农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2023年第2期

• 小麦Whirly基因家族的鉴定及表达分析

  孙月, 杨慧玉, 朱文根, 王小燕, 唐益苗

  Whirly家族属于植物特有的转录因子,在多种植物生长发育、抗病和胁迫响应等方面发挥着重要作用。为探究小麦(Triticum aestivum) Whirly家族成员数量及潜在功能,本研究借助生物信息学方法,对鉴定到的6个TaWHYs成员(分别命名为TaWHY1-A, TaWHY1-A-1, TaWHY1-D, TaWHY2-A, TaWHY2-B, TaWHY2-D)进行蛋白理化性质、基因结构、蛋白三维结构及系统进化分析;使用qPCR对TaWHYs成员在干旱、高温、低温胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,TaWHYs蛋白不稳定指数为30~60,亲水性平均系数小于0,蛋白性质稳定,属于亲水蛋白。亚细胞定位预测显示,TaWHYs蛋白在细胞核、细胞质、线粒体、叶绿体中均有分布。TaWHYs蛋白二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,存在2种三维结构模型。转录组数据分析表明,TaWHY基因表现出不同的组织表达模式,并受到低温、高温、干旱等不同非生物胁迫的调控。qPCR结果表明,TaWHY1-A基因在低温胁迫条件下相对表达量显著上调(P<0.05),能够响应低温胁迫。本研究结果为更深层次的TaWHY功能验证和作用机理分析提供参考。

• 小麦TaGPX8基因的克隆与表达分析

  张华东, 李雅倩, 董飞燕, 丁芳草, 刘孟伟, 许嘉盛, 高春保, 王晓玲, 刘易科, 方正武

  谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)作为植物最主要的抗氧化酶之一,在植物逆境胁迫应答中发挥着重要作用。本课题组前期对小麦(Triticum aestivum) GPX基因家族的转录组数据进行分析时发现,TaGPX8 (IWGSC数据库登录号: TraesCS4D02G162000.1)基因具有受逆境诱导表达的特性,本研究对TaGPX8进行了克隆,并对其编码蛋白进行了生物信息学分析和亚细胞定位,同时对盐和干旱胁迫下根和叶中TaGPX8的表达进行了分析。基因结构分析显示,TaGPX8全长14 754 bp,包含6个外显子和5个内含子,CDS全长564 bp,编码187个氨基酸残基,编码蛋白相对分子质量是21.330 kD,理论等电点为6.62,亲水性平均值为-0.664;启动子序列分析发现TaGPX8的启动子序列中含有多个参与激素反应、光反应和响应胁迫的顺式作用元件;qPCR结果显示,TaGPX8基因响应干旱胁迫和盐胁迫,干旱胁迫12 h时TaGPX8在叶片中的表达量与对照无显著差异,干旱胁迫24 h时被显著诱导,表达量上调,为对照的12倍,48 h时表达量降低,与对照无显著差异,且干旱胁迫48 h时在根部的表达也有所上升;TaGPX8在盐胁迫12 h叶片中表达受到一定程度抑制,但在处理24 h表达量升高,之后又降低与对照无显著差异,而在根中的表达受到抑制。酵母转录激活活性分析显示TaGPX8基因没有转录自激活活性。亚细胞定位显示TaGPX8定位于细胞核和细胞膜。本研究为深入探究TaGPX8基因的功能提供了参考。

• 拟南芥突变体atput3过表达水稻OsPUT1基因对百草枯敏感性的研究

  张斌, 黄亚玲, 彭英姿, 滕杰, 陈稳

  多胺是一类分子量比较低且具有生物活性的脂肪族含氮碱,在植物生长发育过程中发挥重要作用。多胺转运蛋白(polyamine uptake transporters, PUT)介导细胞内和细胞间氨基酸、多胺、百草枯(paraquat, PQ)和硫胺的运输。研究表明,拟南芥(Arabidopsis thaliana)多胺转运蛋白AtPUT3突变体atput3对0.1 μmol/L百草枯具有一定的抗性。为了研究百草枯胁迫条件下水稻(Oryza sativa) PUT在植物生长发育中的作用,本研究采用生物信息学方法,在水稻基因组中鉴定出6个PUT,其中水稻OsPUT1和拟南芥AtPUT3蛋白分子量接近,结构类似,是一种N端和C端位于胞质侧且含有12个跨膜结构并具有氨基酸转运体结构域的膜蛋白。通过双酶切克隆法,构建了pFGC1300-35S-OsPUT1基因的过表达载体,并转化拟南芥突变体atput3。结果显示,在完整生命周期内,短日照条件下,拟南芥野生型(WT)、拟南芥突变体(atput3)和过表达OE株系表型差异不明显,抽薹所需时长和抽薹时莲座叶数三者无显著差异;在1/2 MS培养基(0 µmol/L PQ)上种子萌发48 h,三者萌发率差异不显著。但是,在1/2 MS培养基(0.1 μmol/L PQ)上种子萌发5 d时,WT和EO株系种子萌发率与atput3相比显著降低(P<0.05)。在1/2 MS (0.1 µmol/L PQ)上幼苗生长10 d,EO株系表型恢复到WT状态,相比atput3,WT和EO株系主根长度显著降低(P<0.05)。说明OsPUT1基因功能互补,使atput3的表型恢复为WT,证明水稻OsPUT1蛋白具有类似拟南芥AtPUT3蛋白的功能。本研究为下一步探究OsPUT1基因的功能提供参考,为进一步探讨水稻对PQ的抗性提供一定的启示。

• 马铃薯StERF5基因的生物信息学及表达分析

  王睿, 濮雪, 王凯彤, 张欢欢, 张宁, 司怀军

  AP2/ERF (APETALA2/ethylene responsive factor)家族是植物中转录因子家族之一,ERF亚家族为AP2/ERF家族的主要成员,本研究对马铃薯(Solanum tuberosum) StERF5基因进行了生物信息学分析、亚细胞定位及基因表达量分析,以进一步明确该基因的功能。结果表明,马铃薯StERF5编码243个氨基酸,含1个AP2结构域;亚细胞定位结果显示该蛋白定位于细胞核与细胞膜;组织特异性表达分析显示StERF5基因在根、茎、叶中均有表达,根中的表达量最高,在茎中存在极显著品种差异(P<0.01),在干旱与盐处理下均呈上调表达。本研究为后续深入了解StERF5的功能奠定了基础。

• 大豆GmDFR基因克隆及其抵御缺铁胁迫功能的鉴定

  石卓, 李洪, 高铭, 郭长虹, 郭东林, 毕影东

  二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase, DFR)在植物的花青素合成中发挥关键催化作用。花青素能保护组织免受非生物胁迫诱发的氧化应激,也可以作为螯合剂促进植物对铁的吸收。本研究克隆了大豆(Glycine max) GmDFR基因(GenBank No. MN547961) CDS及其启动子片段pGmDFR (GenBank No. MW455109),并对其生物信息学和抵御缺铁胁迫的功能进行了分析。结果显示,GmDFR的CDS全长1 020 bp,编码339个氨基酸。GmDFR具有典型的PLN02650和WcaG超家族结构域,属于DFR和核苷二磷酸糖异构酶家族,GmDFR蛋白不是跨膜蛋白。系统发育分析表明,大豆GmDFR与野生大豆(G. soja) GsDFR的相似度最高,为99.12%。半定量RT-PCR检测表明GmDFR在大豆各组织中均有表达,且在根中表达水平最高。克隆获得启动子片段pGmDFR,含有多个激素和逆境胁迫响应元件。缺铁(0 mmol/L Fe-EDTA)胁迫下转GmDFR基因烟草(Nicotiana tabacum)的花青素含量、叶绿素含量显著高于野生型(P<0.05);丙二醛及过氧化氢、超氧阴离子含量显著低于野生型(P<0.05);而抗氧化酶(SOD, POD和CAT)活性显著高于野生型(P<0.05),表明转GmDFR烟草具有一定的抵御缺铁胁迫的能力。本研究为GmDFR在大豆抵抗缺铁胁迫及提高抗氧化能力中的应用提供科学依据,也为大豆分子育种提供新的基因资源。

• 大葱4-香豆酸辅酶A连接酶基因Af4CL的克隆及表达分析

  李逸, 徐欢欢, 张宇辰, 王永勤, 刘乐承

  4-香豆辅酶A连接酶(4-coumaric acid coenzyme A ligase, 4CL)是类黄酮合成途径的一个关键酶,催化羟基香豆酸形成香豆酰辅酶A,香豆酰辅酶A是植物类黄酮生物合成的起始底物。本研究以大葱(Allium fistulosum)为材料,克隆了编码大葱4-香豆酸辅酶A连接酶的基因Af4CL (GenBank NO. OP921007),并进行了生物信息学分析,同时对Af4CL基因进行亚细胞定位和原核表达系统分析;结果显示,Af4CL编码区全长1 644 bp,编码547个氨基酸;生物信息学分析表明,Af4CL具有2个保守结构域BoxⅠ和BoxⅡ;进化分析结果表明,大葱Af4CL与大蒜(Allium sativum) As4CL的亲缘关系最近。构建Pro35S：Af4CL-GFP载体,并利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的烟草(Nicotiana tabacum)叶片瞬时表达系统对Af4CL的定位进行了分析表明,Af4CL定位于细胞膜;利用原核表达系统成功诱导出目的蛋白。本研究为大葱类黄酮代谢的深入研究及类黄酮体外合成提供了参考。

• 葡萄LysM类受体激酶基因家族的鉴定及表达分析

  褚明宇, 李婉莹, 左存武, 李文芳, 毛娟, 陈佰鸿

  溶解素基序(lysin motif, LysM)类受体激酶是在植物中发现的一类重要的类受体激酶,在植物抗逆及防御病害等过程中发挥着重要作用。为探究葡萄(Vitis spp.) LysM类受体激酶基因家族成员及其功能,本研究以欧亚种'黑比诺'葡萄(Vitis vinefera cv. Pinot Noir)和东亚种山葡萄(Vitis amurensis)基因组数据为基础,利用生物信息学方法对VvLysM和VaLysM类受体激酶基因家族进行了全基因组鉴定,并对其蛋白质理化性质、二级结构、染色体分布、保守基序、启动子顺式作用元件等特征进行了比较分析,并通过基因芯片数据和qPCR验证了VvLysM在不同组织和非生物胁迫下的表达情况。结果显示,VvLysM和VaLysM类受体激酶家族各包含12个成员,分别分布于'黑比诺'葡萄的9条染色体及山葡萄的7条染色体上,且该基因家族的扩张方式以串联复制和片段复制为主;蛋白质理化性质分析显示,两种葡萄LysM类受体激酶基因家族不同成员间的氨基酸序列、分子量、等电点、脂肪系数等特征均不同,多为不稳定蛋白,蛋白质亲水性系数低,呈疏水性;亚细胞定位预测表明,他们主要分布在细胞质膜上,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;进化分析将24个成员分为3个亚组,同一组内成员外显子-内含子分布特征及保守基序的数量和分布高度相似;内含子数目为0~12呈现多样性;顺式元件预测分析表明,该家族成员启动子序列存在大量光响应元件、激素响应元件和逆境胁迫响应元件。VvLysM基因在葡萄各组织中的表达呈明显的组织表达特异性,特别是在果实和花器官的发育后期表达量较高;qPCR结果显示,该家族不同成员因脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯、低温及壳聚糖胁迫处理方式的差异而呈现不同的表达模式;VvLysM8和VvLysM9分别在壳聚糖处理12 h、脱落酸处理3 h时相对表达量最高,且极显著高于所有处理下的其他成员,推测二者在脱落酸信号转导及几丁质诱导的植物免疫反应中发挥重要作用。本研究为后续葡萄LysM类受体激酶基因功能的研究提供参考。

• 刺葡萄MYB基因家族鉴定及其在不同光质下的表达模式分析

  阙秋霞, 赖恭梯, 潘若, 张静, 贺丽媛, 赖谱富, 王琦, 高慧颖, 陈桂信, 赖呈纯

  MYB转录因子是植物生长发育和次生代谢中重要的调控因子,对花青素的生物合成有重要调控作用。本研究从刺葡萄(Vitis davidii)愈伤组织转录组数据鉴定并克隆出9个VdMYB家族基因,并利用生物信息学方法分析和预测其结构和功能,同时分析其在不同光质诱导下的表达模式。基因序列分析结果显示大部分MYB基因包括3个外显子和2个内含子;蛋白质理化性质分析表明,VdMYBs氨基酸残基数目为216~335个,相对分子量大小为24.09~36.17 kD,等电点为5.42~9.58;进化树分析表明,9个VdMYBs被划分为6个组群,预测分别定位于细胞质、线粒体和细胞核中;启动子顺式作用元件预测发现,9个VdMYB启动子序列中均有大量光响应等多种生物/非生物响应元件。qRT-PCR分析表明,光质显著影响VdMYBs的表达,不同光质作用下,VdMYBs基因响应模式与结构特征相对应;VdMYB31/VdMYBB1和VdMYB4A分别作为正负调控因子参与花青素生物合成。本研究为进一步解析MYB基因通过响应光信号参与调控刺葡萄愈伤组织花青素生物合成的分子机制提供理论参考。

• 茶树冷诱导基因CsMAPK15的克隆与鉴定

  薛承进, 赵兰馨, 赵德刚, 黄小贞

  茶树(Camellia sinensis)是重要的木本经济植物之一,容易遭受低温冻害,严重影响茶叶产量和品质。为了深入探讨茶树低温胁迫响应的分子调控机理,本研究利用前期构建的抗寒性强的'黔茶1号' (Qiancha 1, QC1)和抗寒性弱的'黔湄601' (Qianmei 601, QM601)的低温响应转录组文库,分析了茶树丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)基因家族对冷信号的响应,并从中筛选克隆了1个冷诱导的MAPK基因(转录组文库编号: CSS0027011),命名为CsMAPK15 (GenBank No. ON39909)。CsMAPK15基因开放阅读框包含1 701个碱基,编码566个氨基酸,有1个保守的MAPK结构域。系统发育与蛋白保守基序分析结果表明,CsMAPK15蛋白具有3个保守基序,与拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtMAPK16 (AT5G19010)编码氨基酸相似性为79.17%,与水稻(Oryza sativa) OsMAPK15 (LOC_Os11g17080)编码氨基酸相似性为80.51%。组织器官表达模式分析表明,CsMAPK15在茶树的根组织中表达量最高。启动子序列分析发现,CsMAPK15启动子具有多个顺式作用元件,包括胁迫响应元件(stress-responsive element, STRE)和水杨酸(salicylic acid, SA)响应元件(TCA-element)等。qPCR检测进一步证实CsMAPK15能够响应冷信号和SA信号。利用愈伤转化获得持续表达CsMAPK15的转基因水稻,初步分析结果显示,正常生长条件下,与野生型植株相比,转基因植株的生长发育没有显著改变。本研究为进一步阐明CsMAPK15在植物抗寒性调控中的作用提供了研究材料和理论依据。

• 牦牛GNAQ基因的克隆及其在雌性生殖轴系中的表达

  陈祎玮, 褚敏, 张任政, 谢建鹏, 马兰花, 潘和平, 阎萍

  鸟嘌呤核苷酸结合蛋白q多肽(G protein subunit alpha q, GNAQ)通过编码Gαq蛋白调节G蛋白偶联受体和介导下游信号通路,在营养代谢、繁殖调控以及细胞信号传导等生理过程中参与调节。为研究GNAQ在雌性牦牛(Bos grunniens)生殖轴系中的表达情况,本研究选取成年健康卵泡期雌性牦牛的下丘脑、垂体和卵巢组织,以牦牛卵巢cDNA为模板,采用逆转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)技术克隆得到GNAQ基因完整的CDS序列,并进行生物信息学分析;以qRT-PCR、蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)方法对GNAQ基因和蛋白在牦牛下丘脑-垂体-卵巢生殖轴(hypothalamic-pituitary-ovarian axis, HPOA)的表达进行检测和定位。结果表明,牦牛GNAQ基因(GenBank No. OP811271)的CDS区全长1 080 bp,编码359个氨基酸;牦牛GNAQ基因与普通牛(B. taurus)同源性高,与小鼠(Mus musculus)同源性较低,在物种进化过程中高度保守。经qRT-PCR、Western blot检测发现,GNAQ基因和蛋白在牦牛HPOA轴的下丘脑、垂体以及卵巢中呈现不同程度的表达,在垂体中的表达量最高,在下丘脑中表达水平显著高于卵巢(P<0.05)。免疫组化结果显示,GNAQ蛋白在牦牛卵巢颗粒细胞呈强阳性表达,且主要表达于细胞质中,与亚细胞定位结果一致。本研究为深入探索GNAQ基因在牦牛生殖生理调控中的作用提供理论依据,为牦牛季节性发情调控规律及机制的研究提供参考。

• INHβB、FSHR和LHR在牦牛有腔卵泡中的表达与分布

  王军乾, 赵凌, 潘阳阳, 王萌, 黄振华, 杨贻, 崔燕, 余四九, 王立斌

  抑制素(inhibin, INH)、促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)和促黄体素(luteinizing hormone, LH)对于卵泡发育具有重要影响。本研究通过qPCR和Western blot技术分别检测INHβB、FSH受体(FSH receptor, FSHR)和LH受体(LH recepter, LHR)基因及蛋白在健康牦牛(Bos grunniens)不同直径有腔卵泡中的表达,同时采用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)技术检测三者在牦牛有腔卵泡中的分布。结果显示,INHβB基因和蛋白表达量随着卵泡直径的增大呈先上升后下降的趋势,在大卵泡(直径5~8 mm)中表达量最高(P<0.05);FSHR在大卵泡中的基因和蛋白表达量显著高于其他直径的卵泡(P<0.05),在其他不同直径卵泡中的表达差异不显著;LHR基因和蛋白表达量随着卵泡直径的增大而不断上升,在极大卵泡(直径>8 mm)中表达量最高(P<0.05)。IHC结果显示,INHβB、FSHR和LHR主要分布于卵泡颗粒细胞、卵丘细胞和卵泡膜。上述结果提示,INHβB可能对牦牛卵泡发生、闭锁或排卵有重要影响,FSHR和LHR可能增强FSH和LH对卵泡生长发育的作用。本研究为提高牦牛繁殖效率提供参考依据。

• 湖羊GLP2R基因多态性及其与内脏重量的关联分析

  黄永亮, 王维民, 汪晓娟, 王国秀, 马宗武, 崔盼盼, 张德印, 李冲

  胰高血糖素样肽-2受体(glucagon-like peptide-2 receptor, GLP2R)是调控机体能量平衡的关键分子,可能对绵羊(Ovis aries)器官发育和生长性能具有重要影响。本研究旨在研究湖羊GLP2R基因单核苷酸多态性与屠宰性能以及心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等内脏器官重量的关联性。首先利用qPCR分析GLP2R基因在不同组织中的表达谱,进一步利用竞争性等位基因特异性PCR (kompetitive allele specific PCR, KASP)分型技术对1 351只具有完整系谱的湖羊公羔GLP2R基因位点多态性进行检测,并与羔羊的屠宰性能和内脏器官重量进行关联分析。结果表明：GLP2R基因在湖羊多种组织中广泛表达,且在肾脏和瘤胃组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。在GLP2R基因外显子g.34409249 G>A位点存在3种基因型GG、GA和AA,表现为中度多态(0.25<PIC<0.50),群体中该位点并未处于哈代温伯格平衡状态(P<0.05)。GLP2R基因的单核苷酸多态性与湖羊的心脏、肺脏和肾脏重量关系密切,GG基因型群体心脏、肺脏和肾脏重显著高于AA基因型群体(P<0.05)。综上所述,GLP2R基因在外显子g.34409249 G>A的突变位点可作为心脏、肺脏和肾脏器官发育的候选分子标记位点,为湖羊的选育工作提供了理论支持。

• 稳定表达兔ANXA2的RK13细胞系的建立及其对RHDV吸附研究

  龙翠琴, 武小椿, 岳亚辉, 张宏燕, 张立, 马海云, 邢小勇, 温峰琴, 包世俊

  兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)是兔(Oryctolagus cuniculus)的一种高致死性传染病,其由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起。膜联蛋白A2 (annexin A2, ANXA2)与多种病毒的感染过程密切相关。为探究兔ANXA2在RHDV侵染兔肾细胞(rabbit kidney cell, RK13)过程中的作用,本研究利用PCR扩增获得兔ANXA2基因片段,构建真核表达载体pCD513B-ANXA2,并将其与包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG转染至293T细胞,包装出含ANXA2基因的慢病毒颗粒并感染RK13,利用嘌呤霉素筛选稳定过表达ANXA2蛋白的细胞株RK13-513B-ANXA2;应用qPCR和Western blot检测ANXA2基因及其蛋白的表达情况;设计合成siRNA并转染RK13,进而分析基因表达情况;以RHDV感染RK13-513B-ANXA2细胞株2 h后,采用qPCR、免疫荧光(immunological fluorescence assay, IFA)和Western blot检测RHDV吸附量的相对变化。结果表明,利用慢病毒载体包装获得滴度较高的病毒颗粒,其滴度达5.0×107~1.0×108 TU/mL;RK13-513B-ANXA2细胞中ANXA2基因及其蛋白表达量均极显著增加(P<0.01);过表达ANXA2蛋白的RK13对RHDV的吸附作用明显增加(P<0.01),干扰ANXA2蛋白表达可显著下调RHDV对RK13的吸附作用(P<0.05)。本研究结果提示ANXA2可能参与RHDV对宿主细胞的感染,为进一步探究RHDV感染宿主细胞的机制提供了参考。

• 鸡VVD候选基因ST3GAL4甲基化水平与ALP活性和基因表达的关系

  马岩超, 李建增, 张露洁, 蔡春霞, 蒋瑞瑞, 张彦华, 田亚东, 韩露, 吉进卿, 韩瑞丽

  肢体内外翻畸形(valgus-varus deformity, VVD)是肉鸡(Gallus gallus)养殖业中最常见的腿病。为了探究VVD相关基因ST3 β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4 (ST3 β-galactoside α-2,3-sialyltransferase 4, ST3GAL4)启动子区甲基化水平与血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和基因表达的关系,选用VVD和正常肉鸡检测其血清ALP活性,采用qPCR技术检测ST3GAL4基因在不同组织中的差异表达,筛选差异表达组织,进一步利用亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR, BSP)检测ST3GAL4基因在血液和差异表达组织中的甲基化水平。结果表明,VVD组ALP活性显著低于正常组(P<0.05),腿肌ST3GAL4基因的表达量显著高于正常组(P<0.05)。甲基化水平检测结果表明：在血液中,VVD组ST3GAL4启动子区总体甲基化水平高于正常组(P=0.051),CpG25甲基化差异显著(P<0.05);在腿肌组织中,VVD组ST3GAL4启动子区总体甲基化水平极显著低于正常组(P<0.01),CpG11、CpG14、CpG15甲基化差异达到显著水平(P<0.05)。ST3GAL4启动子区转录因子预测结果显示：关键位点CpG15可能与转录因子CRE结合蛋白1 (cAMP response element binding protein 1, CRE-BP1)、cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)和细胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白(cytoplasmic polyadenylation element binding protein, CPE bind)相结合,关键位点CpG25可能与转录因子特异蛋白1 (specificity protein 1, Sp1)和激活蛋白-2α (activator proein-2α, AP-2α)相结合。相关性分析结果表明,血液ST3GAL4启动子区关键位点CpG25甲基化水平和血清ALP活性呈负相关,腿肌组织ST3GAL4启动子区关键位点CpG15甲基化水平和基因表达量也呈负相关。本研究揭示了VVD肉鸡ST3GAL4基因启动子区甲基化水平与血清ALP活性、基因表达水平存在一定联系,为肉鸡抗病育种工作提供参考数据。

• 小管福寿螺HSF和HSP基因家族鉴定及其在温度胁迫下的表达模式

  曹梦宇, 范月圆, 尹传林, 俞晓平

  小管福寿螺(Pomacea canalicata)是全球性入侵生物,对环境胁迫的耐受力强,目前已经入侵并扩散到我国16个省市和地区。热激蛋白(heat shock protein, HSP)是生物体响应环境胁迫而产生的一类重要的分子伴侣蛋白,环境因子刺激能诱导其表达以应对机体产生的不良影响,而热激因子(heat shock factor, HSF)是调节热激蛋白基因转录的关键因子。为了探讨HSF和HSP基因在福寿螺温度耐受性调节中的作用,本研究利用生物信息学方法,从小管福寿螺及其同属的斑点福寿螺(P. maculata)、或同科大羊角螺(Lanistes nyassanus)和非洲螺(Marisa cornuarietis)中各鉴定出1个HSF1基因,分别鉴定出63、66、67和64个HSP基因。其中,HSF1基因在4种螺中氨基酸长度和基因结构类似,基因分化较低;HSP基因家族成员数量在4种螺基因组中差异不明显,但是亚家族组成差异较大,其中HSP90基因在4种螺中比较保守,HSP20基因变化较大,HSP40基因在家族中成员最多。针对小管福寿螺不同温度胁迫下的鳃、足肌、肝和卵巢4个组织的转录组数据进行分析,结果显示,HSF1基因在4种组织中表达量从高到低依次是鳃、足肌、肝和卵巢,在高温胁迫下(40 ℃)不同组织中均高表达,在足肌和肝组织中表达模式较为一致。HSP基因表达热图显示有17个HSP基因在高温胁迫下在4个组织中均出现特异性高表达,其中12个基因与qPCR结果一致。本研究为深入解析小管福寿螺HSF和HSP基因参与其温度耐受的分子机制提供了基础资料。

• 用于灰茭鉴别的菰黑粉菌SNP位点挖掘及验证

  吴骏成, 葛鑫涛, 杨梦飞, 叶子弘, 夏文强, 汤近天, 俞晓平, 张尚法, 张雅芬

  茭白作为我国重要的水生蔬菜,田间近20%的灰茭比例对其产量造成了严重影响。研究表明,田间正常茭和灰茭两种表型的产生与菰黑粉菌(Ustilago esculenta)菌株分化密切相关,由T型菰黑粉菌侵染菰(Zizania latifolia)所致。由此,本研究通过重测序技术,经SNP calling和SNP的过滤获得在MT型和T型菰黑粉菌中具有差异性的129 494个SNP位点后,通过哈德-温伯格平衡检测和短片段筛除策略,得到了具有T型菰黑粉菌特异性的SNP位点647个。最后采用随机化原则挑选48个位点,设计特异性引物并用等位基因特异性PCR (allele specific PCR, AS-PCR)鉴定筛选出了其中准确率高的8个位点用于田间测试。结果表明,采用8个特异性位点组合分析茭白种苗的T型菰黑粉菌并剔除灰茭鉴别结果阳性的种苗,可将灰茭比例降低37.59%。此研究为进一步提高良种繁育中种苗纯度及后续种苗质量检测提供了技术支持。

• 猪脂肪沉积和脂肪酸组成营养调控及相关机制研究进展

  蒋苏苏, 张国华, 卢建雄

  体脂含量和分布是决定猪(Sus scrofa)经济性状的主要因素之一。皮下脂肪影响胴体品质,肌内脂肪(intramuscular fat, IMF)与猪肉嫩度、多汁性和风味等肉质性状密切相关。皮下脂肪与肌内脂肪形成遗传相关,因此,通过营养途径在保持或降低背膘厚的同时,改善肌内脂肪含量和脂肪酸组成,提高猪肉感官品质和营养价值,受到人们的广泛关注。本文就日粮能量和蛋白质水平、氨基酸、多不饱和脂肪酸等对猪皮下和肌内脂肪沉积和脂肪酸组成的影响及其差异调控的机制进行综述,为采取营养措施改善猪肉品质提供参考。

• 畜禽微生物-肠-脑轴调节机制研究进展

  耿丹丹, 李潇凡, 毕瑜林, 江勇, 王志秀, 常国斌, 陈国宏, 白皓

  微生物-肠-脑轴(microbiota-gut-brain axis, MGBA)是动物机体最主要的生理代谢调节机制之一。肠道菌群在肠道与大脑通过神经和内分泌等物质介导的双向应答系统中发挥着关键作用。目前,MGBA在畜禽营养代谢方面的研究已有不少报道,但在畜禽生产应用和功能性疾病方面研究较少。本文从微生物及其代谢物与宿主肠道、神经内分泌系统、免疫系统之间的联系入手,综述了畜禽MGBA调节机制的研究进展,以期为畜禽MGBA的研究应用提供新思路,达到科学高效养殖的目的,从而提高畜禽经济效益与动物福利,促进畜禽养殖业高效健康发展。

• CRISPR/Cas9介导敲除小鼠胚胎成纤维细胞IGF-1R基因的方法建立与验证

  于志勇, 刘萌萌, 姚枭洋, 胡学远, 接金磊, 迟良, 刘焕奇

  胰岛素样因子1型受体(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)基因在哺乳动物的生长发育和代谢中发挥着重要作用。本研究通过Gibson无缝链接(Gibson assembly)和重叠延伸PCR (genes plicing by overlap extension PCR, SOE PCR),利用pSMART LCKan载体将向导RNA (small guide RNA, sgRNA)插入lentiCRISPR v2质粒进行改造,构建IGF-1R基因敲除载体,通过菌液PCR、双酶切、基因测序对敲除载体进行评估;将该载体转染至小鼠(Mus musculus)胚胎成纤维细胞中,通过Western blot比较敲除组和对照组细胞IGF-1R蛋白表达量。结果表明,IGF-1R基因敲除载体构建成功;敲除组细胞IGF-1R蛋白表达量极显著降低(P<0.01),表明成功敲除了小鼠胚胎成纤维细胞中IGF-1R基因。本研究改进了CRISPR/Cas9敲除系统表达载体的构建过程,为进一步在细胞层次研究IGF-1R基因的作用机制提供有力工具。

• 双向启动子探针载体的构建及其在谷氨酸棒杆菌中的应用

  曹煜, 余心宇, 刘秀霞, 白仲虎

  双向启动子(bidirectional promoters, BDPs)为自然界常见表达元件之一,能够为遗传电路设计、代谢途径组装和优化提供新工具,但目前缺乏针对BDPs的高通量筛选手段。为了高通量筛选性能优越的BDPs,用于代谢工程中的多基因调控,本研究构建了一种BDPs活性探针载体p19BDP。该探针基于绿色荧光瞬时表征蛋白传感器蛋白1 (green fluorescent sensor for transiently expressed proteins 1, gSTEP1)和瞬时表征蛋白传感器蛋白质标签(sensor for transiently expressed proteins tag, STEPtag)相互作用后会产生荧光的原理,以“头对头”的方式将gSTEP1基因与STEPtag基因连入p19-0质粒(删除tac启动子的pXMJ19质粒改造获得)获得探针载体,在两个基因中间插入BDPs序列后,通过检测荧光信号初步表征BDPs活性。通过转录组数据分析筛选出了8个谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的BDPs,利用探针载体p19BDP对其活性进行表征,其中两个诱导型启动子BDPcat和BDPicl的荧光值较诱导前分别提高了15.9倍和6.2倍,且在一定范围内荧光强度与诱导剂浓度呈正相关;其他6个内源BDPs (BDP1~BDP6)中,BDP6的荧光强度是对照启动子BDPcat (未诱导)的6.8倍。该探针载体不影响菌体生长,且gSTEP1/STEPtag复合物形成后其荧光值保持稳定。以上结果表明,探针载体p19BDP能够灵敏、有效地表征谷氨酸棒杆菌中BDPs强度。本研究为谷氨酸棒杆菌高通量挖掘天然BDPs提供了有效工具,同时为原核生物中BDPs筛选提供了新的思路。

• 细极链格孢菌单克隆抗体的制备和胶体碳免疫层析试纸条的研制及应用

  金怡美, 潘心怡, 袁淑贤, 赵伟春

  细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)是引起浙贝母(Fritillaria thunbergii)黑斑病的病原真菌之一。为解决当前浙贝母黑斑病无法实现田间快速检测的问题,本研究制备了针对细极链格孢菌的单克隆抗体(单抗)(monoclonal antibody, McAb)及其胶体碳免疫层析试纸条。利用细极链格孢菌菌丝和孢子混合液作为免疫原,通过杂交瘤技术获取能分泌针对细极链格孢菌的特异性单抗的细胞株,采用间接ELISA法测定单抗的效价、灵敏度和特异性,再采用Western blot检测抗体结合蛋白,利用双抗夹心法制备胶体碳免疫层析试纸条。最终获得了5株细胞株,分别命名为AtA1、AtA8、AtD2、AtG7和AtH9。由细胞株分泌的5种单抗与交链格孢(A. alternata)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、变红镰刀菌(F. incarnatum)、木贼镰刀菌(F. equiseti)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、Phomopsis oblonga和茎点霉属真菌(Phoma sp.)等浙贝母常见病原真菌均不发生交叉反应。5种单抗的效价均高于105倍,分别与细极链格孢菌30、30、43、148和50 kD的抗原蛋白结合,抗体类型分别为IgG2a、IgG3、IgM、IgG2a和IgM,其中AtA1、AtA8和AtG7的检测灵敏度均为12.21 ng/mL,AtD2和AtH9的检测灵敏度均为24.41 ng/mL。浙贝母蛋白提取液对5种单抗的检测灵敏度均无影响。基于单抗AtA1和AtH9的胶体碳免疫层析试纸条可用于细极链格孢菌及其引发的浙贝母黑斑病的检测。该试纸条具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速经济和适于田间大量检测等优势,为浙贝母黑班病的早发现、早防治提供了技术支撑。