株与梯棱羊肚菌菌丝存在拮抗作用,4株有促生作用。其中菌株X14与羊肚菌平板共培养4和8 d,羊肚菌菌丝生长速率比对照分别显著增加7.6%和11.6% (P<0.05);将羊肚菌和菌株X14接种于麦粒试管中共培养,在不同培养时间测定羊肚菌的菌丝生长速率。结果显示,培养4、6、7 d时,菌株X14处理的羊肚菌菌丝生长速率分别比对照极显著提高28.3%、24.8%、24.0% (P<0.001)。将羊肚菌和菌株X14接种于原种瓶中共培养,结果显示,共培养5 d时,菌株X14处理的羊肚菌菌丝生长速率与对照无显著差异(P>0.05),共培养10 d时,菌株X14处理的羊肚菌菌丝生长速率比对照极显著提高14.1% (P<0.01),原种培养周期比对照缩短4~6 d。综合菌落形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果,菌株X14被鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。本研究从梯棱羊肚菌菌基土壤中筛选出1株恶臭假单胞菌X14能促进梯棱羊肚菌菌丝生长,为羊肚菌促生微生物菌剂的研发提供技术支持。

• 黄芪根腐致病尖孢镰刀菌实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用

  赵丽梅, 赵利, 田洪岭, 高芬

  尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是引起蒙古黄芪(Astragalus membranaceus var. mongholicus, AMM)根腐病的优势致病菌之一。为了快速准确地检测和定量黄芪植株及其种植地土壤中的尖孢镰刀菌,根据延长因子(elongation factor-1α, EF-1α)序列设计引物并验证其特异性,进而建立该病菌的实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qRT-PCR)检测体系,并运用该体系对黄芪和土壤样本内的尖孢镰刀菌进行检测。结果表明,设计的引物FaeF2/FaeR2特异性良好;所建体系对黄芪中尖孢镰刀菌DNA的检测灵敏度为0.896 pg/μL,土壤中尖孢镰刀菌孢子量的检测限度为102个分生孢子/g;标准曲线的相关系数分别为0.998和0.973;重复性评价显示该方法可靠、稳定。利用qRT-PCR方法对黄芪和土壤样本进行检测,接种发病样本、疑似发病样本和土壤样本中,尖孢镰刀菌的总检出率分别为100%、66.7%和43.75%;尖孢镰刀菌在黄芪中的定殖量与病情指数正相关,且相同种植年限下,发病土壤中尖孢镰刀菌孢子数显著大于健康土壤。综上结果表明,所建方法适用于黄芪及土壤中尖孢镰刀菌的检测。本研究可为黄芪根腐病的快速诊断、准确评价及土壤预警提供技术支持。

• 基于ORF3蛋白抗体的鹅圆环病毒间接ELISA检测方法的建立

  付环茹, 赵敏, 江锦秀, 陈翠腾, 张靖鹏, 李兆龙, 万春和

  鹅圆环病毒(Goose circovirus, GoCV)是一种潜在的免疫抑制病原,主要感染宿主淋巴细胞,导致免疫功能下降,易造成其他病原继发感染,给养鹅(Anser cygnoides orientalis)业带来极大危害。为建立鹅圆环病毒血清学抗体的间接ELISA方法,本研究将GoCV的ORF3基因插入到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-ORF3,经表达条件优化,以Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析表明,获得的重组ORF3蛋白具有良好的生物学活性。以纯化后的重组ORF3蛋白作为包被抗原,通过优化各反应条件建立了GoCV间接ELISA抗体检测方法。优化后的间接ELISA检测条件为：重组ORF3蛋白的最佳包被浓度为2.00 μg/mL、待检血清稀释度为1∶80、酶标二抗最佳稀释度分别为1∶4 000 (羊抗鸡HRP-IgG)和1∶8 000 (羊抗鸭HRP-IgG)。采用建立的间接ELISA方法对鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)、鹅源禽坦布苏病毒(Avian tembusu virus, ATmV)、鹅源H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenza virus, AIV)、鹅呼肠孤病毒(Goose reovirus, GRV)、新型鹅星状病毒(Goose astrovirus, GoAstV)、GoCV等鹅源阳性血清进行检测,结果显示,仅GoCV阳性血清为阳性结果,其他病原阳性血清检测结果均为阴性,特异性较强;重复性较好,批内和批间变异系数均小于5%。流行病学调查结果显示,福建和广东地区鸭(Anatinae)群中均存在GoCV跨种感染。本研究建立的检测GoCV血清抗体的间接ELISA方法特异性强、重复性好,可用于GoCV感染的诊断及流行病学调查研究。