农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2023年第3期

• 小麦PDR基因家族的鉴定与表达分析

  何浩, 王志明, 张立强, 唐艺真, 夏琪, 李忠源, 张怀渝

  多向耐药性蛋白(pleiotropic drug resistance, PDR)是ABC转运蛋白超家族重要的亚家族成员,在响应外界胁迫和植物生长发育的生理过程中发挥着重要作用,但在小麦(Triticum aestivum)中研究较少。为探讨小麦PDR基因家族对逆境胁迫的响应,本研究对小麦PDR基因家族进行了全基因组鉴定和生物信息学分析,并通过qPCR方法验证其在非生物胁迫下的响应情况。结果显示,小麦中共鉴定出76个TaPDRs基因,主要位于3、5和7号染色体上,编码氨基酸1 242~1 517个,分子量为140.69~170.99 kD,预测等电点范围为6.22~8.94;系统进化分析将TaPDRs基因分为5类(ClassⅠ~Ⅴ),多数TaPDRs蛋白基序具有高度的保守性,同一类型TaPDRs具有较为相似的基因结构;基因复制分析共发现10组串联复制基因和56对片段复制基因;组织特异性分析发现,TaPDRs基因在小麦不同组织中的表达水平有较大差异,大多在根组织中高表达;qPCR结果显示,TaPDRs基因能够不同程度的响应盐、干旱、镉胁迫以及脱落酸处理。本研究为探索TaPDRs基因在非生物胁迫响应中的作用提供参考。

• 抗感玉米自交系对小斑病菌早期侵染反应的转录组分析

  甘林, 兰成忠, 阮妙鸿, 刘晓菲, 黄伟群, 代玉立, 杨秀娟

  玉米小斑病是世界玉米(Zea mays)产区重要的一种叶部真菌性病害,不同遗传背景的玉米品种对小斑病的抗性存在明显差异。为探明玉米对小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)早期侵染反应的分子机制,本研究采用比较转录组测序技术对小斑病菌接种12和24 h后的抗病自交系'Mo17-R'和感病自交系'罗31-S'的测序数据进行了分析。结果表明,接种病原菌后,'Mo17-R'和'罗31-S'分别共有11 416和11 027个差异表达基因。通过GO功能富集和KEGG代谢途径分析,发现两个玉米自交系在GO分类的细胞、细胞部分、细胞器、膜、结合、催化活性、代谢过程、细胞过程和单有机物过程中被富集的差异表达基因较多;而在苯丙烷类生物合成、信号传导、植物-病原菌互作、淀粉和蔗糖代谢途径中也富集较多的差异表达基因。其中,与抗病相关的富集途径中,苯丙烷类生物合成、植物激素信号传导、植物-病原菌互作为'Mo17-R'和'罗31-S'两个自交系中差异基因共同显著富集的途径,而参与萜类合成途径的基因仅在感病自交系'罗31-S'中获得显著富集。此外,发现过氧化物酶、肉桂醇脱氢酶、乙烯应答转录因子、环核苷酸门控离子通道、细胞色素P450等相关基因在抗病自交系'Mo17-R'中被显著诱导上调表达,而在感病自交系'罗31-S'中基因诱导表达倍数低于抗病自交系或下调表达,提示这些基因在抗病玉米抵抗小斑病菌的早期侵染中发挥重要作用。本研究结果为深入探讨玉米和小斑病菌互作及玉米抗病分子机制提供重要的理论基础。

• 葡萄VvWRKY26基因克隆与表达分析

  张国蓉, 梁长梅, 郭建勇, 张泽宁, 张鹏飞, 赵旗峰, 梁晋军, 温鹏飞

  WRKY家族广泛参与植物的生长发育、调节物质代谢和响应环境信号等过程。为了解葡萄(Vitis vinifera) VvWRKY26基因的功能,本研究以'无核早红' ('WuHeZaoHong')葡萄为材料,采用同源序列法克隆了VvWRKY26基因(GenBank No. KX823961.1),并对其进行了生物信息学、时空表达及水杨酸(salicylic acid, SA)响应表达分析。生物信息学分析表明,VvWRKY26的CDS区长为1 434 bp,编码477个氨基酸,无规则卷曲、α-螺旋及β-折叠构成其二级结构,为非分泌、非跨膜、分布于核内的蛋白;与矮牵牛(Petunia hybrida) PhPH3 (GenBank No. AMR43368.1)、油菜透明种皮2 (Brassica napus transparent testa glabra 2, BnTTG2)(GenBank No. 106423067)和拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtTTG2 (GenBank No. 818303)高度同源,属于第Ⅰ类WRKY转录因子家族。启动子顺式作用元件分析表明,VvWRKY26启动子具有光信号、抵御活性氧胁迫、SA和赤霉素(gibberellin acid, GA)信号等响应元件。荧光定量PCR结果表明,VvWRKY26在花、茎、芽、卷须、幼叶、成熟叶和果实组织中均有表达,在幼果期和转色期表达量较高;SA处理后0.5~8 h表达量均显著高于对照(P<0.05)。本研究为后续研究VvWRKY26在SA信号转导中的作用提供理论依据。

• 葡萄热激蛋白VvDnaJ05与VvDnaJ26基因的克隆和功能分析

  陈天池, 徐涛, 沈乐意, 罗英杰, 刘婷婷, 贾永红, 吴月燕

  葡萄(Vitis vinifera)在栽培过程中常常会遭受众多环境胁迫,了解葡萄植株对胁迫的抗逆机制是当前葡萄栽培技术研究的热点。在众多与抗逆相关的蛋白中,DnaJ蛋白作为热激蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70)的分子伴侣,在植物生理生化及胁迫响应过程中发挥重要作用。本研究以DnaJ基因家族中克隆得到的VvDnaJ05 (GenBank No. OQ102602)和VvDnaJ26 (GenBank No. OQ108519)为研究对象,对其在不同组织、不同激素处理和不同逆境胁迫下的表达量进行了测定;同时构建了过表达和互作载体,对其蛋白功能与互作情况进行了验证。结果显示,VvDnaJ05全长共计822 bp,编码273个氨基酸;VvDnaJ26为1 254 bp,编码417个氨基酸。VvDnaJ05和VvDnaJ26分别在果皮和种子中呈高表达状态。VvDnaJ05和VvDnaJ26启动子区均存在激素响应元件,两者在茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)和水杨酸(salicylic acid, SA)处理下表达量均出现明显变化。VvDnaJ05和VvDnaJ26在盐、弱光胁迫和热胁迫下表达量出现明显变化,特别是在热胁迫处理下,热胁迫(35 ℃)处理6 h后两者的表达量相比于处理前均显著升高(P<0.05)。经瞬时过表达VvDnaJ05和VvDnaJ26处理的烟草(Nicotiana tabacum)植株,相比于空载处理组,丙二醛和过氧化氢的含量显著降低(P<0.05),耐热性明显更强。亚细胞定位显示,VvDnJ05定位于细胞质和细胞核中,VvDnaJ26则定位在细胞质中。酵母双杂交实验显示,VvDnaJ05和VvDnaJ26蛋白不存在互作情况。以上结果表明,VvDnaJ05和VvDnaJ26各自发挥其生物学功能并在葡萄抗逆境胁迫过程中发挥重要作用。本研究初步阐明了VvDnaJ的潜在功能,为后续DnaJ蛋白的深入研究及抗逆性葡萄品种选育提供理论参考。

• 褪黑素对半夏高温倒苗及DNA甲基化的影响

  崔婉宁, 杨金荣, 刘梦梦, 韩磊, 刘晓, 尤倩, 赵丰兰, 薛涛, 朱艳芳, 薛建平

  褪黑素广泛参与植物的逆境响应调控,其在半夏(Pinellia ternata)高温倒苗中的功能及调控机制尚不清楚。本研究以'宿半夏'为材料,比较不同浓度褪黑素处理对半夏高温倒苗率的影响,并基于甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)分析褪黑素处理对半夏基因组甲基化变异的影响。结果表明,浓度为50和100 μmol/L的褪黑素均可显著降低半夏的高温倒苗率(P<0.05)。选取效果较好的褪黑素浓度(50 μmol/L)对半夏进行处理,分析其对半夏基因组甲基化变异的影响,发现对照组半夏在高温胁迫0和6 h的总甲基化率分别为56.97%与45.38%,而50 μmol/L褪黑素处理组在高温胁迫6 h的甲基化率为52.11%,表明褪黑素处理总体上延缓了高温胁迫诱导的半夏基因组的去甲基化。分析差异甲基化条带发现,褪黑素处理主要影响半夏线粒体与叶绿体基因组甲基化的修饰;同时发现,半夏过氧化氢酶2 (P. ternata catalase 2, PtCAT2)在褪黑素处理条件下去甲基化,且基因表达量上调,表明褪黑素可通过甲基化修饰调控活性氧的积累,进而参与高温胁迫条件下半夏的倒苗调控。本研究明确了褪黑素调控半夏高温倒苗的功能,并从表观遗传视角解析了其可能的调控途径,为研究半夏的倒苗调控机理提供了理论参考。

• 马尾松SPL基因家族鉴定及其响应低磷胁迫的表达分析

  王春昱, 范付华

  SPL (SQUAMOSA promoter binding protein (SBP)-like)是植物特有的转录因子,在植物生长发育和代谢中具有重要作用。本研究基于课题组前期获得的马尾松(Pinus massoniana)转录组数据筛选SPL家族成员,通过生物信息学方法,对马尾松SPL基因家族成员进行蛋白理化性质分析、亚细胞定位预测、保守蛋白基序(motif)分析和系统进化树分析。结果显示,在马尾松转录组数据中筛选出11个家族成员,预测所有家族成员定位于细胞核,编码蛋白质由190~1 147个氨基酸组成,相对分子质量为21.6~127.1 kD;所有序列都含有motif1~3,为SBP结构域保守基序;11个PmSPL成员都含有2个C2HC锌指结构和1个核定位信号。利用qRT-PCR技术检测PmSPL基因家族对低磷胁迫的响应,结果显示,在低磷处理不同时间的马尾松幼苗地上和地下部分,PmSPL3和PmSPL8表达均没有显著变化,对低磷胁迫没有响应;PmSPL4和PmSPL6在低磷处理12 d的地上和地下部分均显著上调表达,可能在低磷胁迫响应中发挥作用。本研究结果为进一步揭示马尾松SPL基因响应低磷胁迫的生物学功能提供参考依据。

• 大通牦牛PDGFD基因克隆、生物信息学及组织表达谱分析

  李歆怡, 王福彬, 黄纯, 马晓明, 喇永福, 褚敏, 郭宪, 阎萍, 潘和平, 梁春年

  牦牛(Bos mutus)是高原地区十分重要的种质资源。为研究牦牛血小板源性生长因子D (platelet-derived growth factor D, PDGFD)基因的结构及功能,并探究其在牦牛不同年龄的7个组织中的表达情况,本研究以36月龄大通牦牛的皮下脂肪组织cDNA为模板克隆牦牛PDGFD基因的CDS序列,利用基因序列进行生物信息学分析及蛋白理化性质预测,qPCR检测PDGFD在大通牦牛胚胎期150 d与36月龄成年时期2个年龄段7个组织(心, 肝, 脾, 肺, 肾, 背最长肌, 皮下脂肪)中的相对表达量。结果表明,大通牦牛PDGFD的CDS区全长为1 095 bp,共编码氨基酸364个,同野牦牛PDGFD基因的亲缘关系最近(99.8%),与猪(Sus scrofa)最远(91.2%);牦牛PDGFD蛋白预测为稳定的亲水性分泌蛋白,无跨膜结构域,存在1个CUB结构域(116 aa)及1个PDGF结构域(93 aa);PDGFD蛋白高级结构由无规则卷曲(48.21%)、α-螺旋(25.62%)、延伸链(21.49%)和β-转角(4.68%)相互连接而成,主要与同为血小板源性生长因子、血管内皮生长因子相关蛋白相互作用。qPCR结果显示,牦牛2个发育阶段的7个组织中均有PDGFD基因的表达,在对比2个时期的PDGFD基因组织表达规律后发现,心脏中的基因表达维持在较高水平,脂肪组织中的基因表达量变化最大,随着牦牛生长极显著升高(P<0.001)。推测PDGFD基因与牦牛心脏发育有着密切关系,在生长发育过程中影响脂肪的沉积。本研究为PFGFD基因在牦牛脂肪沉积的调控机制的研究提供理论依据,可以作为牦牛的遗传育种的参考。

• 瘦素及其受体在幼年牦牛不同部位皮肤中的差异性分析

  赵鹏飞, 崔燕, 余四九, 廖博, 何俊峰, 张虔, 徐宏伟

  瘦素(leptin, LP)及其受体(leptin receptor, LEPR)在食物摄入和控制能量消耗等方面起着关键作用,LP及LEPR在皮肤和毛囊生长过程中所发挥的作用也逐渐被证明。为探究LP和LEPR在幼年牦牛(Bos grunniens)不同部位皮肤组织中的分布特点,以及在不同部位皮肤中可能发挥的作用,本研究选取10头健康幼年牦牛,采集背部、腹部、腋下以及阴囊皮肤,利用qPCR、Western blot和免疫组织化学法对LP及LEPR在幼年牦牛背部、腹部、腋下和阴囊4个部位皮肤组织中的准确分布位置及表达量进行研究。免疫组化结果显示,LP和LEPR表达部位基本相同,主要分布在表皮层、毛囊外根鞘、汗腺、皮脂腺、毛细血管内皮细胞以及真皮层内成纤维细胞中。平均光密度结果显示,LP和LEPR在腹部和背部的表达水平均显著高于腋下和阴囊(P<0.05)。qPCR结果显示,LP在背部和腹部的表达水平显著高于腋下和阴囊(P<0.05);LEPR在背部的表达水平显著高于其他3个部位(P<0.05);腹部、腋下、阴囊两两相比较,差异不显著(P>0.05)。Western blot结果显示,LP在腹部和背部表达量显著高于腋下和阴囊的表达量,且各部位之间差异均显著(P<0.05)。LEPR在背部和腹部的表达量显著高于阴囊和腋下的表达量,且各部位之间差异均显著(P<0.05)。本研究在幼年牦牛皮肤中检测到LP和LEPR的表达,不同部位皮肤组织中的表达位置基本相同,主要集中在表皮、毛囊外根鞘、皮脂腺、汗腺、毛细血管内皮细胞及真皮层内成纤维细胞中,但不同部位皮肤中的表达水平存在显著差异,结果表明LP和LEPR可能在皮肤和毛囊生长过程中发挥重要作用。本研究为进一步探究高原环境下牦牛皮肤及毛囊生长调控机制提供一定的基础资料。

• YAP和TEAD1在牦牛黄体形成、发育和退化中的表达

  周应聪, 王靖雷, 张同享, 杜培岩, 李一娟, 姚颖, 钱文洁, 崔燕, 余四九, 樊江峰

  Yes相关蛋白(yes-associated protein, YAP)和TEA转录因子1 (TEA domain transcription factor 1, TEAD1)是Hippo信号通路的下游转录共激活因子,在雌性动物生殖过程中发挥重要作用。为探究YAP和TEAD1与牦牛(Bos grunniens)黄体(corpora lutea, CL)形成、发育和退化之间的关系,本研究采集雌性牦牛黄体组织,按照黄体的形成(红体期和有腔黄体期)、发育(妊娠黄体期)和退化(退化黄体期和白体期)过程将实验材料分为5组,通过qPCR和Western blot检测YAP和TEAD1基因和蛋白在黄体形成、发育和退化中的表达差异性,运用免疫组织化学法对YAP和TEAD1在黄体形成、发育和退化中进行定位分析。结果显示,YAP和TEAD1在牦牛黄体组织中有较丰富的表达,且在黄体组织的不同发育阶段其表达量存在差异性,尤其是在有腔黄体期YAP和TEAD1表达量最高且显著高于其他时期(P<0.05),而在退化期黄体组织中YAP和TEAD1表达量最低。免疫组织化学结果显示,YAP和TEAD1主要分布于牦牛粒性黄体细胞、血管内皮细胞以及成纤维细胞。研究结果表明,YAP和TEAD1介导Hippo信号通路通过刺激黄体细胞的增殖,参与了雌性牦牛黄体组织的形成、发育和功能发挥,并且与此过程中血管生成有关。本研究为进一步探索Hippo通路对牦牛卵巢机能调控及维持妊娠的作用机制提供了理论依据。

• Novel-miR-23900对绵羊卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的影响

  张配颖, 王文君, 宋鹏琰, 陈晓勇, 岳巧娴, 周荣艳

  颗粒细胞在动物卵泡发育中具有重要作用,miRNA通过控制卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡影响卵泡发育。本研究旨在揭示novel-miR-23900在绵羊(Ovis aries)卵泡颗粒细胞中的作用。首先将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞进行卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)处理,qPCR结果显示,FSH处理使增殖和凋亡相关基因CDK2、CDK4、CCND2和Bcl2表达量极显著升高(P<0.01),Bax和Casp3基因表达量以及novel-miR-23900水平极显著降低(P<0.01)。进一步将novel-miR-23900模拟物及其阴性对照转染颗粒细胞,采用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)检测细胞增殖,采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测细胞凋亡,利用qPCR检测增殖与凋亡相关基因的表达变化。结果显示,转染novel-miR-23900模拟物72和96 h颗粒细胞的增殖能力显著降低(P<0.05),转染48 h增殖能力极显著降低(P<0.01),增殖相关基因CDK1、CDK4、CCNB1和CCNB2的表达量极显著降低(P<0.01),CDK2、CCND1和CCND2的基因表达量显著降低(P<0.05);转染novel-miR-23900模拟物48 h促进颗粒细胞凋亡,凋亡相关基因Bcl2表达量极显著降低(P<0.01),Casp3基因表达量极显著升高(P<0.01),Bax基因表达量显著升高(P<0.05)。综上所述,novel-miR-23900抑制了绵羊卵泡颗粒细胞的增殖并促进其凋亡。本研究为探讨novel-miR-23900对绵羊颗粒细胞的影响及其在卵巢中发挥的作用提供基础资料。

• 东湖F1代奶绵羊精液冷冻前后的蛋白质组差异研究

  李德娴, 王广, 陈璐, 余梦琦, 邹家浩, 张永涛, 袁宇欣, 张磊, 李广

  奶绵羊(Ovis aries)精液低温保存过程中发生蛋白质组的变化,可能引发精子死亡或生育能力下降。为了明确新鲜和冻融公羊精液的差异表达蛋白,本研究利用人工阴道法采集18只东湖F1代奶绵羊公羊的精液,以甘油和卵黄作为主要冷冻保护剂进行冷冻保存,然后提取并纯化鲜精和冻精的总蛋白,通过串联质谱标签(tandem mass tag, TMT)技术进行蛋白质组学分析。结果显示,冷冻前后共筛选出936种蛋白质;以变化倍数(fold change, FC)>1.1且P<0.05为筛选条件,鲜精与冻精之间共存在22种差异蛋白,其中17种蛋白质表达上调、5种蛋白质表达下调,均参与精子代谢和生物过程的调控;GO富集分析显示,8个差异蛋白分别涉及精子的生物过程和细胞组分;通过KEGG对差异表达蛋白显著富集的信号通路进行分析,发现差异蛋白主要富集在新陈代谢、蛋白质代谢、凋亡等相关通路。选择2个上调和2个下调蛋白,通过Western blot检测其在鲜精和冻精中的丰度,结果显示,4种蛋白质的相对丰度与TMT蛋白质组学分析的结果相似,表明蛋白质组学数据可靠。本研究为东湖F1代奶绵羊精液冷冻损伤的蛋白标志物筛选提供基础资料。

• 尼罗罗非鱼选择性自噬接头受体基因(sqstm1)克隆及其功能分析

  黄美玲, 江栢坚, 冯佳敏, 李星, 黄瑜, 简纪常

  尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)选择性自噬接头受体蛋白1 (sequestosome 1 receptor protein, Sqstm1)是一种选择性自噬接头蛋白,可选择性参与清除细胞内受损的细胞器和蛋白质。为分析sqstm1基因的功能,研究其在健康尼罗罗非鱼各组织中的表达分布及抗菌抗病毒应答过程中的表达模式,本研究克隆了On-sqstm1基因(GenBank No. XP_005463852) ORF序列,通过生物信息学及亚细胞定位分析On-sqstm1基因的序列和定位特征,利用qPCR技术分析其在健康罗非鱼各组织及不同刺激物刺激后各组织中的表达模式,采用双荧光素酶报告系统检测On-sqstm1基因过表达对核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)活性的影响。结果显示,本研究成功克隆了On-sqstm1基因的ORF序列,长度为1 287 bp,编码428个氨基酸;亚细胞定位结果显示On-Sqstm1蛋白定位于细胞质。qPCR结果显示On-sqstm1基因在罗非鱼各组织中均有表达,在肝脏中表达量最高;在无乳链球菌(Streptococcus agalctiae)和Poly I:C病毒类似物刺激后,该基因在罗非鱼的脑、头肾、肝脏、肠道及脾脏组织中的表达量均显著上调(P<0.05)。双荧光素酶报告系统显示On-Sqstm1蛋白可以显著激活NF-κB活性。以上结果显示,On-Sqstm1蛋白可能通过介导NF-κB信号通路的活性参与对病原体感染的免疫应答过程。本研究为进一步研究On-Sqstm1蛋白的作用机制提供了参考。

• 灵芝GlbHLH1基因的克隆、亚细胞定位与功能分析

  王依依, 徐娟, 阮诗雨, 张翼, 邢丙聪, 陈彬煌, 吴学谦

  茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)能诱导灵芝(Ganoderma lingzhi)萜类的合成,为探究灵芝萜类生物合成与碱性/螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)基因及茉莉酸(jasmonic acid, JA)信号调控之间的关系,本研究通过同源比对,从灵芝中克隆获得了与灵芝萜类合成相关的bHLH基因片段,进一步克隆了该基因的全长,并对其进行了生物信息学、转录活性、原核表达、亚细胞定位、过表达和沉默表达分析。结果显示,从灵芝中获得了一段与正调控丹参酮合成bHLH转录因子同源性较高的bHLH基因片段,qRT-PCR分析表明,该基因显著响应MeJA诱导,灵芝三萜(又称灵芝酸, ganoderic acid, GA)合成途径3个关键基因在MeJA诱导下表达量均显著增加(P<0.05),且表达模式与bHLH一致;克隆得到长度为1 311 bp的GlbHLH1基因(GenBank No. MW981280.1),编码436个氨基酸,蛋白分子量为46.33 kD;启动子分析表明,灵芝三萜合成途径3个关键基因启动子区域均存在与bHLH转录因子相结合的G-box;系统进化分析显示,GlbHLH1与紫芝(G. sinense)的GsPIL37177.1亲缘关系最近;酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)体内的转录激活活性表明,该基因具有转录激活活性;成功构建了GlbHLH1基因的原核表达载体,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21中表达出预期大小(约75 kD)的融合蛋白;亚细胞定位显示GlbHLH1主要定位于细胞核;转基因结果显示,与野生型相比,过表达与沉默菌株的GlbHLH1表达量分别显著上调或下调(P<0.05),且过表达菌株OE-GlbHLH1-1、OE-GlbHLH1-2和OE-GlbHLH1-3中三萜含量分别增加25%、22%和38%,沉默菌株Si-GlbHLH1-1和Si-GlbHLH1-2的三萜含量分别减少了约15%和30%。综上所述,GlbHLH1为控制灵芝三萜合成的转录因子。以上结果为进一步研究灵芝bHLH的分子调控机制提供理论依据。

• 玉米大斑病菌甘油通道调节蛋白基因StRGC2的克隆及表达分析

  孙明轩, 李正正, 刘玉卫, 巩校东, 范永山, 韩建民, 谷守芹, 董金皋

  甘油通道调节蛋白2 (regulator of glycerol channel 2, RGC2)是高渗透性甘油促分裂原活化蛋白激酶(high osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase, HOG-MAPK)级联途径的下游关键因子。在模式真菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中ScRGC2参与调控细胞内甘油浓度从而保护细胞免受损伤。为明确玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)甘油通道调节蛋白基因StRGC2的结构特征及其在高渗胁迫下的表达模式,本研究克隆得到了玉米大斑病菌StRGC2基因(GenBank No. XP_008024338),通过对该基因及其编码蛋白结构特征的分析,发现该基因包含3个内含子,4个外显子,其DNA全长为1 857 bp,cDNA全长为1 389 bp。StRGC2蛋白C端存在1个PH保守结构域,且定位在细胞核中。通过对玉米大斑病菌5个典型发育时期(菌丝, 分生孢子, 芽管, 侵入钉和附着胞形成)的RNA-seq数据分析,发现该基因在附着胞发育时期表达水平最高。对该基因启动子元件预测分析,显示该启动子存在多种非生物胁迫诱导型元件,其中包含与高渗胁迫相关的逆境胁迫诱导型元件。进一步对高渗胁迫下StRGC2基因的表达模式进行分析,结果表明该基因在0.4 mol/L NaCl处理3 h时,表达水平急剧升高,表明该基因参与调控病菌的高渗胁迫反应。本研究明确了StRGC2基因的结构特性及其表达模式,为深入研究该基因的功能和其在病菌致病过程中的分子机制提供了基础资料。

• 福建省玉米大斑病菌对吡唑醚菌酯不同敏感性菌株的遗传多样性与群体遗传结构分析

  代玉立, 甘林, 刘晓菲, 兰成忠, 杨秀娟

  玉米大斑病(northern corn leaf blight, NCLB)是严重影响玉米(Zea mays)产量和品质的叶部真菌病害。为明确福建省玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)对吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)不同敏感性菌株的遗传多样性和遗传结构,本研究采用含药平板抑制菌落生长法评估福建省玉米大斑病菌对吡唑醚菌酯的敏感性,使用简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat, ISSR)标记技术分析吡唑醚菌酯不同敏感性菌株的遗传多样性和遗传结构。结果显示,吡唑醚菌酯对福建省62株玉米大斑病菌的菌落有效抑制中浓度(effective concentration for 50% colonial inhibition, EC50)值的范围为0.002 1~1.288 4 μg/mL,平均值为(0.127 4±0.254 5) μg/mL,吡唑醚菌酯的频率分布曲线为连续单峰曲线且不符合正态分布(W=0.742 2, P=0.001 0<0.05)。吡唑醚菌酯敏感型、中间型和不敏感型菌株的EC50值的范围分别为0.002 1~0.011 2、0.020 6~0.100 0和0.101 9~1.288 4 μg/mL,不敏感型菌株的抗性倍数介于3.01~38.01之间,方差分析表明不敏感型菌株的EC50平均值与敏感型和中间型菌株比较均存在显著的差异(P<0.05)。综上所述,福建省玉米大斑病菌已出现对吡唑醚菌酯敏感性下降的亚群体。遗传多样性分析表明,11条ISSR引物共扩增出66个位点,多态性位点百分比(percentage of polymorphic loci, PL)高达98.48%,敏感型群体的DNA多态性水平最低(PL=60.61%),不敏感型群体的DNA多态性水平最高(PL=68.18%),不敏感型群体的遗传多样性指数值均高于敏感型群体,表明不敏感型群体的遗传多样性更丰富。遗传分化(genetic differentiation, ΦPT)与基因流(gene flow, Nm)分析表明,吡唑醚菌酯敏感型、中间型和不敏感型两两群体间的遗传分化水平较低(ΦPT<0.054, P>0.37)且基因交流十分频繁(Nm>8.60)。聚类分析也表明吡唑醚菌酯不同敏感性的菌株随机聚于同一分支,说明病原菌群体的遗传分化与抗药性水平的相关性不明显。分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)表明,福建省玉米大斑病菌对吡唑醚菌酯不同敏感性群体的遗传变异全部来源于群体内。主坐标(principal coordinates analysis, PCoA)和群体遗传结构分析表明,3个不同敏感性的玉米大斑病菌群体分为2个遗传类群,且3个群体间的遗传结构十分相似。研究结果为玉米大斑病菌的抗药性田间监测和利用抗病品种生态调控玉米大斑病提供了参考。

• 高通量测序分析鉴定东星斑溃烂病主要致病菌

  王磊, 张天时, 刘洋, 张子威, 李开敏, 朱春华, 陈松林

  东星斑(Plectropomus leopardus)是一种新兴的经济型养殖鱼类,近年来溃烂症已成为其主要病害,严重影响幼鱼和成鱼,造成极大的经济损失,分离鉴定溃烂症主要致病菌是开展抗病选育的前提。本研究利用PacBio三代高通量测序方法对东星斑病鱼溃烂部位和正常鱼皮肤进行了微生物测序和聚类分析。结果显示,正常组中特有的OTUs (operational taxonomic units)为403个,而病鱼组有72个特有的OTUs,两组共有OTUs数是74个。正常组平均识别出16个门、30个纲、63个目、96个科、145个属、168个种,然而在病鱼皮肤平均识别出9个门、12个纲、27个目、38个科、55个属、67个种。这种差异说明致病菌抑制了正常菌群的生长,导致病鱼皮肤中的菌群结构多样性明显降低。正常组和病鱼组优势菌群组成存在较大差异,正常鱼中以变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)为主;病鱼中以拟杆菌门(Bacteroidetes)和ε变形菌门(Epsilonbacteraeota)为主。ANOVA方差分析显示病鱼皮肤中弧菌属(Vibrio)的含量显著升高,通过KRONA分析注释出哈维氏弧菌(V. harveyi)、塔式弧菌(V. tubiashii)和不可培养弧菌(uncultured-Vibrio)。经细菌分离实验鉴定1株哈维氏弧菌,命名为V. harveyi stain Dx21。通过腹腔注射法进行回归感染实验,发现V. harveyi stain Dx21能够导致东星斑幼鱼体表溃烂,随后导致死亡,症状与自然感染相似。该菌株对体重为100 g东星斑鱼苗的半致死浓度为1.0×105 cfu/mL。综上所述,本研究揭示了东星斑病鱼皮肤的菌群特征,提示哈维氏弧菌是主要致病菌之一。本研究对于东星斑溃烂病的病害防控以及疫苗的研制具有一定的指导意义。

• 果实挥发性成分的生物合成与代谢调控研究进展

  李晓颍, 宋立琴, 李明媛, 王海静, 刘建珍, 武军凯, 张立彬

  果实挥发性成分是构成果实独特的风味重要组成,是影响消费者喜好程度和市场竞争力的关键因素。果实挥发性成分复杂,不同品种果实的挥发物组成与含量差别明显,这不仅由遗传决定,还与环境因素、采后处理等密切相关。果实挥发性成分的产生涉及复杂的生物学过程,按其来源不同主要分为萜类、氨基酸衍生物、脂肪酸衍生物等,多数具有特殊的生物学功能。近年来,随着分子生物学技术与代谢组学的不断发展,人们对果实挥发性成分的研究不断深入,有关代谢途径中的一系列关键酶、转录因子、关键基因的鉴定与代谢调控机理的认识取得了重要进展,相关研究对于从分子水平上认识与调控果实挥发性成分的合成,指导现代育种计划具有重要意义。本文对果实挥发性成分的组成、生物学功能与主要代谢途径做了较为全面的介绍,并总结了近年来一些关键酶、基因、处理手段对挥发性成分合成的调控作用。以期为果实香气品质改良的分子育种技术提供参考依据。

• 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白q多肽在哺乳动物繁殖调控中的研究进展

  王唯, 贺小云, 储明星

  鸟嘌呤核苷酸结合蛋白q多肽(guanine nucleotide binding protein q polypeptide, GNAQ)是q类G蛋白的α亚基成员,在细胞信号传递中发挥着重要作用。有研究表明GNAQ在多个生殖相关组织中参与哺乳动物的繁殖调控。本文主要就GNAQ的发现、作用机制以及在哺乳动物下丘脑激素分泌、子宫功能、卵巢生理、雄性睾丸发育和精子发生等繁殖方面的研究进展进行综述,为后续深入探究GNAQ在哺乳动物繁殖过程中的作用机制提供参考。

• 鸡LncBMP4编码小肽EPC5的生物信息学分析和多克隆抗体制备

  夏钱, 龚威, 金晶, 张晨, 高晓敏, 陈晨, 周舒简, 胡菜, 张玉, 李碧春, 左其生

  鸡(Gallus gallus)原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)在转基因动物制备和种质资源保护领域具有广泛应用前景,为了解析鸡PGCs形成的分子机制,本研究前期鉴定了1个调节鸡PGCs形成的关键长链非编码RNA-骨形成蛋白(long noncoding RNA-bone morphogenetic protein 4, LncBMP4),可编码小肽EPC5 (expression in primordial germ cells chromosome 5)。本研究通过在线预测软件初步分析EPC5小肽的化学结构并进行初步的亚细胞定位。通过化学合成法构建PET-EPC5-His-B2M原核融合表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL2感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导后大量表达和纯化EPC5抗原。利用纯化的抗原进行动物免疫并收集抗血清(G1480, G1481),通过ELISA检测抗血清效价。纯化抗体并通过Western blot进行鉴定。结果表明,EPC5主要定位于细胞内并具有RNA聚合酶亚基。成功构建PET-EPC5-His-B2M载体,且诱导表达后重组蛋白大小约为25 kD。ELISA检测发现G1480抗血清效价为1:5.12×105 (OD抗血清/OD免前血≥2.1),G1481抗血清效价为1:1.024×106 (OD抗血清/OD免前血≥2.1)。对G1480抗血清进行纯化,产生的EPC5多克隆抗体浓度为10 mg/mL,ELISA检测显示效价为9.8 ng/mL时(OD450>0.2)。Western blot检测结果显示制备的多克隆抗体可以特异性结合体内外表达的EPC5蛋白。本研究成功地制备EPC5多克隆抗体,为进一步研究EPC5在PGCs形成过程中的功能和机制提供了基础。

• 珠葱中葱潜隐病毒SYBR Green Ⅰ 实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

  刘悦, 刘建青, 张春雨, 苏颖, 李小宇, 王永志

  葱潜隐病毒(Shallot latent virus, SLV)是危害珠葱(Allium cepa var. aggregatum)等葱属植物的主要病毒之一,在葱属植物种植区普遍存在。本研究根据GenBank中已登录的SLV 外壳蛋白(coat protein, CP)基因保守区,设计并合成1对特异性引物,通过对引物浓度和退火温度进行优化,建立了基于SYBR Green Ⅰ 的SLV实时荧光RT-PCR (reverse transcription PCR)检测方法。该方法标准曲线Ct值与模板浓度的对数呈良好的线性关系,扩增效率为94.529%,相关系数R2为0.999 6;与胡葱黄条病毒(Shallot yellow stripe virus, SYSV)、洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus, OYDV)和青葱X病毒(Shallot virus X, SVX)均无交叉反应;最低检出限为10-7倍稀释cDNA,为常规RT-PCR的1 000倍;组内和组间变异系数分别为0.02%~0.63%和0.03%~1.24%,表明该方法稳定性好。利用该方法对珠葱叶和鳞茎的SLV含量进行测定,并对50份疑似SLV感染的珠葱样品进行检测,结果表明,珠葱叶中SLV含量明显高于鳞茎,且SYBR Green Ⅰ 实时荧光RT-PCR检出46份阳性样品,检出率较常规RT-PCR高6%。本研究基于SYBR Green Ⅰ 建立的SLV实时荧光RT-PCR方法为珠葱SLV的快速检测提供技术支持。