农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2025年第1期

• 桂花OfLCYB提高转基因烟草类胡萝卜素含量和低温胁迫的抗性

  彭琳, 王艺光, 董彬, 钟诗蔚, 方遒, 肖政, 邓金萍, 赵宏波

  番茄红素β-环化酶(lycopene β-cyclase, LCYB)是类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶。桂花(Osmanthus fragrans)主要分布于我国南方。在深秋和冬季开放的桂花遇低温天气会出现颜色加深的现象。本研究通过相对低温处理桂花,发现桂花花瓣颜色变深、类胡萝卜素含量显著增加、关键合成基因OfLCYB上调表达。为研究OfLCYB对类胡萝卜积累和低温胁迫的响应机制,本研究从桂花花瓣中克隆了OfLCYB基因(GenBank No. PP438593),并构建过表达载体转化烟草(Nicotiana tabacum)。结果显示,过表达OfLCYB可以促进转基因烟草叶片中类胡萝卜素的积累和参与类胡萝卜素生物合成途径中相关基因的表达。低温(4 ℃)处理烟草之后,与对照植株相比,OfLCYB过表达的烟草叶片表现出更好的低温耐受性。在低温处理下,转基因株系叶片中相对电解质泄露率(relative electrolyte leakage, REL)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量显著低于对照植株,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、过氧化物酶(peroxidase, POD)活性、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性和脯氨酸含量显著提高。此外,与对照植株相比,转基因烟草叶片中的2个冷应答转录因子NtDREB1 (dehydration responsive element binding 1)和NtDREB3及2个冷诱导基因NtERD10A (early responsive to dehydration 10A)和NtERD10B的表达水平上调。推测OfLCYB可能通过促进类胡萝卜素合成提高植物的低温耐受性。本研究可为提高桂花耐寒性和扩大栽培范围提供参考。

• 甘蓝型油菜腺苷5'-磷酰硫酸还原酶(APR)基因家族的鉴定及其非生物胁迫下的响应

  张小雪, 冀功海, 穆雨, 姜伟高, 刘清云, 王新发, 顿小玲, 任丽军

  腺苷5'-磷酰硫酸还原酶(adenosine 5'-phosphosulfate reductase, APR)是植物硫酸盐同化途径中的关键酶,对硫酸盐代谢和硫循环至关重要。该蛋白包含2个保守结构域：PAPS_reductase和Thioredoxin,主要在质体中执行催化功能,对植物的生长发育和逆境应答有重要影响。为系统研究甘蓝型油菜(Brassica napus)中APR家族基因的结构与功能特征,本研究以拟南芥APR蛋白序列为模板,对甘蓝型油菜'中双11号'全基因组进行同源比对,共鉴定到10个APR家族基因,分布于9条染色体。进一步对该基因家族进行鉴定和分析,并初步探讨了甘蓝型油菜APR基因在非生物胁迫下的表达模式。结果显示,甘蓝型油菜APR蛋白的氨基酸序列长度为219~468 aa,相对分子质量范围为24.29~51.69 kD,等电点跨度为5.43~8.84;系统发育分析显示,甘蓝型油菜APR基因被分为3个亚族,各亚族成员具有相似的外显子-内含子结构;且APR蛋白均含有PAPS_reductase和Thioredoxin保守结构域;共线性分析表明,片段复制是甘蓝型油菜APR基因家族扩张的主要机制;表达模式分析显示,APR基因在不同发育时期的组织器官中具有时空表达特异性,在油菜的子叶、营养莲座叶和角果皮中表达量较高;对甘蓝型油菜APR家族的启动子顺式作用元件和非生物胁迫条件下的表达模式进行分析,结果表明,甘蓝型油菜APR家族成员启动子区域富集了与激素响应和逆境适应相关的顺式作用元件,且该家族基因表达受重金属镉、铅和缺硫胁迫所诱导。上述结果表明,甘蓝型油菜APR基因在响应重金属镉、铅胁迫中发挥着重要的作用,这为进一步深入解析甘蓝型油菜APR家族基因的分子功能提供了参考。

• 火龙果连作土壤细菌多样性与酶活性对酚酸类代谢产物的响应特征

  谢勇俊, 秦文连, 周婧, 王孟佳, 潘小卓, 秦孝杰, 唐景美, 王一兵

  随着火龙果(Hylocereus undatus)种植年限的增加,酚酸类代谢产物会逐渐在土壤中积累,引起土壤病原细菌、真菌及线虫等定殖,最终导致连作障碍的发生。本研究采用纯培养技术,从连作6年和3年的火龙果根际土壤中分离出可培养细菌,并通过16S rRNA基因序列进行种属鉴定。同时,采用土壤酶活性测定法研究不同种植年限火龙果土壤的酶活变化,利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定土壤中酚酸类代谢产物的种类及含量,分析土壤细菌与酶活性对酚酸类代谢产物的响应关系。结果显示,连作使火龙果中的细菌群落多样性增加,从火龙果的根际土壤中分离出4门、5纲、10目、16科、21属、56种共112株细菌,其中假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)和芽胞杆菌属(Bacillus)等生防菌的相对丰度下降了23.36%。火龙果的连作种植导致土壤中过氧化氢酶和纤维素酶活性下降,脲酶和蔗糖酶活性上升。连作导致没食子酸、阿魏酸、水杨酸和苯甲酸的含量分别增加了163.80%、194.92%、341.57%和175.93%。响应关系分析显示,酚酸与微生物群落结构之间具有一定的关联性。上述结果表明,连作种植导致没食子酸、阿魏酸、水杨酸和苯甲酸等酚酸物质积累,引起了土壤微生物群落结构的失衡,有益微生物减少,土壤酶活力发生改变,植物营养物质的吸收受到影响,最终导致连作障碍的产生。本研究为后续开发具有降解酚酸功能的微生物菌剂及火龙果的田间管理技术提供基础数据。

• 毛竹PheTCP19b基因可变剪接体对芽发育的影响

  郝琴, 申孜, 闫小玲, 周敏舒, 郭小勤

  可变剪接(alternative splicing, AS)是一种转录后的修饰过程,在生物体各种生理过程中发挥重要作用。TCP是一种植物特有的转录因子,参与植物多种生长发育调控过程。为深入探究毛竹(Phyllostachys edulis) TCP19b基因可变剪接体的表达特性及生物学功能,本研究采用RT-PCR技术克隆了毛竹TCP19b基因全长CDS,采用qRT-PCR技术和GUS组织染色分析了可变剪接体的表达量及表达部位,通过亚细胞定位及遗传转化分析了可变剪接体编码蛋白的定位及生物学功能。结果显示,毛竹PheTCP19b基因发生了可变剪接,产生了2种可变剪接体PheTCP19bα和PheTCP19bβ,分别编码346和382个氨基酸,2种可变剪接体都包含保守的bHLH结构域。PheTCP19b与水稻(Oryza sativa) OsTCP19亲缘关系最近。2个可变剪接体的组织特异性表达模式存在一定差异,PheTCP19bα的组织特异性强,而PheTCP19bβ表现出组成型表达特性,油菜素内酯(brassinolide, BR)可诱导2个可变剪接体的表达。2个可变剪接体蛋白均富集在细胞核。PheTCP19bα和PheTCP19bβ均可以将拟南芥(Arabidopsis thaliana) brc1突变体多分枝表型回补到野生型表型。本研究为进一步探讨PheTCP19b基因不同剪接体在芽发育过程中的分子机制提供了基础资料。

• 毛竹PeACO基因家族鉴定及箨鞘剥除后的表达分析

  李其旻, 兰智鑫, 朱唯玮, 李翔宇, 吴蔼民, 林新春

  1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase, ACO)是乙烯合成过程中的关键限速酶之一。本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)为材料,对PeACO基因家族进行全基因组鉴定及表达分析,以探究PeACOs在毛竹茎秆木质化进程中的影响。本研究通过与水稻(Oryza sativa) ACO基因序列比对,在毛竹基因组中鉴定得到11条具有完整2OG-FeII_Oxy结构域的PeACOs序列;理化分析显示,PeACOs基因编码304~445个氨基酸,蛋白分子量为34 105.83~49 417.78 D;进化关系和基因结构分析显示,同一分支的基因对在基因结构和蛋白水平上保持高度的保守性;共线性分析得出ACO基因家族在毛竹中共有6对共线性基因,说明基因组复制事件对PeACOs基因数目扩张有重要影响。基因表达分析显示,PeACOs在毛竹各组织均有表达,尤其在快速生长期的笋中表达丰度最高;剥除处于快速生长期的毛竹箨鞘导致毛竹茎秆木质化程度加深,大部分PeACOs基因的表达量显著上调,且具有相似结构的基因对表达趋势相似,提示PeACO基因家族可能在木质化进程中发挥重要作用。本研究为深入探讨毛竹ACO基因家族功能提供了参考依据。

• 基于SSR标记的澜沧江流域大理茶群体遗传多样性研究

  黄利超, 陈洪宇, 罗义菊, 陶燕蓝, 蓝增全

  大理茶(Camellia taliensis)是茶的重要野生近缘种,是茶资源的重要组成部分,研究大理茶群体的遗传多样性和亲缘关系,对科学保护和合理利用大理茶种质资源至关重要。本研究应用SSR标记技术对澜沧江流域5个州市共45份大理茶种和5份普洱茶(C. sinensis var. assamica)种的种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析。结果显示,15对有效引物共检测到55个多态性位点,每对引物平均扩增3.67个位点;大理茶资源的平均期望杂合度(epected heterozygosity, He)为0.346;多态信息含量(polymorphism information content, PIC)变化范围是0.024~0.661,平均值为0.381;香农指数变化范围是0.067~1.321,平均值为 0.669;多态性引物比例为60.0%,多态性引物占有效引物的比例为75.0%。聚类分析结果显示,澜沧江流域大理茶树种质分类与地理区域具有相关性,地理位置较远的大理茶树居群间的遗传距离较远,但居群内遗传距离较近。以上结果表明,澜沧江流域大理茶资源具有中等遗传多样性和中等丰富度。本研究为大理茶种质资源的保护开发及遗传图谱构建提供参考。

• 小粒咖啡CaFAB2基因家族的鉴定及其在种子脂肪酸合成中的潜在作用

  张振伟, 董相书, 杨婧, 杞美军, 王步天, 施学东, 黄文龙, 李学俊, 葛宇

  小粒咖啡豆的品质是选育优质小粒咖啡(Coffea arabica)新品种的首要目标,其中,咖啡豆香气是评价小粒咖啡豆品质优劣的关键要素,而脂肪酸是形成小粒咖啡豆挥发性香气成分的前体之一。硬脂酰基-ACP去饱和酶(stearoyl-ACP desaturase, FAB)是植物不饱和脂肪酸合成的关键酶,植物体内脂肪酸各组分的比例及不饱和度与FAB的去饱和作用息息相关。本研究通过BLASTP比对,在小粒咖啡基因组中鉴定出4个CaFAB2基因家族成员。进一步分析表明,这4个CaFAB2基因的蛋白质氨基酸数目为381~415 aa;分子量为43 936.6~47 693.4 D;等电点均大于7;不稳定系数为29.55~42.67,脂肪系数均小于100,比较亲水;总平均亲水系数均为负值,为亲水蛋白;CaFAB2家族蛋白成员均定位于叶绿体上。在进行基因家族分析时发现,小粒咖啡的CaFAB2基因家族成员与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtFAB2基因家族的保守基序完全相同且分布的排列位置高度相似,结构域均为PLN00179。小粒咖啡的CaFAB2基因与香樱桃咖啡(C. eugenoedes)和中粒咖啡(C. canephora)之间出现子代2个基因对应亲本1个基因的现象。此外,对小粒咖啡种子4个发育阶段脂肪酸含量测定发现,其所含脂肪酸主要以亚油酸、棕榈酸、油酸以及硬脂酸为主,并且在其发育阶段中变化趋势一致,含量先减少后逐渐升高。对小粒咖啡种子4个发育阶段的转录组测序及实时荧光定量PCR分析结果表明,CaFAB2.3基因与油酸合成具有正相关性,CaFAB2.1基因和CaFAB2.3基因主要参与前期棕榈油酸的合成。本研究结果为深入研究小粒咖啡种子的脂肪酸变化趋势及脂肪酸生物合成提供理论依据,对小粒咖啡CaFAB2基因的鉴定以及调控机理提供新的见解。

• 利用mtDNA信息分析陶寺古牛的起源驯化

  张兴, 杨柳, 侯凌云, 凌飞, 向海, 赵兴波

  作为最重要的家畜之一,普通牛(Bos taurus)在中国的起源和传播模式受到广泛关注。本研究收集了来自黄河中游3个考古遗址的9个古代牛遗骸,提取古DNA进行PCR测序和系统发生分析,以探索中国家养牛的起源和传播。经2轮PCR实验获得4个陶寺(距今4100年前)古牛527 bp的线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)序列。单倍型划分结果显示,陶寺古牛存在4种单倍型,都属于家养普通牛T3和T4单倍群,证实中国普通牛起源于近东地区,4 100年前就已经被华北人群利用。此外,陶寺遗址丰富的单倍型数量提示陶寺遗址古代牛群体具有较高的母系遗传多样性。群体间遗传分化指数FST (F-statistics)分析和Median-Joining网络图表明,中国古代牛与现代东亚(FST=0.0164)及中国普通牛(FST=0.0066)均有密切的遗传关系,提示陶寺遗址古代牛群体可能是现代东亚和中国普通牛的重要母系祖先群体之一。本研究为解析我国的家牛起源和传播提供了分子遗传证据。

• PHD2和Ang-1在不同年龄牦牛肺脏的表达分析

  卢凯, 崔燕, 魏鹏强, 翟国亮, 祁正满, 卢增华, 赵鹏飞, 何俊峰

  脯氨酸羟化酶2 (prolyl hydroxylase domain2, PHD2)和血管生成素1 (angiogenin 1, Ang-1)在动物适应低氧以及血管生成等方面起着重要作用,为研究PHD2和Ang-1在不同年龄牦牛(Bos mutus)肺脏中的表达分布,探讨其在牦牛肺脏低氧适应性结构形成中的作用。本研究以3日龄、6月龄、3岁和6岁牦牛为研究对象,选取成年黄牛(Bos taurus)为常氧对照,利用免疫组织化学染色(immunohistochemistry, IHC)、组织免疫荧光染色(immunofluorescence, IF)、qRT-PCR、Western blot对PHD2和Ang-1在不同年龄牦牛及黄牛肺脏组织中的表达进行研究。IHC和IF结果显示,PHD2和Ang-1在牦牛和黄牛的表达部位基本相同,主要分布于气管上皮细胞、气管腺、肺动脉内皮细胞和肺泡上皮细胞。qRT-PCR结果显示,PHD2的相对表达量在牦牛组显著高于黄牛组,在3日龄牦牛组显著高于其他年龄组(P<0.01)。Ang-1相对表达量在牦牛组显著高于黄牛组,在6岁牦牛组显著高于其他年龄组(P<0.01)。Western blot结果显示,PHD2蛋白在牦牛组的相对表达量显著高于黄牛组,随着牦牛年龄的增长,PHD2蛋白的相对表达量逐渐降低。Ang-1蛋白在牦牛组的相对表达量显著高于黄牛组,且随着牦牛年龄的增长,Ang-1蛋白的相对表达量逐渐升高。综上所述,PHD2和Ang-1在牦牛肺脏适应高原低氧环境中发挥重要作用,两者主要作用于肺脏上皮细胞和血管内皮细胞,从而维持低氧条件下牦牛肺脏的正常呼吸和肺血管功能的稳定。本研究为进一步探究高原环境下牦牛肺脏低氧适应性机制的研究提供一定的基础资料。

• 血能铁制剂对哺乳母猪生产性能及生理生化指标的影响

  胡国明, 黄昌巧, 周淑棉, 韦玉衡, 谢小东, 胡庭俊, 胡永浩

  铁作为一种关键的微量元素,对动物的生长具有重大的意义,铁缺乏将会导致发育障碍、繁殖性能不佳、贫血和腹泻等多种不良影响。本研究以产前7 d 至产后21 d 的哺乳母猪(Sus scrofa domestica)为对象,探讨饲料中添加血能铁制剂对哺乳母猪生产性能、生理生化指标及仔猪相关指标的影响。结果显示,与空白对照组相比,以1 kg/t饲料添加剂量添加血能铁制剂后,连续饲喂28 d能够显著降低母猪助产率、提高断配率,改善母猪产程,增加仔猪初生窝重、仔猪平均体重、断奶窝重,降低仔猪腹泻率、畸形率、死胎率,从而提高母猪生产性能和仔猪生长性能;同时血能铁制剂可以提高第7天哺乳仔猪血清铁和总铁结合力,起到预防仔猪贫血的作用。本研究为兽医临床应用血能铁制剂提高母猪生产性能提供参考和依据。

• 奶山羊ACSL6基因启动子克隆与转录活性分析

  熊畑畑, 吴钰, 邵钺馨, 陈冲, 王琬婷, 程菲, 李聪

  酰基辅酶A合成酶长链家族成员6 (acyl-CoA synthetase long chain family member 6, ACSL6)作为摄取、转运游离脂肪酸的关键酶,参与调控奶畜泌乳中脂肪酸的代谢过程。本研究旨在通过对奶山羊(Capra hircus) ACSL6基因(Gene ID: XM_018050725.1)启动子克隆、生物信息学分析和双荧光素酶活性检测,初步探究ACSL6基因的转录调控机制。以西农萨能奶山羊血液基因组DNA为模板,经PCR扩增获得ACSL6启动子的全长序列;利用生物信息学软件筛选预测分值较高的结合位点和启动子特征序列;克隆并构建启动子缺失片段载体,与内参载体共同转染奶山羊乳腺上皮细胞,通过双荧光素酶活性检测确定启动子活性区域。结果表明,克隆获得ACSL6基因启动子全长序列2 108 bp;ACSL6启动子上存在多种转录因子的结合位点;在启动子序列-907~-807 bp和-513~-54 bp存在2个长度分别为101和460 bp的CpG岛;对克隆获得的9个缺失片段进行双荧光素酶活性分析,发现ACSL6基因启动子的核心区域定位于-170~-33 bp,在转录起始位点上游-2 004~-1 707 bp、-1 334~-957 bp和-584 ~-271 bp可能存在负调控元件。本研究为揭示ACSL6调控奶山羊乳脂代谢的分子机理提供基础资料,为从分子层面改善羊乳品质提供参考。

• 菌酶复合制剂对湖羊生长性能、血清指标和粪便微生物的影响

  祁帅, 仓振, 牛伟强, 李鹏, 张积鑫, 茆达干

  肉羊(Ovis aries)高度集约化养殖易导致氧化应激,机体抵抗力下降,胃肠菌群紊乱,影响生长性能。饲粮中添加菌酶复合制剂可改善肠道菌群结构,提高营养物质消化率和动物生长性能。为了探究菌酶复合制剂对湖羊生长性能、血清指标和粪便微生物的影响,将48只2月龄的健康湖羊公羔((18.00±2.00) kg)随机分为4组,对照组饲喂基础日粮,实验组1、2、3分别添加0.1%、0.2%、0.3%菌酶复合制剂,预饲期7 d,正式期60 d。结果表明,与对照组相比,在31~60 d和1~60 d实验1和2组平均日增重(average daily gain, ADG)显著提高(P<0.05),实验各组料重比(feed to gain ratio, F/G)均显著下降(P<0.05);实验各组的血清白蛋白(albumin, ALB)和葡萄糖(glucose, GLU)含量均显著升高(P<0.05),实验1组的高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)含量显著升高(P<0.05);实验各组的超氧化物歧化酶(superoxidized dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性均显著升高(P<0.05);实验各组的免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig) IgA和IgG含量显著升高(P<0.05),实验3组IgM含量显著升高(P<0.05);实验2组的中性洗涤纤维(neutral detergent fibre, NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fibre, ADF)表观消化率显著升高(P<0.05);在门水平上,疣微菌门(Verrucomicrobiota)丰度显著提高(P<0.05),蓝藻菌门(Cyanobacteria)和弯曲杆菌门(Campylobacterota)丰度显著降低(P<0.05);在属水平上,另枝菌属(Alistipes)和普雷沃氏菌科UCG-001 (Prevotellaceae_UCG-001)丰度显著提高(P<0.05),念珠菌_糖单胞菌属(Candidatus_Saccharimonas)丰度显著降低(P<0.05)。综上,菌酶复合制剂可提高湖羊生长性能、抗氧化和免疫能力,提高养分表观消化率,促进肠道有益菌的定植,抑制有害菌的定植,以0.2%添加量为最佳。本研究为菌酶复合制剂在湖羊生产中的应用提供科学依据。

• 敌草快对鸡输卵管膨大部组织结构、细胞凋亡及繁殖性能相关基因表达的影响

  戴逸园, 丁香, 胡威, 刘犇, 肖佩怡, 杨雪, 郑文亚, 樊庆灿

  联吡啶类除草剂敌草快(Diquat)作为现代农业生产中常用的农药,极易引起禽类发生氧化应激,为探究敌草快诱导的氧化应激对鸡输卵管膨大部的影响,本研究选取45只健康且体重相近的180日龄康乐黄母鸡(Gallus gallus),随机分成3组,每组15只。各组鸡均饲喂基础饲粮且自由饮水,经1周适应性饲养后,实验组分别一次性腹腔注射10和20 mg/kg BW (body weight, 体重)的敌草快,对照组腹腔注射等剂量的生理盐水,21 d后采集输卵管膨大部组织,利用抗氧化功能检测试剂盒检测抗氧化指标,利用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色技术观察病理损伤,利用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)技术检测相关蛋白的分布,利用qPCR和Western blot技术检测细胞凋亡和繁殖性能相关基因及蛋白的表达。结果显示,敌草快组的输卵管膨大部中过氧化氢酶(catalase, CAT)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)活性显著降低(P<0.05),丙二醛(malondialdehyde, MDA)浓度显著升高(P<0.05)。HE染色结果显示,敌草快组的输卵管膨大部管径减小,固有层细胞分布稀疏,黏膜上皮游离面纤毛受损,敌草快20 mg/kg组的黏膜上皮细胞出现空泡化。IHC结果显示,敌草快组的输卵管膨大部黏膜上皮和固有层中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的染色强度降低,无翅型鼠乳腺癌病毒整合位点4 (Wingless-related murine mammary tumor virus integration site 4, Wnt4)在黏膜上皮游离面的染色强度也降低。qPCR结果显示,敌草快20 mg/kg组的输卵管膨大部中抗凋亡相关基因B-细胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)表达水平显著下调(P<0.05),敌草快组促凋亡相关基因Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)和半胱氨酸蛋白酶3 (Caspase3)的基因表达水平及Bax/Bcl-2均显著上调(P<0.05);繁殖性能相关基因透明带精子结合蛋白2 (zona pellucida sperm-binding protein 2, ZP2)和Wnt4的基因表达水平显著下调(P<0.05)。Western blot结果显示,Bcl-2、Bax、Caspase3、ZP2和Wnt4的蛋白表达水平与基因表达的变化趋势基本一致。上述研究结果表明,敌草快能够诱导鸡输卵管膨大部发生氧化应激和细胞凋亡,进而损伤膨大部组织结构及抑制繁殖性能相关基因的表达。本研究为缓解联吡啶类农药对禽类输卵管的损伤及保护繁殖性能提供理论参考。

• MiR-1306-5p对鸡前脂肪细胞增殖与分化的影响

  孙楠桢, 张蕾, 陈若楠, 张若彤, 孙杰

  miR-1306-5p对肿瘤细胞的增殖具有促进作用,对脂肪细胞增殖与分化的影响尚不明确。课题组前期采集玫瑰冠鸡(Gallus gallus)和科宝鸡胚胎期第8天胸肌组织进行高通量测序,本研究选择测序数据中筛选出的差异表达的miR-1306-5p,旨在探究miR-1306-5p在鸡前脂肪细胞增殖与分化过程中的功能。利用Targetscan和miRanda软件预测miR-1306-5p的靶基因,以脂肪代谢相关基因—骨形态发生蛋白2 (bone morphogenetic protein 2, BMP2)为靶基因构建野生型和突变型载体,与miR-1306-5p模拟物共转染鸡成纤维细胞,利用荧光素酶报告基因检测系统验证二者的靶标关系。以miR-1306-5p模拟物和抑制物分别转染鸡前脂肪细胞,利用CCK-8 (Cell Counting Kit-8)试剂盒检测细胞增殖能力,通过油红O染色检测油酸诱导的分化情况。结果显示,BMP2野生型与miR-1306-5p模拟物共转染组的荧光素酶活性较阴性对照极显著下降(P<0.01),而突变型没有显著变化;miR-1306-5p模拟物转染鸡前脂肪细胞48、72和96 h,细胞增殖能力极显著低于阴性对照(P<0.01);在鸡前脂肪细胞的油酸诱导分化过程中,脂肪酸结合蛋白 4 (fatty acid binding protein 4, FABP4)基因表达量极显著升高(P<0.01),而内源性miR-1306-5p和BMP2在诱导分化48和72 h的基因表达量极显著降低(P<0.01);在鸡前脂肪细胞中转染miR-1306-5p模拟物后脂滴较对照小,转染miR-1306-5p抑制物后脂滴增多。因此,miR-1306-5p可能通过靶向BMP2而抑制鸡前脂肪细胞的分化。本研究为深入探讨miR-1306-5p在鸡前脂肪细胞分化中的作用机制提供基础资料。

• 低氧胁迫对虹鳟心脏组织抗氧化和细胞凋亡的影响

  曾粤, 李永娟, 黄进强, 吴深基, 赵璐, 孙同振, 马九菊

  虹鳟(Oncorhynchus mykiss)对低氧极为敏感,低氧胁迫下其抗氧化酶活性和细胞凋亡会受到影响。为了解不同浓度低氧胁迫对虹鳟心脏抗氧化和细胞凋亡的影响,本研究通过酶活性测定和qRT-PCR方法,检测了虹鳟心脏在重度(3.0±0.1 mg/L)和中度(4.5±0.1 mg/L)低氧胁迫下4、8、12、24 h、1月以及复氧(8.5±0.1 mg/L)后12和24 h抗氧化指标和凋亡基因表达的变化。结果显示,与对照组相比,重度低氧胁迫下总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)和过氧化氢酶(catalases, CAT)活性在24 h和1月时显著降低(P<0.05),丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量在12 h显著升高(P<0.05);中度低氧胁迫下T-SOD、CAT、总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)活性呈升高趋势。总蛋白(total protein, TP)含量在重度和中度低氧胁迫1月后均显著降低(P<0.05)。与对照组相比,铜锌-SOD (Cu/Zn-SOD, cu/zn-sod)和锰-SOD (Mn-SOD, mn-sod)基因表达量在重度和中度低氧胁迫下均显著降低(P<0.05),cat表达量在重度低氧4、8和12 h显著降低(P<0.05)。凋亡抑制基因B细胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)表达量在短期低氧各时期显著升高(P<0.05),Bcl-2-associated X (Bax)表达量无显著变化,胱天蛋白酶3 (caspase-3, casp3)和肿瘤抑制因子53 (tumor suppressor gene 53, p53)表达量在12 h显著降低(P<0.05)。酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)含量在重度和中度低氧胁迫12 h均显著高于对照组(P<0.05)。以上结果表明,虹鳟心脏在不同浓度低氧环境下可以通过调节抗氧化酶活性和凋亡相关基因的表达来减少氧化损伤。本研究为进一步阐明低氧环境下虹鳟心脏的氧化应激机制提供依据。

• 核糖体蛋白RpsL调控须糖多孢菌中丁烯基多杀菌素的合成

  苏畅, 王靖楠, 郭超, 徐周钦, 李春, 张根林, 王超

  须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)发酵产生的次级代谢物丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyn)是一种绿色生物杀虫剂。但由于发酵产量低不能满足工业生产需求,选育高生产性能的菌株是实现工业化生产的关键。本研究以须糖多孢菌为底盘细胞分别构建了核糖体蛋白S12 (ribosomal protein S12, RpsL)及RpsL突变体的基因过表达工程菌株Q8 (rpsl)、W43 (rpslK88R)、W44 (rpslR86P)、W45 (rpslK88E)和W46 (rpslK43N),通过摇瓶发酵验证及RpsL蛋白结构比对,分析RpsL对丁烯基多杀菌素合成的影响。结果表明,工程菌株Q8、W43、W44、W45和W46分别使丁烯基多杀菌素的产量提高至275%、146%、111%、122%和降低至75%。进一步研究表明,rpsl和rpslK88R基因的过表达提高了合成途径基因的转录水平,从而使丁烯基多杀菌素的产量显著提高。对二者进行同源建模发现,RpsLK88R突变体结构与RpsL相比,其侧链发生较大的偏转,影响了与mRNA的结合作用进而降低了核糖体翻译效率,因此其提产效果略低于RpsL。本研究为蛋白质工程改造RpsL提高丁烯基多杀菌素的产量提供参考。

• 基于微滴式数字PCR检测牛病毒性腹泻病毒方法的建立及初步应用

  刘芯怡, 李丹, 秦刚, 陈俊贞, 付强, 史慧君

  牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)是引起犊牛(Bos sp.)病毒性腹泻的主要病原之一,导致犊牛免疫力降低,患病率和死亡率升高。目前对BVDV常用的检测方法存在灵敏度较低、容易出现假阳性等状况。本研究基于微滴式数字PCR (droplet digital PCR, ddPCR)技术,建立BVDV精准检测技术。首先针对BVDV 5' UTR基因保守序列区域设计引物和探针,合成BVDV 5' UTR基因并构建质粒标准品。使用BVDV质粒标准品分别建立实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qPCR)和ddPCR检测方法,并优化其反应参数和条件,分析其灵敏度、特异性和重复性,并进行了临床应用。结果显示,本研究建立的qPCR方法中,最佳引物和探针浓度分别为300和500 nmol/L,标准曲线呈良好的线性关系,最低检测下限为1×104 copies/μL,具有良好的特异性和重复性。建立的ddPCR方法中,最低检测下限为0.64 copies/μL,比qPCR灵敏性高15 625倍,该方法具有良好的特异性和重复性。临床检测了82份样品,ddPCR检出率为15.58%,qPCR检出率为14.63%。本研究建立的ddPCR方法比qPCR方法更加灵敏、高效、特异且重复性良好,为BVDV鉴别诊断提供了技术支持。

• 性逆转在硬骨鱼类中的研究现状及育种应用

  刘佳南, 王巍, 吴立新, 胡红霞

  在硬骨鱼类中,一些种类因为雌雄二态性导致养殖效益差异明显。为了提高水产养殖效益,单性养殖是雌雄二态性鱼类育种的目标之一。性逆转作为通过性别控制育种实现单性养殖的有效手段之一,始终是硬骨鱼类繁殖和育种研究的热点。本文从已知硬骨鱼类天然性逆转现象、性逆转方法、性逆转作用机理以及目前在鱼类育种中的应用等方面进行阐述,为选育优质新品种、加快提高硬骨鱼类的养殖效益提供分子育种的理论参考。

• 高通量低成本检测牛MSTN基因突变的DAVID技术构建

  裴栋超, 海超, 赵春生, 张立果, 吴迪, 王德政, 张鑫怡, 杨磊, 李光鹏

  肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)是骨骼肌生长发育的负调控因子,MSTN基因突变可促进动物肌肉发育。目前Sanger测序是检测MSTN基因突变的经典方法,但此方法存在检测通量低、可视化程度低和检测费用高等缺点。本研究利用二代测序技术,通过设计的特异性Barcode序列,能够一次性检测96头牛(Bos taurus)的 MSTN基因突变情况。此外,根据测序Fastq结果文件中的Barcode序列,利用异步线程和并发算法,编写了相关的数据分析DAVID (detect and visualize insertion-deletion)软件。利用DAVID软件将96个混合样本的测序数据逐一拆分,并与扩增子序列(amplicon sequence)比对,最终获得MSTN基因突变的图形和统计信息。利用DAVID技术对96头蒙古牛进行检测,结果发现1头牛的MSTN基因11 bp杂合缺失,剩余95头均为野生型,并且通过Sanger测序对11 bp杂合缺失进行了验证。综上,本研究构建了一个检测牛MSTN基因突变的高通量技术体系,为肉牛遗传改良和育种提供技术支撑。

• 基于核苷三磷酸二磷酸水解酶的马锥虫病间接ELISA抗体检测方法的建立

  曾晴勤, 李如松, 李红英, 王欣乐, 王莹, 夏天奇, 王璞, 时恒枝, 张路平, 郑亚东, 赵秀玲, 宋厚辉

  伊氏锥虫病通常称为苏拉(Surra),是由伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)寄生于马(Equus)、骆驼(Camelus)等动物的血液而引起的一种原虫病。精准诊断是有效防控伊氏锥虫病的关键环节,但是现有诊断技术存在假阴性率高、价格昂贵等缺点。本研究在体外重组表达伊氏锥虫的核苷三磷酸二磷酸水解酶(nucleoside triphosphate diphosphohydrolase, TeNTPDase),通过优化抗原包被浓度及其条件、血清稀释度及其孵育条件、酶标二抗稀释度及其孵育条件等反应参数,建立基于TeNTPDase的马锥虫病间接ELISA抗体检测方法。结果显示,重组TeNTPDase主要以包涵体形式表达,大小约为60 kD;建立的ELISA方法在不同批次包被抗原中的变异系数为3.50%~7.32%,均小于10%,在37 ℃不同孵育时间内的变异系数为3.89%~14.45%,小于15%,表明所建立的方法具有较好的重复性和稳定性;利用建立的ELISA方法检测马临床血清样品,结果显示,伊氏锥虫病的阳性率为5.83% (7/120),与商品化ELISA试剂盒的阳性率(3.33%)没有显著差异,符合率为92.5% (111/120)。本研究为马锥虫病诊断和有效防控提供技术支持。

• 非洲猪瘟病毒p34蛋白重组纳米颗粒的制备及免疫原性评价

  张荣, 茹毅, 蒋成辉, 张越, 赵冬梅, 郝荣增, 李亚军, 郑海学, 刘学荣, 杨进才, 安兰芳, 魏彦明

  铁蛋白纳米颗粒具有可展示多抗原的表面,能更好的促进细胞摄取和抗原呈递,进而增强免疫效力而被广泛应用于疫苗研究。本研究旨在利用铁蛋白制备携带非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV) p34蛋白的纳米颗粒抗原,并评价其免疫原性,为非洲猪瘟纳米疫苗研究提供参考。首先,将编码p34蛋白和SpyTag (ST)标签的基因序列串联后插入pET-28a(+)载体得到pET-p34-ST重组质粒,将编码Spycatcher (SC)与铁蛋白(ferritin, F)的基因序列串联后插入pET-28a(+)载体得到pET-SC-F重组质粒,并分别在大肠杆菌(Escherichia coli)中诱导表达。然后通过亲和层析法纯化2种重组蛋白p34-ST和SC-F后,进行体外偶联得到重组纳米颗粒F-p34。利用SDS-PAGE、Western blot、动态光散射(dynamic light scattering, DLS)、投射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)等方法对制备的F-p34进行鉴定和形态表征,最后通过免疫BALB/c小鼠(Mus musculus)进行体内免疫原性评价。结果显示,本研究成功设计并构建了pET-28a-p34-ST和pET-28a-SC-F原核表达载体,经过体外表达、纯化和偶联,成功制备出偶联非洲猪瘟病毒p34蛋白的铁蛋白纳米颗粒F-p34,其与ASFV阳性血清能够发生特异性反应,DLS和TEM体外表征发现,F-p34粒径大约为21 nm,且具有均一的纳米颗粒结构;F-p34免疫小鼠后7 d即可诱导机体产生特异性免疫应答,在42 d时抗体滴度达到最高且显著高于单体抗原p34免疫组(P<0.05)。F-p34免疫组脾淋巴细胞的增殖水平和血清中细胞因子白细胞介素4 (interleukin 4, IL-4)、IL-10、IL-2和干扰素γ (interferon, IFN-γ)的分泌水平显著高于p34免疫组(P<0.05)。综上,本研究成功制备了具有良好免疫原性的携带非洲猪瘟病毒p34蛋白的纳米颗粒抗原,拓宽了非洲猪瘟亚单位疫苗的研究思路。