农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2024年第9期

• 一年生野生稻染色体片段代换系的构建及株高和分蘖的QTLs鉴定

  蒋家焕, 蔡秋华, 魏毅东, 刘峰, 陈丽萍, 朱永生, 张建福

  利用野生稻优良基因改良水稻(Oryza sativa),提高水稻的产量和品质具有重要意义。本研究以一年生尼瓦拉野生稻(Oryza nivara)为供体亲本,籼型杂交水稻恢复系'福恢676' ('FH676')为受体亲本,构建了一套水稻染色体片段代换系。两亲本经过1次杂交、3次回交和多代自交后,对中选的502个BC3F7个体用全基因组 SNP 芯片进行检测,最终确定了474个含有供亲本基因组片段的株系作为建系群体。检测结果表明,遗传图谱中的SNP标记数多达1 429个,每条染色体的SNP标记数平均有119个。利用72个导入系(导入片段数≤4个)就可以基本覆盖全基因组,72个导入系中,野生稻片段总长度为581.84 Mb;其中代换片段总长度为306.56 Mb,覆盖基因组的82.75%。在海南三亚和福建尤溪两地考察了整套系的株高和有效分蘖穗,结合基因型,利用完备区间作图法对株高和有效分蘖穗进行QTL分析,2个环境中共检测到9个影响株高的QTL,分布在2、3、7、8、11号染色体上,其中3号染色体上的qPH-3在2个环境中均检测到;最终定位到1个与株高显著相关的QTL qPH-8-1,LOD 值16.79,表型贡献率9.16%。同时,检测到14个有效分蘖穗的QTLs,分布在2、3、4、5、6、7号染色体上,qETN-7-3、qETN-7-4、qETN-7-8在2个环境中均检测到;并最终定位到1个与有效分蘖数显著相关的QTL qETN-7-6,LOD值58.28,表型贡献率为32.86%。本研究为进一步对株高和分蘖的QTL精细定位提供了理论基础。

• 大豆GmRSZ21基因克隆及表达分析

  杜梦雪, 王德颖, 李婧御, 门庆美, 贺芸, 孟令志, 郭尚敬

  SR (serine/arginine-rich)蛋白家族是植物中一类关键调控因子,广泛参与植物生长发育的各个时期,并且能够响应非生物胁迫。本研究以栽培大豆(Glycine max)为对象,克隆了RSZ (Zn-knuckles-type arginine/serine-rich protein)亚家族的GmRSZ21基因(GenBank No. XP_014634806.1),并进行了生物信息学和表达分析。结果表明,GmRSZ21基因包含4个外显子和3个内含子,编码区全长561 bp,编码186个氨基酸,其中精氨酸占比最高(19.4%);GmRSZ21蛋白的相对分子量为21.36 kD,二级结构以无规则卷曲(57.53%)为主,没有跨膜结构域,无信号肽,为不稳定的亲水蛋白,预测定位于细胞核;氨基酸序列比对表明,GmRSZ21蛋白在不同物种中高度保守;系统发育分析显示,GmRSZ21蛋白与野生大豆(G. soja)中的同源蛋白具有最近的进化关系;GmRSZ21基因启动子包含20种顺式作用元件,其中光响应元件的种类最多(7种)。表达模式分析显示,GmRSZ21在大豆各组织中均有表达,在茎中表达量最高,在鼓粒始期豆荚中表达量最低;该基因受到干旱和盐胁迫的诱导,可能参与大豆对非生物胁迫的响应。本研究为SR蛋白家族功能解析以及该类蛋白在大豆分子育种中的应用提供参考。

• 基于SSR标记的花椰菜育种种质遗传多样性分析

  宋晓玉, 韩硕, 甘德芳, 宋顺华, 刘凡, 郭宁, 孟淑春

  花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)起源于欧洲,我国种质资源的遗传多样性较狭窄,亟待开展种质创新及创新种质的评价技术等研究。利用小孢子培养技术创制双单倍体(double haploid, DH)不但能缩短育种年限而且也是种质创新的重要手段。花椰菜小孢子再生株后代的遗传多样性评估,是利用双单倍技术进行种质创新和育种应用要解决的关键问题。本研究筛选出29对带型清晰稳定、多态性较好的SSR引物,PIC变幅为0.29~0.57,平均值为0.42。利用这29对引物,对由66份DH系和18份高代自交系组成的84份花椰菜育种种质群体进行标记分型研究。结果显示,材料的遗传距离主要集中在0.3~0.6,平均为0.56,遗传相似系数在0.50~0.97之间,平均为0.57,在遗传相似系数为0.55时,将材料共分为4组。通过DH材料的亲缘关系分析发现,F1杂种的DH系后代材料中能够获得遗传多样性较高的材料,DH育种可以作为花椰菜种质创新的重要手段。本研究为花椰菜遗传多样性的评价与利用提供理论支撑和技术支持。

• 茄子组蛋白基因家族全基因组鉴定及其低温胁迫下的表达分析

  林珲, 黄建都, 陈继兵, 王益奎, 朱海生, 温庆放

  组蛋白(Histone)是染色质的重要组成部分,在植物生长发育、响应逆境胁迫等方面发挥重要作用。为了探究Histone在低温响应中的特性,本研究通过生物信息学方法对茄子(Solanum melongena)Histone基因家族成员进行全基因组鉴定和分析,并挖掘其转录组数据,分析了2个不同抗性茄子(品系epl008与eplck)叶片在低温胁迫下Histones的表达模式。结果表明,茄子基因组中共鉴定出40个SmHistones基因,分布在9条染色体上,SmHistone基因家族成员被分成5个亚组(H1, H2A, H2B, H3和H4),同一组中的成员具有相似的理化特性、基因/蛋白质结构和保守基序。种内共线性分析发现,6对SmHistones基因存在共线性关系。启动子分析发现,SmHistone家族基因启动子含有大量低温响应元件、干旱响应元件等非生物胁迫响应元件。转录组和qRT-PCR分析发现,低温胁迫下26个Smhistones基因呈现差异表达,耐低温茄子品系epl008显著上调表达。茄子epl008中SmHistone3对低温胁迫响应诱导表达显著,揭示其可能与抗寒代谢响应密切相关。本研究为培育耐低温的茄子品种奠定了理论基础。

• '新郁'葡萄microRNA的鉴定及其高温胁迫响应分析

  牛丽丽, 武云龙, 刘丽媛, 宋洋波, 曹红燕, 杜婷婷, 王胜杰, 郗琳, 杨清, 孟冬, 周慧, 何坤祖

  高温胁迫是制约果树生产的主要逆境胁迫之一。葡萄(Vitis vinifera)是世界范围内具有较高经济价值的栽培水果作物,其生长发育经常受到高温胁迫的影响。研究葡萄高温胁迫响应机制对了解葡萄对高温胁迫的驯化具有重要意义。本研究采集'新郁'葡萄叶片进行高通量测序,分别构建了对照组和高温胁迫处理组的小RNA (small RNA, sRNA)文库,鉴定了一系列高温应激反应miRNA,并分析了其在高温耐受反应中的功能。共鉴定得到171个已知miRNA和251个新miRNA,其中6个已知miRNA和21个新鉴定miRNA在高温胁迫下差异表达,预测获得这些差异表达的miRNA靶基因共计297个。通过qRT-PCR对筛选出的10个miRNA及其靶基因表达进行了验证,结果表明这些靶基因对高温胁迫有明显响应。基因功能和通路分析表明,这些基因可能在耐高温胁迫中起重要作用。本研究结果为进一步了解果树驯化过程中的高温胁迫反应以及选育耐高温胁迫葡萄品种提供了理论基础。

• 草莓Trihelix转录因子家族的鉴定及表达分析

  陆洋, 张志强, 卢世雄, 毛娟, 陈佰鸿

  Trihelix是能与光应答元件GT元件进行特异性结合的转录因子,参与植物的生长发育及逆境胁迫响应。本研究从草莓(Fragaria vesca)全基因组范围内识别Trihelix转录因子家族成员,并对其进行了生物信息学和逆境胁迫下的表达分析。结果显示,草莓Trihelix转录因子家族包含26个成员,分布于chr01~chr07染色体上,其中,chr06染色体上分布最多,有7个Trihelix转录因子家族成员;亚细胞定位预测结果显示,FvTrihelix转录因子家族成员主要定位在细胞核和细胞质;系统进化分析表明,Trihelix蛋白分为5个亚家族,其中Group2、Group3、Group4和Group5分别包含1、3、11和11个FvTrihelix成员。顺式作用元件分析表明,该家族转录因子可能参与激素、干旱和低温胁迫;qRT-PCR结果表明,4 ℃处理下,FvTrihelix14相对表达量均显著高于对照(P<0.05),是对照的8倍,FvTrihelix15的表达量在10% PEG和4 ℃处理下与对照相比差异显著(P<0.05),分别是对照的12和14倍。综上所述,草莓Trihelix转录因子家族成员能够响应不同的逆境胁迫。本研究为草莓抗逆基因的筛选和应用提供了理论依据。

• 丹参SmCPS1和SmCYP76AH1双基因超表达转基因株系的获得及光合特性分析

  郭广洋, 李义龙, 胥华伟, 王婷, 侯典云, 吕淑芳

  丹参(Salvia miltiorrhiza)为中国传统中草药,其活性成分主要包含丹参酮类和丹酚酸类化合物。为了探索丹参酮合成途径中多个关键基因共同超表达后对丹参生长和活性物质积累的影响,本研究对丹参酮合成途径下游关键基因柯巴基焦磷酸合成酶基因1 (cobacyl pyrophosphate synthetase gene 1, SmCPS1)和细胞色素P450单加氧酶基因1 (cytochrome P450 monooxygenase gene 1, SmCYP76AH1)的组织表达及所编码蛋白的亚细胞定位进行了分析,并利用多基因垛叠表达系统构建了SmCPS1和SmCYP76AH1同时超表达的载体pYLTAC380H-SmCPS1-SmCYP76AH1,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的方法一次性转化丹参无菌苗,经过愈伤组织诱导培养、抗性和绿色荧光信号筛选、基因组整合鉴定及转化后基因转录水平的检测,获得了双基因共同超表达丹参株系。进一步对SmCPS1和SmCYP76AH1双基因超表达株系的丹参酮含量及光合和荧光特性进行了测定。结果显示,组织表达水平上,SmCPS1和SmCYP76AH1在丹参的根、茎和叶片中都有表达,二者都在丹参根中高表达;共聚焦显微镜扫描显示,SmCPS1定位于细胞质和叶绿体,SmCYP76AH1定位于内质网。SmCPS1和SmCYP76AH1双基因超表达株系根中的丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量都极显著提高(P≤0.01),叶片蒸腾速率(transpiratiom rate)和气孔导度(stomatal conductance)都明显下降,胞间CO2浓度(intercellular CO2 concentration, Ci)和净光合速率(net photosynthetic rate, Pn)随双基因的表达水平呈现不同的变化;双基因超表达株系的初始荧光(initial fluorescence, F0)、最大荧光(maximum fluorescence, Fm)和非光化学猝灭系数(non-photochemical quenching coefficient, NPQ)都明显升高,但光合系统Ⅱ (photosystem Ⅱ, PSⅡ)的最大光化学效率(maximum photochemical efficiency, Fv/Fm)不变。本研究建立的多基因转化方法和获得的双基因超表达株系为进一步研究丹参酮的调控提供了实验材料和方法,为SmCPS1和SmCYP76AH1在丹参地上部分的功能挖掘提供了参考。

• 金鱼草GAE基因家族鉴定及核盘菌抗性基因挖掘

  夏文念, 杨冬梅, 宋佳怡, 杨洁, 汪仲毅, 蔺海娣, 胡慧贞

  果胶是植物细胞壁的重要成分,在植物生长发育和细胞壁抗性中发挥重要作用,合成其骨架结构的单糖供体—UDP-半乳糖醛酸(UDP-α-D-galacturonic acid, UDP-GalA)由葡萄糖醛酸异构酶(UDP-D-glucuronate 4-epimerase, GAE)催化合成。为了探究金鱼草(Antirrhinum majus) GAE家族成员介导的细胞壁抗性,本研究在全基因组水平鉴定出了8个AmGAEs基因,对其理化性质、亚细胞定位、系统发育、保守基序、基因结构、染色体定位和顺式作用元件等进行生物信息学分析,发现AmGAE家族成员均为碱性亲水蛋白,定位于高尔基体,其基因启动子区域具有防御和胁迫、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、水杨酸(salicylic acid, SA)和脱落酸(abscisic acid, ABA)等响应元件。进一步对金鱼草抗、感核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)材料进行转录组测序(RNA-seq)分析和实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)验证,发现AmGAE1a、AmGAE3、AmGAE5和AmGAE2基因表达在抗性材料Am6 (R)中显著被诱导,而AmGAE7和AmGAE4基因表达则在感病材料Am1 (S)中显著被诱导,其中AmGAE1a、AmGAE3、AmGAE7和AmGAE4基因在qRT-PCR中的表达模式与RNA-seq的差异表达结果一致,确定为金鱼草抗核盘菌的候选基因。本研究为深入探讨AmGAE家族基因抗核盘菌的分子机制提供了理论基础和新的基因资源。

• 猪TBX3启动子克隆和功能分析

  程映皓, 吴筱洁, 沈巧艳, 华进联

  猪(Sus scrofa)是重要的家畜,诱导干细胞的研究可以促进其育种行业的发展,T-Box转录因子3 (T-box transcription factor 3, TBX3)对猪多能干细胞的干性具有重要的促进和维持作用。为了研究猪TBX3启动子的功能和调控机制,本研究通过序列比对和进化树构建对启动子区域保守性进行评估,并对启动子区域潜在的转录因子结合位点进行预测,对预测的转录因子进行GO和KEGG富集分析解释其参与的生物学过程,最终通过分子克隆和双荧光素酶报告系统验证启动子活性。结果显示,猪TBX3启动子预测区域在哺乳动物中共性程度较低,共性区域参与细胞增殖、分化、凋亡等过程;预测区域含有多种潜在的转录因子结合位点,其参与的信号通路包括干性维持和甲状腺激素信号通路;预测区域具有转录活性,其核心转录启动子处于-246/+64 bp的区域内。本研究通过探讨猪细胞中TBX3转录因子的上游调控机制,为深入理解猪TBX3的转录调控提供参考。

• 安徽白山羊SOCS3基因克隆、表达分析及其功能鉴定

  崔恒源, 马存霞, 崔双双, 郭玉柱, 刘洪瑜, 张运海, 宋宁

  细胞因子信号转导抑制因子3 (suppressor of cytokine signaling 3, SOCS3)是一种对信号传导作出应答的蛋白,具有调控乳蛋白合成的作用。αS1-酪蛋白是奶畜乳中最主要的过敏原之一,然而SOCS3对山羊(Capra hircus) αS1-酪蛋白合成的影响尚不清楚。为了阐明SOCS3在山羊乳腺中的基因序列、结构、表达情况以及SOCS3对αS1-酪蛋白表达的影响,本研究以安徽白山羊乳腺组织为实验材料,通过PCR克隆SOCS3基因编码区序列,利用在线软件对其进行生物信息学分析,检测SOCS3在不同泌乳时期的表达情况,干扰与过表达SOCS3进行功能分析。结果表明,本研究成功克隆得到山羊SOCS3基因完整编码区为690 bp,编码229个氨基酸;蛋白分子量为25.09 kD,理论等电点为8.97,存在34个磷酸化位点,无信号肽和跨膜螺旋结构,为携带正电荷的不稳定蛋白;SOCS3蛋白与SOCS2、Janus激酶(Janus kinase, JAK)、酪氨酸激酶2 (tyrosine kinase 2, TYK2)、胰岛素受体底物2 (insulin receptor substrate 2, IRS2)、瘦素受体(leptin receptor, LEPR)和白介素6 (interleukin 6, IL6)等蛋白存在互作关系;山羊SOCS3基因与绵羊(Ovis aries)亲缘关系最近,其次是牛(Bos taurus);SOCS3基因在泌乳初期和盛期表达量最高。在山羊乳腺上皮细胞中,干扰SOCS3基因显著上调αS1-酪蛋白的表达水平,过表达SOCS3基因显著下调αS1-酪蛋白的表达水平。以上结果表明,SOCS3在山羊αS1-酪蛋白合成中具有负向调控作用。本研究为开展SOCS3基因在山羊αS1-酪蛋白合成中的调控机制研究提供基础。

• 承德无角山羊KCNJ15基因核心启动子区鉴定

  张文浩, 刘爽, 韩聪, 洪支林, 谢遇春, 乔贤, 刘铮铸, 巩元芳

  角是山羊(Capra hircus)的重要表型性状,KCNJ15 (potassium inwardly rectifying channel subfamily J member 15)是影响山羊角生长的重要基因之一。本研究以承德无角山羊为实验动物,利用PCR技术扩增KCNJ15基因2 353 bp长度序列(起始密码子上游2064 bp~下游289 bp),通过在线软件预测核心启动子区、转录因子结合位点和调控元件;进一步构建不同缺失片段的启动子报告基因载体,瞬时转染293T细胞,使用双荧光素酶检测试剂盒检测各缺失片段的活性,确定KCNJ15基因的核心启动子区。结果显示,成功获得承德无角山羊KCNJ15基因(2353 bp)序列,软件预测-423~+289 bp可能为启动子活性区,同时预测到多个转录因子结合位点以及CAAT和TATA调控元件。双荧光素酶活性检测结果显示,在4个启动子缺失片段中,-491~+289 bp的相对活性值最高,提示该区域是核心启动子区,与软件预测结果基本一致。本研究为深入探究KCNJ15基因调控山羊角性状分子机制提供了基础资料。

• MDCK细胞成瘤性相关环状RNA的筛选与验证

  杨迪, 石嘉琛, 黄玲巍, 王家敏, 马玉梅, 乔自林, 崔燕

  在应用犬(Canis lupus familiaris)肾细胞系MDCK (Madin-Darby canine kidney)制备禽流感等兽用疫苗中发现,MDCK细胞系存在成瘤性。本研究以高成瘤性和无成瘤性的MDCK细胞为研究对象,通过RNA-seq高通量测序技术筛选获得差异表达的环状RNA (circular RNA, circRNA),并对差异表达circRNA的来源基因进行GO和KEGG分析;进一步使用数据库StarBase和mirTarBase分别预测成瘤性相关差异circRNA的靶标微小RNA (microRNA, miRNA)和mRNA,使用Cytoscape软件绘制circRNA-miRNA-mRNA共表达网络。利用TRIzol法提取高成瘤性和无成瘤性的MDCK细胞总RNA,利用qPCR验证6个差异circRNA的表达水平。结果显示,从高成瘤性和无成瘤性的MDCK细胞中鉴定出3 491个circRNA,长度为200~800 nt;共筛选出27个差异表达的circRNA,其中18个上调表达、9个下调表达。GO、KEGG和Reactome富集分析表明,差异表达的circRNA与ATP和氨基酸代谢相关酶的活性及结合等相关,主要富集的信号通路为黏附连接、细胞迁移以及多种代谢相关信号通路;内源竞争RNA (competing endogenous RNA, ceRNA)网络构建得到4组MDCK细胞成瘤性相关的关键circRNA-miRNA-mRNA调控网络,分别为novel_circ_002222/novel-m0145-3p/动力蛋白激活蛋白1 (dynactin 1, Dctn1)、novel_circ_002222/miR-197-x/Dctn1、novel_circ_001205/novel-m0580-5p/膜联蛋白A11 (annexin A11, ANXA11)和novel_circ_003257/novel-m0675-3p/RNA结合蛋白48 (RNA-binding protein 48, RBM48)。上述结果表明,MDCK细胞成瘤性相关的差异表达circRNA主要富集在跨膜物质运输和能量代谢相关通路,可能在MDCK细胞能量摄入和代谢过程中发挥作用。本研究为揭示circRNA参与MDCK细胞成瘤的机制、建立基因工程无成瘤性MDCK细胞系提供研究基础和技术支持。

• 饲料中添加褐藻寡糖、红藻寡糖对虹鳟生长性能、肌肉营养成分及血清免疫功能的影响

  汤伟, 王祺, 李佳欣, 张军, 吴春光, 何增国

  褐藻寡糖和红藻寡糖作为功能性海洋寡糖,具有多种生物学活性。为探究两者在水产养殖中的作用,本研究以虹鳟(Oncorhynchus mykiss)为实验对象,探究饲料中添加褐藻寡糖、红藻寡糖对虹鳟的生长性能、肌肉营养成分和血清免疫功能的影响。实验分为5组：对照组为基础饲料组,实验组在基础饲料中分别添加0.25%、0.5%的褐藻寡糖或红藻寡糖。试验周期37 d。结果表明,添加0.25%的褐藻寡糖对虹鳟的质量增加率和特定生长率作用显著(P<0.05)。在营养方面,两者均能显著提高虹鳟肌肉中粗脂肪含量、必需氨基酸和呈味氨基酸含量(P<0.05),且高剂量组要优于低剂量组;两者均能提高不饱和脂肪酸含量,且添加量为0.5%时极显著增加了鱼肉中二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)的含量(P<0.01)。在免疫方面,两者均能提高虹鳟血清中溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性及总抗氧化能力,高剂量组普遍优于低剂量组。本研究表明,饲料中添加褐藻寡糖或红藻寡糖对虹鳟具有一定的促生长作用,有助于鱼肉营养和风味品质的提升,并且能提高虹鳟的免疫力和抗病能力,在水产饲料添加方面具有潜在的应用价值。

• 红螯螯虾不同养殖群体和选育群体遗传多样性及遗传结构分析

  欧阳苗峰, 陈红林, 刘峰, 周焕, 楼宝, 钱豪杰, 钱伦

  红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)是一种世界性养殖的淡水经济虾类,目前在我国许多地区均有养殖。为了解我国红螯螯虾不同地区及人工选育群体遗传多样性和遗传结构,本研究分别利用15对和20对微卫星标记对10个不同地区红螯螯虾养殖群体和3个世代选育群体进行遗传多样性分析,结果显示,10个养殖群体的平均等位基因数(number of alleles, Na)为5.867~6.867,平均有效等位基因数(effective number of alleles, Ne)为3.090~3.857,香农指数(shannon's diversity index, H')均大于1,平均观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)和平均期望杂合度(expected heterozygosity, He)均大于0.5,平均多态信息含量(polymorphism information content, PIC)为0.531~0.595。此外,10个不同地区红螯螯虾养殖群体的基因流(number of migrants per generation, Nm)为11.343~32.526,遗传分化指数(genetic differentiation coefficient, Fst)为0.008~0.027,遗传距离(genetic distance, D)为0.024~0.090,遗传相似系数(genetic similarity index, I)为0.914~0.977。基于D构建的聚类图显示,潮汕与南通、珠海、台湾和平湖群体聚为一个分支,无锡与淮安、海南、诸暨群体聚为一个分支,而汕尾群体单独聚为一个分支。分析3个世代的选育群体发现,其遗传多样性参数发生明显下降,其中,Ho从0.663下降到0.638,H'从1.449下降到1.372,Na从3.509下降到3.303,PIC从0.640下降到0.635,说明通过人工选育导致群体上述各项指标均有所降低。同时,随着选育世代数增加,I从0.961逐渐降低到0.931、D从0.044逐渐升高至0.07,而相邻世代间的I从0.957升高至0.960、Nm从26.262升高至29.895,Fst在渐次变小,其中,选育1代与选育2代间Fst值为0.009,而选育2代与选育3代群体间Fst值降为0.008,进一步说明累代人工选育导致世代间遗传相似性降低,遗传距离增加,世代间的遗传分化逐渐增大。以上研究结果表明,我国不同地区红螯螯虾群体无明显遗传分化,各地区红螯螯虾遗传多样性水平都较高,都可作为良种选育的基础群体;红螯螯虾选育群体经过3代选育后,遗传多样性水平有所降低,但仍处于较高水平,遗传变异与遗传分化水平较低,仍旧具有较强的选育潜力。本研究为红螯螯虾良种选育提供重要的理论依据。

• 辣椒根际促生菌的筛选及促生效应分析

  张琳, 余红凤, 毕钰, 王志刚, 徐伟慧, 刘桂琳

  过度施用化肥农药以及土壤连作问题严重制约了辣椒的生产,因此改良土壤环境,对提高辣椒(Capsicum annuum)产量十分重要。为了筛选辣椒根际促生菌并研究其促生效应,本研究以齐齐哈尔市辣椒根际土壤为材料,使用功能性培养基分离筛选辣椒根际中的促生菌,通过16S rDNA序列对菌株进行鉴定,采用种子萌发试验以及盆栽试验验证促生能力强的菌株的促生效果。结果表明,共分离出51株辣椒根际促生菌,分属于12个菌属。51株促生菌中有8株菌具有解磷能力,35株菌能产赤霉素,33株菌能产生长素(auxin, IAA),所有菌株均具有溶磷、解钾和固氮的能力。其中特基拉芽胞杆菌(Bacillus tequilensis) K10能够显著促进辣椒种子萌发,并增加辣椒幼根根毛的数量。暹罗芽胞杆菌(B. siamensis) G19-1和约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii) N9-2能够显著增加辣椒植株的地上部鲜重、根鲜重、地上部干重、根干重以及株高(P<0.05),且菌株的溶磷、解钾、固氮、产赤霉素和IAA能力与辣椒植株地上鲜重、地上干重以及根干重之间呈显著正相关(P<0.05)。综上,本研究共筛选得到的3株促生菌K10、G19-1和N9-2可作为辣椒微生物肥料的候选菌株,为辣椒微生物制剂的开发提供菌种资源与技术支持。

• 自噬相关基因PlATG12对荔枝霜疫霉生长发育和致病性的影响

  陈泰旭, 杨成东, 于戈, 罗曼菲, 张雪, 吕林, 陈庆河

  细胞自噬在植物抵御病原菌侵染过程中发挥重要作用,其中自噬相关蛋白12 (autophagy-related protein 12, ATG12)主要参与自噬体双层膜的形成和延伸,然而其在植物病原菌特别是卵菌中的作用鲜有报道。为明确自噬相关基因PlATG12 (GenBank No. OR909654)在荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)生长发育和致病过程中的作用,本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑和PEG介导的原生质体转化技术,获得了荔枝霜疫霉自噬相关基因PlATG12敲除突变体,并进行原位回补。表型测定结果显示,与野生型(SHS3)相比,突变体ΔPlatg12-77和ΔPlatg12-315的菌落生长速率分别下降了6.50%和7.49%,孢子囊数量分别降低了33.86%和34.02%。同时,在低温12 ℃处理0.5和2 h后,突变体的游动孢子释放率也受到显著抑制。此外,突变体卵孢子产量分别仅为野生型的20.25%和22.00%,且Ⅲ型和Ⅳ型卵孢子产量显著增加。致病性测定发现PlATG12敲除突变体在荔枝(Litchi chinensis)叶片上的致病力低于野生型。PlATG12原位回补后突变体的表型恢复到野生型水平。研究结果表明,自噬相关基因PlATG12参与荔枝霜疫霉的生长发育和致病性。本研究为进一步解析细胞自噬途径对卵菌致病过程的调控提供理论依据。

• TRAF2和SNED1基因敲低对牛病毒性腹泻病毒复制的影响

  刘芯怡, 权冉, 刘昱成, 陈俊贞, 倪慧莹, 付强, 史慧君

  牛病毒性腹泻/粘膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease, BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起的接触性传染病,会导致持续性感染,感染犊牛(Bos taurus)会不断向外界排出病毒。本课题组前期使用RNA-蛋白质相互作用检测(RNA-protein interaction detection, RaPID)技术,筛选出了与BVDV互作的肿瘤坏死因子受体相关因子2 (tumor necrosis factor receptor associated factor 2, TRAF2)和Sushi、Nidogen和EGF样结构域1 (Sushi, Nidogen and EGF like domains 1, SNED1)基因。为了确定TRAF2和SNED1基因对BVDV复制的影响,本研究利用小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)技术敲低牛肾细胞(madin-darby bovine kidney cells, MDBK)中TRAF2和SNED1基因,通过qPCR检测TRAF2和SNED1基因的敲低效率和BVDV感染TRAF2和SNED1敲低细胞的BVDV 5'UTR RNA水平变化;使用免疫荧光染色法检测BVDV复制的中间产物双链RNA (double stranded RNA, dsRNA)的积累变化;通过荧光倒置显微镜观察致细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),使用Karber法计算子代病毒滴度变化。结果表明,TRAF2和SNED1的mRNA水平显著性降低(P<0.05),表明成功构建了TRAF2以及SNED1敲低细胞(TRAF2 KD和SNED1 KD);BVDV感染对照组(NC) 36 h开始出现明显的空斑、脱落、死亡等CPE现象,TRAF2 KD细胞和SNED1 KD细胞的CPE现象减弱;与对照组(NC)相比,在BVDV感染TRAF2 KD和SNED1 KD细胞后,BVDV 5'UTR RNA水平在24、36和48 h显著下降(P<0.05);通过免疫荧光染色检测BVDV复制的中间产物dsRNA形成和累积,在TRAF2 KD和SNED1 KD细胞中36和48 h绿色荧光强度明显降低;BVDV感染TRAF2 KD和SNED1 KD细胞后48 h子代病毒滴度极显著降低(P<0.01)。以上结果表明,敲低TRAF2和SNED1会抑制BVDV复制,本研究为揭示BVDV致病机制提供重要依据。

• 植物耐铜的分子机制和微生物学机制

  张晶, 王剑峰, 龚记熠, 王丽, 陈显磊, 陈兰兰, 李娜, 刘杰, 乙引

  当前,土壤重金属污染已成为全球性的重大环境问题。铜(Cu)是植物必需的微量元素,但高浓度的铜对植物具有毒害作用。为了适应铜胁迫环境,植物发展了多种耐铜的分子机制和微生物学机制。本文介绍了超积累植物在铜污染土壤中的作用,系统总结了植物应答铜胁迫的形态、生理分子和根际微生物生态学机制,包括以下内容：植物对铜的生理防御和吸收转运机制;植物根际促生细菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)通过促进植物营养吸收和分泌生长调节物质来增强植物对铜胁迫的耐受性;PGPR通过诱导系统抗性和吸附积累铜离子以降低铜对植物的损伤;根际微生物群落结构和功能介导的植物应答铜胁迫的机制;植物响应不同铜胁迫的根际微生物群落结构的变化。本文为今后培育耐铜植物新种质和治理修复铜污染的土壤提供科技支撑。

• 山羊睾丸类器官的培养与鉴定

  徐文静, 吴文萍, 杨玉梅, 李娜, 华进联

  类器官是一种在结构和功能上与机体原器官相似的组织替代品。目前一些类器官培养体系已经比较完善,但睾丸类器官培养尚处于探索阶段。本研究无菌采取莎能奶山羊(Capra hircus)睾丸组织,用混合酶消化法分离培养睾丸细胞。用含低熔点琼脂糖的混合培养基在三维环境中培养睾丸细胞。采用光学显微镜和免疫荧光检测技术对形成的类器官进行记录和评价,比较不同来源的睾丸细胞、不同数量的睾丸细胞和不同浓度的低熔点琼脂糖对睾丸类器官的培养效果。进一步通过脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)感染验证睾丸类器官的模型功能。结果表明1%低熔点琼脂糖、含量为2×105 ~ 3×105的细胞更有利于山羊睾丸类器官的形成。形成的类器官具有生精小管样结构,并且精原干细胞和支持细胞均匀分布其中。LPS感染的睾丸类器官较正常的类器官小,并有细胞碎片,同时伴有炎性因子的显著增加,表明该类器官能够响应外界刺激,一定程度上模拟真实器官的免疫反应,可作为体外研究睾丸疾病的模型。本研究不仅推动了睾丸类器官培养技术的发展,而且为生殖生物学、疾病模型建立、药物筛选、再生医学以及个性化医疗等多个领域提供了重要的科学依据和实验平台。

• 变形假单胞菌免疫刺激复合物对大黄鱼口服免疫效果的评价

  许斌福, 陈秀霞, 池洪树, 李素一, 郑在予, 徐梦婷, 江秋欢, 郑炜强, 林能锋

  变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的主要病原,可导致巨大经济损失。前期研究表明免疫刺激复合物(immune stimulating complexes, ISCOMs)具有较好的口服免疫效果。为了评价口服变形假单胞菌ISCOMs免疫大黄鱼的效果,本研究制备具有笼格状纳米颗粒结构的变形假单胞菌ISCOMs疫苗(Pp-ISCOMs),检测口服免疫后21 d大黄鱼头肾的各免疫因子的基因表达水平,通过菌体血清凝集方法测定免疫后大黄鱼血清效价,并测定其免疫保护力。结果显示,与灭活变形假单胞菌(Pp)和空白对照(CK)相比,口服免疫Pp-ISCOMs的大黄鱼头肾的髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor 88, MyD88)(P<0.05)和白介素2 (interleukin 2, IL-2)(P<0.001)等免疫相关因子表达显著提高;受免21 d的大黄鱼血清凝集效价为22;用5.0×102 CFU/g剂量的变形假单胞菌腹腔注射攻毒后,Pp-ISCOMs和Pp受免鱼的相对免疫保护率分别为73.3%和40%。研究表明变形假单胞菌ISCOMs口服免疫可提高大黄鱼抗变形假单胞菌感染能力,具有良好的应用前景。本研究为大黄鱼内脏白点病的免疫防控提供了技术支撑。

• 基于Eu3+荧光微球的丁香酚时间分辨荧光免疫层析技术的建立

  宋妍灵, 翟璐, 李因来, 陈青舟, 廖杰, 金仁耀

  丁香酚具有来源广、成本低、效果好且残留期短等优点,被广泛应用于渔业麻醉,但国际上对于其安全性存在争议,认为丁香酚类化合物对啮齿动物是致癌物或潜在的致癌物。为提供一种高效、简便适用于现场快速检测水产品中丁香酚残留的方法,本研究建立了丁香酚时间分辨荧光免疫层析技术并制备免疫层析试纸条,利用Eu3+标记的荧光微球和抗丁香酚单克隆抗体进行标记,先后对微球活化时间、荧光标记缓冲液pH值、标记抗体量、荧光微球用量及T线和C线包被浓度等参数进行优化,并在最优条件下制备免疫层析试纸条并对其性能进行评价。结果表明,在最优条件下制成的试纸条在0.05~0.40 μg/mL之间丁香酚标样浓度的对数值与T/C值具有良好的线性关系,标准曲线方程：y=-2.415lnx+2.589 4,R2=0.994,仪器检出限为0.1 μg/mL,表明试纸条具有良好的灵敏度。样品添加回收率试验表明,回收率在94.16%~109.27%范围内,批内和批间变异系数分别为2.00%~7.33%和2.73%~6.97%。利用新研发试纸条对丁香酚标样检测与传统的高效液相色谱检测方法相比结果一致。稳定性试验证明,本研究制备的试纸条的有效保质期至少为1年。本研究所建立的方法适用于水产品中丁香酚残留的快速检测,同时为开发丁香酚快速检测技术提供依据。