农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2019年第1期

• PH-START1调控拟南芥种子发育的功能分析

  冯佳佳, 孙丹丹, 王倩, 高梦烛, 张昊, 王凤茹, 董金皋

  种子发育直接关系到作物的产量和品质，虽然文献已报道了多个可调控种子发育的基因，但种子发育的分子机制还未建成完整的调控网络。为鉴定调控种子发育的主效基因、完善种子发育调控网络，本研究在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中筛选到可调控种子发育的基因PH-START1 (pleckstrin homolgy-the lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains 1)，在拟南芥中过表达PH-START1可使结实率降低61.7%、籽粒重下降80%，说明PH-START1是调控种子发育的主效基因。本研究创制了PH-START1的功能获得和缺失的转基因拟南芥植株，通过对转基因植株角果发育及结实率、千粒重分析，确定了其在调控种子发育中的功能；通过解剖镜下对种子胚和胚乳发育的观察，明确目的基因调控种子发育的具体过程；通过对目的基因的表达量和组织定位分析，明确其表达模式。结果发现，野生型种子排列整齐紧密，果荚饱满；PH-START1的T-DNA插入突变体PH-START1的种子排列整齐，占据着角果的整个内部空间，单个角果可结55粒种子，结实率为对照的117%；但过表达PH-START1转基因拟南芥OE-1的种子排列稀疏散乱，其单个角果只有18粒种子，结实率仅为对照的38.30%。进一步分析发现，PH-START1还影响种子的结构，过表达PH-START1后的种子胚乳细胞明显减少，糊粉层细胞排列散乱，胚发育受阻。对PH-START1的表达模式分析表明，PH-START1在种子中表达量最多，在花的雌蕊中，随着发育时间的延长主要分布在花柱的基部和顶部；在雄蕊中，随着发育时间的延长花丝和花药中的表达量增加，最后主要集中在花药的花粉粒中表达。本研究鉴定到调控种子发育的主效基因PH-START1，明确了其影响种子发育的具体过程及其表达模式，为完善种子发育调控分子网络和为现代分子育种提供了理论依据。

• CRISPR/Cas9介导hFAD3基因在牛NCAPG-LCORL位点的定点整合

  广璐, 张英, 郭晶, 白春玲, 魏著英, 于超然, 扈廷茂, 李光鹏

  亚麻(Linum usitatissimum)脂肪酸去饱和酶基因3(fatty acid desaturase 3, FAD3)是一种脂肪酸脱氢酶基因,编码ω-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)脱氢酶,能够将ω-6 PUFAs转化成ω-3 PUFAs。本研究利用CRISPR/Cas9介导,将无抗性、无标记的人(Homo sapiens)源化hFAD3基因表达载体C2(5'同源臂-CAG-hFAD3-PolyA-3'同源臂)和M2(5'同源臂-MAR-CAG-hFAD3-PolyA-MAR-3'同源臂)定点敲入牛(Bos taurus)胎儿成纤维细胞NCAPG-LCORL位点。运用气质联用仪对脂肪酸含量进行分析,结果表明hFAD3转基因细胞中ω-6/ω-3 PUFAs比值(0.565)较非转基因细胞(1.549)显著下降(P<0.01)。qRT-PCR结果表明hFAD3基因整合并表达后,脂肪分解相关的过氧化物酶体增殖物激活受体基因(peroxisome proliferator activated receptor1, PPARg)、激素敏感脂肪酶基因(hormone-sensitive lipase, LIPE)和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)表达总量上调倍数大于脂肪合成相关的乙酰辅酶A羧化酶基因(acetyl CoA carboxylase, ACC)、硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(stearoyl CoA desaturase, SCD)和脂肪酸合酶基因(fatty acid synthase, FASN)表达总量,说明hFAD3基因的表达使得细胞内的脂肪趋于分解。通过流式分选获得59株C2打靶载体单克隆细胞株,PCR鉴定及测序结果表明,其中定点整合阳性单克隆细胞3株,定点整合效率为5.1%。同时检测定点整合阳性单克隆细胞株中脂肪酸的含量以及脂肪相关基因的表达量,结果与转染后细胞一致。比较有无核基质结合区(matrix attachment region, MAR)序列介导两种转基因细胞中hFAD3基因的表达量,结果显示,MAR介导组是无MAR组的5.91倍(P<0.01)。本研究利用CRISPR/Cas9介导可实现hFAD3基因在牛NCAPG-LCORL位点的定点整合以及在细胞水平正常行使其生物学功能,同时MAR的介导可显著提高外源基因的表达量,为安全高效生产转基因动物提供科学依据。

• 结球甘蓝BoTCTP基因表达载体的构建及转化芥蓝的研究

  王静静 , 曹必好, 陈国菊, 陈长明 , 陈清华 , 雷建军

  芥蓝(Brassica alboglabra)是十字花科重要蔬菜之一，在栽培过程中常常会遭受各种逆境的严重影响，给芥蓝的生产造成很大的损失。为提高芥蓝对逆境胁迫的抵抗能力，本研究根据结球甘蓝翻译控制肿瘤蛋白基因(translationally controlled tumor protein cloned from Brassica oleracea, BoTCTP)序列设计特异引物，经PCR扩增得到目的片段，然后构建过表达载体，利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法导入芥蓝中，并对其转基因植株进行了分子生物学鉴定。研究结果显示，4株外源目的基因已经整合到受体基因组中，1株以双拷贝形式存在，另外3株以单拷贝形式存在。转基因植株的长势旺盛，生长速率加快，叶面积较大，在逆境胁迫(高低温, 盐碱, 干旱, 重金属等)下转基因植株对胁迫的耐受性明显优于对照植株，从而表明BoTCTP基因与芥蓝的生长密切相关，并对芥蓝的抗逆性起调控作用。本研究结果为芥蓝抗逆性的进一步研究提供了科学依据。

• 杉木木材形成功能基因内SSR标记的开发及应用

  杭芸, 俞金健, 周世水, 程健弘, 黄华宏, 林二培, 童再康

  开发一套基于杉木(Cunninghamia lanceolata)木材形成相关功能基因的SSR标记,可为后续木材材质性状的分子标记辅助育种提供重要工具。本研究对参与杉木木材形成的10个基因序列进行SSR位点和引物设计,应用毛细管电泳检测引物的有效性和多态性,使用TAASEL(trait analysis by association, evolution and linkage)软件进行SSR位点组合间连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)及其与木材密度的关联分析。在与木材形成相关的7个功能基因中共检测到15个SSR位点。碱基重复形式有二碱基、三碱基、四碱基与六碱基,其中三碱基重复位点所占比例为46.7%。依据SSR位点两侧的保守序列设计了14对PCR扩增引物,其中有7对引物的扩增结果呈现多态性。结合已有的表达序列标签(expressed sequence tag, EST)-SSR数据进行LD分析,检测到644个SSR位点组合皆存在一定程度的LD(D' ≠ 0),其中D'值大于0.5的组合有183个。关联分析发现来自杉木纤维素合成酶基因(C. lanceolata cellulose synthase 3, ClCesA3) 5'非翻译区 (5' untranslated region, 5' UTR)的CLSSR4位点与杉木木材密度极显著关联(P<0.01),该位点对性状变异的解释率为26.07%,且相应等位变异A201和A205对木材密度分别表现为增效和减效效应。本研究共设计筛选出了7对功能基因SSR多态性引物,其中来源于ClCesA3基因5' UTR的SSR位点与杉木木材密度显著关联,为分子标记辅助杉木木材性状改良提供了重要的标记和途径。

• 毛竹B3家族全基因组鉴定及表达模式分析

  吴佳军, 俞率成, 刘志刚, 傅鹰, 周明兵

  B3家族是一类含有B3功能域的转录因子家族,在植物的生长发育过程中起重要的调控作用。本研究利用生物信息学的技术和手段共鉴定出78条毛竹(Phyllostachys edulis) B3家族基因,其在LAV(LEAFY COTYLE-DON2[LEC2]-ABSCISIC ACID INSENSITIVE3[ABI3]-VAL)、生长素应答因子(auxin response factor, ARF)、RAV(Related ABI3-VP1)和生殖分生组织(reproduction meristem, REM) 4个亚家族中均有分布。通过对毛竹7个组织材料的转录本进行分析发现78条毛竹B3家族基因表达模式可分为5类,第1类的15个基因主要在花序中大量表达,第2类的20个基因主要在根中大量表达,第3类的23个基因主要在笋中大量表达,第4类的7个基因主要在叶中大量表达,第5类的13个基因主要在竹鞭中大量表达。在4个亚家族中,每个家族挑取2个基因,通过qRT-PCR分析毛竹B3家族基因在毛竹笋中不同部位的表达模式,结果显示,在大多数节间组织中大多数B3家族成员都有较高的表达量;在节隔,只有2个基因有高水平表达;在笋箨中,有6个基因有高水平表达,其中有1个基因几乎不表达;在根中,只有1个基因有高水平的表达。本研究对毛竹B3家族全基因组进行了结构的鉴定、进化关系的研究和表达模式的分析,为毛竹B3家族基因功能的深入研究提供了良好的数据基础。

• 基于RAD-seq技术开发灵宝杜鹃多态性SSR标记

  周晓君, 王海亮, 李方玲, 张凯, 王俞娜, 押辉远

  灵宝杜鹃(Rhododendron henanense subsp. lingbaoense)隶属杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃属,是河南特有物种,因分布范围狭窄、自然更新能力差等原因,种群规模日益缩小,对其进行系统研究与保护日益迫切。为开发用于灵宝杜鹃保护遗传学研究的简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)分子标记,本研究采用RAD-seq (restriction-site associated DNA sequencing)技术对灵宝杜鹃进行简化基因组测序,并进行SSR搜索与引物设计。在组装的120 970个基因序列中共检测到6 107个SSR位点,二核苷酸基序类型所占比例最高,数量为3 848个,占位点总数的63.01%;其次是三核苷酸,有765个,占位点总数的12.53%。利用Primer Premier 3.0软件对这些SSR位点成功设计出3 843对引物。随机选取合成100对引物,在20个灵宝杜鹃个体中进行验证,有87对可扩增出目的条带。利用Cervus 3.0软件,对挑选出的15对多态性较好的SSR位点进行分析,多态位点信息含量介于0.463~0.893之间,平均值为0.649;其中,高度多态位点有13个,未检测出哈迪-温伯格平衡偏离的位点有15个。本研究为开展基于灵宝杜鹃及杜鹃属植物SSR分子标记的相关研究提供了数据支持。

• AMF摩西球囊霉调控IAA代谢促进烟草生长

  赵方贵, 董志昊, 车永梅, 卢松冲, 张文, 刘新

  生长素(auxin)吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)作为调节植物生长发育的重要植物激素,参与丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizae fungi, AMF)与植物根系的共生过程。为探究AMF摩西球囊霉(Glomous mosseae, G.m)与植物共生过程中IAA作用的调控机制,本研究以烟草(Nicotiana tabacum)为材料,通过接种摩西球囊霉,检测摩西球囊霉与烟草共生后烟草的株高和叶面积、叶片IAA含量,以及与IAA代谢相关酶的活性和相关基因的表达量。结果表明,接种摩西球囊霉的烟草,其株高和叶面积显著高于对照组(P<0.05);烟草叶片中IAA含量增加,过氧化物酶(peroxidase, POD)和吲哚乙酸氧化酶(indole-3-acetic acid oxidase, IAAO)活性下降;同时,上调生长素合成关键酶烟草吲哚-3-乙酰胺水解酶(N. tabacum indole-3- acetamide hydrolase)基因NtAMI1、烟草生长素响应因子(N. tabacum auxin response factor)基因NtARF1和烟草生长素转录调控因子(N. tabacum Aux/IAA 9)基因NtIAA9的表达,下调烟草生长素抑制蛋白(N. tabacum auxin-repressed protein)基因NtARP1;1的表达。该研究结果为深入研究AMF促进生长的机制提供科学依据。

• 牦牛Lkb1基因编码区克隆及其在骨骼肌的表达分析

  雷召雄, 柏雪, 林亚秋, 李键, 字向东, 熊显荣, 熊燕

  研究表明肝激酶b1(liver kinase b1, Lkb1)在小鼠(Mus musculus)骨骼肌发育与机体能量代谢调控中发挥重要作用。牦牛(Bos grunniens)作为青藏高原及毗邻地区的特有家畜,其骨骼肌的生长发育是影响产肉性能的主要因素之一。为研究Lkb1在牦牛骨骼肌生长发育及能量代谢中的潜在生物学功能,本研究以金川牦牛背最长肌cDNA为模板,采用PCR技术克隆Lkb1基因的CDS序列,并通过生物信息学方法,预测牦牛Lkb1氨基酸序列的理化性质、分析其在物种间的保守性;最后利用qRT-PCR技术检测Lkb1基因在成年金川牦牛不同组织中的表达模式,并且分析Lkb1基因在同龄不同品种牦牛骨骼肌的表达差异。研究结果显示,牦牛Lkb1基因的CDS序列全长为1 317 bp (GenBank登录号: MH412713),编码438个氨基酸。预测Lkb1蛋白为具有核质穿梭、发生磷酸化/去磷酸化的亲水性蛋白,可能参与调节机体能量和脂肪酸代谢。物种的保守性分析发现牦牛Lkb1基因与绵羊(Ovis aries)和山羊(Capra hircus)的同源性最高,经核苷酸和氨基酸序列比对同源性均高达97.50%和99.54%;而与小鼠核苷酸和氨基酸序列的同源性仅为45.48%和44.19%。基因表达分析显示,Lkb1基因在成年金川牦牛的骨骼肌中具有较高的表达量,在脂肪和肝脏组织中的表达量相对较低。在不同品种中,金川牦牛半腱肌Lkb1表达量显著高于麦洼牦牛(P<0.05),由此推测,Lkb1基因可能与牦牛骨骼肌的生长和能量代谢相关。该研究结果为进一步揭示Lkb1的功能和调控机制提供参考资料。

• 不同产羔数小尾寒羊BMP4基因表达及其错义突变与产羔数关联分析

  文禹粱, 王翔宇, 郭晓飞, 贺小云, 赵生国, 储明星

  骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)/Smad家族蛋白(Smad family member, SMAD)信号通路在调节哺乳动物细胞增殖和分化等方面具有重要作用。为了探讨BMP及其所在BMP/Smad信号通路与小尾寒羊(Ovis aries)产羔数之间的关系,本研究利用qRT-PCR技术,检测了BMP4基因及BMP/Smad信号通路下游关键基因SMAD4在单羔组和多羔组卵泡期小尾寒羊14种组织中表达量的变化;同时,对于本课题组前期重测序中筛选得到的BMP4基因编码区错义突变单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点g.63454744T>G,利用Sequenom MassARRAY® SNP分析技术在380只小尾寒羊中进行分型,再将分型结果与小尾寒羊产羔数进行关联分析。qRT-PCR结果显示,BMP4和SMAD4在卵泡期各组织均有表达,其中BMP4在脾脏、肝脏、心脏和子宫中高表达,SMAD4在小脑、下丘脑、垂体和卵巢中高表达;BMP4在多羔组子宫(P<0.001)、下丘脑(P=0.002)、垂体(P=0.001)和卵巢(P<0.001)的表达量都极显著高于单羔组;SMAD4在多羔组下丘脑(P<0.001)、小脑(P=0.001)、卵巢(P<0.001)、垂体(P=0.001)、大脑(P=0.001)、子宫(P=0.007)和输卵管(P=0.005)的表达量均极显著高于单羔组。SNP分型结果显示,BMP4基因g.63454744T>G位点在小尾寒羊中表现为低度多态(多态信息含量<0.25),并处于哈迪-温伯格平衡状态(P>0.05)。关联分析表明,BMP4基因g.63454744T>G位点多态性与小尾寒羊各胎产羔数均显著相关(P<0.05),且突变纯合型的产羔数都高于野生纯合型和杂合型。上述研究结果提示BMP4和SMAD4基因的高表达与卵泡期小尾寒羊产羔数增加存在一定程度的正相关,且BMP4基因g.63454744T>G位点与小尾寒羊产羔数显著关联。本研究为小尾寒羊产羔性状选育提供了参考依据。

• 不同发育阶段小尾寒羊皮肤毛囊特异性miRNA的鉴定

  何玉龙, 陶宇, 李勇, 杨易, 周学章, 吴月红

  小尾寒羊(Ovis aries)是我国优良的肉裘兼用型绵羊品种,因其生长速度快、产羔率高而闻名。microRNA (miRNA)是参与转录后表达水平调节的重要因子,可参与调控多种动物的皮肤和毛囊的发育。为了阐明miRNAs在小尾寒羊皮肤毛囊发育过程中的调控作用,本研究利用高通量测序技术分析了成年(XWHY_1)、出生30 d (XWHY_2)、刚出生(XWHY_3)等3个时期小尾寒羊皮肤毛囊组织的miRNAs表达谱,在3个不同发育时期共鉴定出1 062个miRNAs,包括已知miRNAs 160个,新发现miRNAs 902个。对鉴定出的miRNAs进行统计分析,在XYHY_1、XYHY_2和XYHY_3中特异性表达的miRNAs数目分别为69、127和73个,而在3个时期共表达的miRNAs为666个。统计分析采用费舍尔精确检验(Fisher exact test)和卡方检验(Chi-square test),对同时满足|log2 (Fold_Change, FC)|≥1且P≤0.05的差异表达miRNAs进行统计,经XWHY_1、XWHY_2、XWHY_3两两比较筛选出339个差异表达miRNAs,去重复后得到226个差异表达miRNAs;进一步进行靶基因预测,得到2 645个靶基因。对差异表达miRNAs进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路(Pathway)富集,2 645个靶基因注释到181个信号通路;对差异表达miRNAs进行基因本体(gene ontology, GO)富集分析,主要包括转录调控、细胞膜组成和离子结合等过程。本研究为在miRNA水平解析皮毛/绒性状形成的分子机理提供了基础资料,同时为保持小尾寒羊现有优良品质的同时通过人工调控手段提高毛/绒产量及品质提供了新的思路。

• 实验用SPF大白猪和长白猪母系遗传结构分析

  辛畅, 高彩霞, 权金强, 马璐璐, 陈洪岩

  无特定病原体(specific pathogen free, SPF)大白猪(Sus scrofa)和长白猪作为重要的实验动物,其遗传学质量控制研究十分必要。为分析实验用SPF大白猪、长白猪的线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)控制区(displacement-loop region, D-loop区)遗传多样性,揭示其母系遗传结构,本研究提取SPF大白猪和长白猪基因组DNA,同时以我国地方品种巴马小型猪和融水小型猪为对照,应用PCR技术扩增其mtDNA D-loop区,进行测序比对。结果显示,107个样本中共检测到40个多态位点,分为13个单倍型,与地方品种相比,大白猪和长白猪单倍型数较少,分别含有3种和2种特有单倍型,只有1个共享单倍型H4。两猪群中各存在1个优势单倍型。单倍型多样度(Hd)分析,融水小型猪单倍型多样度最高(0.767),长白猪最低(0.429),大白猪和巴马小型猪分别为0.566和0.503。此外,中介网络关系图和系统进化树发现大白猪和长白猪与欧洲猪种亲缘关系较近。本研究表明实验用SPF大白猪和长白猪种群的单倍型数较少,各存在1个优势单倍型,遗传多样性低,具有清晰的母系遗传结构。研究结果有利于进一步的实验动物标准化以及遗传质量控制研究。

• KDM6A表达载体的构建及其对组蛋白H3K27me3修饰的影响

  白力格, 赵彩权, 宋丽爽, 刘雪霏, 杨磊, 李光鹏

  组蛋白甲基化是一种重要的表观修饰方式,主要参与异染色质的形成、X染色体的失活以及RNA的转录调控。其中组蛋白H3第27位赖氨酸去甲基化酶KDM6A (lysine specific demethylase 6A)具有调控胚胎发育、细胞重编程和细胞分化的功能。目前对KDM6A的研究主要集中在体外非细胞环境下的生化实验,在细胞内的研究较少,并且未见KDM6A过表达的动物模型。本研究通过基因工程手段构建了KDM6A的表达载体pCS2-KDM6A,并将其转染小鼠(Mus musculus)胎儿成纤维细胞。经qRT-PCR检测发现,转染组KDM6A的表达量显著高于对照组(P<0.05);免疫荧光和免疫印迹检测表明,过表达KDM6A可以显著降低H3K27me3的修饰(P<0.05)。本研究成功构建了pCS2-KDM6A载体,此载体为下一步制备动物模型提供了理论基础,对解析KDM6A与H3K27me3在X染色体失活、胚胎发育、细胞重编程等生物学事件的研究机理提供了基础材料。

• miR-33靶向调控鸡CHPT1基因表达

  邵芳, 王星果, 郁建锋, 李辉, 顾志良

  miR-33在脂类代谢过程中具有重要作用,同时还参与葡萄糖代谢、炎症反应以及细胞周期等多种生理过程。目前对于鸡(Gallus gallus) miR-33的功能及其与预测靶基因—胆碱磷酸转移酶1基因(choline phosphotransferase 1, CHPT1)的作用关系尚不明确。本研究旨在对鸡miR-33预测靶基因CHPT1进行实验验证,探讨鸡miR-33对CHPT1的靶向调控作用。首先利用生物信息学方法,在鸡3'-UTR数据库中共预测到378个miR-33的靶基因,包括与脂类代谢相关的CHPT1基因;然后构建miR-33过表达载体和CHPT1荧光素酶报告载体,共转染小鼠(Mus musculus)成肌细胞系C2C12,结果显示,miR-33的种子区与CHPT1预测靶位点结合,CHPT1基因表达因此被抑制;点突变实验证实了miR-33与CHPT1结合的靶位点。设计并合成miR-33拮抗物LNA (locked nucleic acid)-antimiR-33,转染鸡原代肝细胞后使miR-33表达水平下降44%,而CHPT1基因表达量有一定程度上升。利用qRT-PCR技术对miR-33的表达进行分析,结果显示,miR-33在鸡不同组织中均有表达,在肌胃和心脏中的表达量较高,在其他组织中等表达;miR-33在肌胃中的表达量与脾脏、肾脏、脑和腺胃中的表达量差异显著(P<0.05),与肝脏和腿肌中的表达量差异极显著(P<0.01);miR-33在4周龄高脂肉鸡肝脏和腹脂组织中的表达量显著高于低脂肉鸡(P<0.05);靶基因CHPT1在高脂肉鸡腹脂组织中的表达量显著高于低脂肉鸡(P<0.05)。上述实验结果提示,miR-33与鸡脂类代谢和脂肪沉积相关,CHPT1基因是其潜在的靶基因。本研究为揭示鸡脂类代谢调控机理提供了新的线索。

• 四种正交子一代奥尼罗非鱼耐链球菌病能力差异研究

  祝璟琳, 邹芝英, 李大宇, 肖炜, 杨弘, 薛良义

  链球菌病是我国罗非鱼(Oreochromis spp.)产业的重大病害,迄今为止尚无有效防治办法,提高鱼体内在抗病力,进行品种改良是解决该病害的重要途径。本研究以尼罗罗非鱼(O. niloticus)埃及品系(Egypt strain, NE) ♀、尼罗罗非鱼湘湖品系(Xianghu strain, NX) ♀、奥利亚罗非鱼(O. aureus)“夏奥1号”(Xia'ao strain, AX) ♂和奥利亚罗非鱼埃及品系(Egypt strain, AE) ♂为亲本进行正交配组,获得NE ♀×AX ♂ (EX)、NX ♀×AX ♂ (XX)、NX ♀×AE ♂ (XE)和NE ♀×AE ♂ (EE)4种杂交组合。4种杂交子一代奥尼罗非鱼加强培育100 d后,进行无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)人工感染实验,通过感染后的相对存活率和血液生化指标变化的比较来评价其耐链球菌病能力。结果显示：感染后7 d的相对存活率EX奥尼罗非鱼(50%)>EE奥尼罗非鱼(37.5%)>XE奥尼罗非鱼(33.3%)>XX奥尼罗非鱼(20.8%);4种奥尼鱼中只有EX奥尼罗非鱼的丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)感染前后没有显著性变化(P>0.05);4种奥尼罗非鱼K+、Na+、C1-和Ca2+等电解质离子的含量感染后都发生显著性变化(P<0.05),但EX奥尼罗非鱼的Na+含量、Ca2+含量和Cl-含量在感染后3 d恢复到感染前水平;4种奥尼罗非鱼的球蛋白(globulin, GLO)在感染后3 d显著上升(P<0.05),并在感染后7 d达到峰值,此时ALB/GLO都显著降低(P<0.05);4种奥尼罗非鱼的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)在感染后显著增高(P<0.05),感染后的峰值分别为感染前的1.81倍、6.1倍、2.42倍和3.77倍;感染前EE奥尼罗非鱼的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)显著低于其余3种奥尼罗非鱼的SOD,而感染后1 d和7 d EX奥尼罗非鱼的SOD最低;4种奥尼罗非鱼的甘油三酯(triglyceride, TG)都在感染后3 d显著下降(P<0.05),EX、XX和XE奥尼罗非鱼的总胆固醇(total cholesterol, TC)在感染后3 d显著降低(P<0.05)。血液生化指标表明感染无乳链球菌会引起4种奥尼罗非鱼的肝、肾损伤,肌肉受损和脂代谢障碍,但EX奥尼罗非鱼的肝和肌肉受损最小,EX和EE奥尼罗非鱼代谢活动影响较小。上述结果表明,4种奥尼鱼中EX奥尼罗非鱼的耐链球菌病能力最强。本研究从耐链球菌病能力角度评价了4种不同罗非鱼正交组合间的合配效果和育种潜力,预期结果为培育罗非鱼抗链球菌病新品种提供理论依据和育种材料。

• 基因编辑技术发展及其在家畜上的应用

  谢晓刚, 薛嘉, 康健, 葛陆星, 董翔宸, 王宇飞, 张涌, 权富生

  近年来出现的几种以人工核酸酶为代表的新型基因编辑技术,包括锌指蛋白核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)技术、转录激活因子样效应核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技术、成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins, CRISPR/Cas)系统,在科学研究以及家畜育种等方面已被广泛应用。这些基因编辑技术是通过特异性结构识别靶位点,核酸酶发挥切割作用,对靶位点进行定点编辑,具有高效准确、制作简单等特点。本文阐述了上述3种新型基因编辑技术的基本原理,比较了不同基因编辑技术的差异,总结了在主要家畜猪、牛、羊上的应用,提出目前这三种基因编辑技术存在的主要问题,并对这些技术的应用前景进行了展望。

• 全基因组关联分析及其扩展方法的研究进展

  卜李那, 赵毅强

  全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)是研究复杂性状和疾病遗传变异的有效方法,其核心是研究分子变异和目标表型性状之间的关联。尤其是近几年来随着高通量测序和高分辨的代谢检测技术的不断发展,以及多种生物信息学技术和统计学方法发展,这些为复杂性状致因变异的精细定位提供基础。本综述将在全基因组关联分析的基础上,介绍GWAS在基因组、代谢组和转录组方面的应用及研究进展,包括基于单倍型的GWAS、代谢组的GWAS、基因表达的GWAS,并对GWAS未来的发展进行了展望。

• 基于双重微滴数字PCR精准定量转基因水稻G6H1的方法研究

  缪青梅, 汪小福, 陈笑芸, 彭城, 徐晓丽, 魏巍, 徐俊锋

  转基因水稻(Oryza sativa) G6H1是我国自主研发的抗虫耐除草剂转基因水稻品系,抗虫和抗草甘膦性能良好,具有较好的应用前景,但目前缺乏对其进行精准定量检测的方法。本研究基于微滴式数字PCR (droplet digital PCR, ddPCR)平台建立了适用于转基因水稻G6H1品系的双重ddPCR精准定量方法。通过对不同作物的qRT-PCR实验,验证了用于G6H1转化体事件检测的引物与探针的特异性;对4个候选内源基因进行数字PCR扩增,筛选出了适合双重ddPCR检测的水稻内标准基因,进一步对双重ddPCR的引物和探针的浓度及退火温度进行了优化和选择,建立的转基因水稻G6H1双重ddPCR定量分析方法,对内外源基因的检测限达到3拷贝,对内外源基因的定量限在25拷贝,定量结果的相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)小于25%。最后,比较了单重实时荧光定量PCR (quantitative real-time-PCR, qRT-PCR)、单重ddPCR和双重ddPCR三种方法,对转基因水稻G6H1含量分别为5%、1%和0.5%样品的定量结果。结果表明,建立的转基因水稻G6H1双重ddPCR方法特异性好、灵敏度高、精准可靠,适用于精准定量转基因水稻G6H1转化体成分。该方法的建立为转基因水稻G6H1定量检测提供了新方法,完善了我国转基因水稻成分定量检测技术体系,为农业转基因生物安全阈值管理增添了技术储备。

• 烟草NtGCN2的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

  郝英辰, 龙月, 郭豪, 李宁, 张松杰, 赵棋, 张松涛

  GCN2 (general control non-derepressible-2)磷酸化真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor 2α, eIF2α)而抑制蛋白的翻译,从而感知氨基酸的缺乏并对各种胁迫做出响应。为了深入研究烟草(Nicotiana tabacum) NtGCN2的功能,本实验构建了烟草NtGCN2全长和N端NtGCN2(1~437 aa)的原核表达载体pET15b-NtGCN2和pCzn1-NtGCN2(1~437 aa),分别在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21-CodonPlus-(DE3)-RIPL、BL21-CodonPlus-(DE3)-RPL和BL21(DE3) Plys进行原核表达。Western blot结果显示,烟草NtGCN2全长和NtGCN2(1~437 aa)蛋白分别在大肠杆菌BL21-CodonPlus-(DE3)-RIPL和BL21(DE3) Plys中成功表达。其次,对NtGCN2全长蛋白的表达条件进行优化。结果显示,在16 ℃、0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)、13 h的诱导条件下,BL21-CodonPlus-(DE3)-RIPL的上清中获得了可溶的NtGCN2蛋白。采用阴离子交换柱Hitrap Q和Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析对蛋白进行初步纯化。采用包涵体复性的方法获得较纯的NtGCN2和NtGCN2(1~437 aa)蛋白。其中,NtGCN2(1~437 aa)通过Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后获得条带单一的纯蛋白。最后,利用获得的重组蛋白制备抗体,并对原核表达的NtGCN2全长和NtGCN2(1~437 aa)蛋白进行Western blot检测,结果表明制备的抗体均能有效识别NtGCN2蛋白。本研究实现了NtGCN2蛋白的原核表达和纯化,制备了NtGCN2的多克隆抗体,为进一步探讨植物GCN2的功能提供了基础资料。

• CRISPR/Cas9介导获得用于分离双峰驼iPSCs的转染细胞系

  李宗帅, 申培磊, 刘雷雷, 杨洋, 李海江, 张全伟, 贡继尚, 赵兴绪, 张勇

  双峰驼(Camelus bactrianus)作为西北地区的濒危物种,其生理特性特殊,用途广泛。利用诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)对该物种的种质资源进行保护具有重要的应用价值。但传统分离鉴定iPSCs的方法较为复杂繁琐。为了对iPSCs进行快速高效的分离鉴定,本实验利用CRISPR/Cas9系统,参照双峰驼Nanog基因,在其终止密码子附近设计单链导向RNA (single guide RNA, sgRNA),成功构建了切割载体;以双峰驼全基因组为模板获得上、下游同源臂,并在两个同源臂之间连入两个报告基因绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein, GFP)和新霉素抗性基因(neomycin resistance, Neo),成功构建了表达载体。同时测得双峰驼胎儿成纤维细胞对于遗传霉素(geneticin, G418)的最小致死量。用表达载体与切割载体共转染双峰驼胎儿成纤维细胞,继续培养48 h后,用G418筛选两周;之后用不含G418的DMEM/F12完全培养基对药筛后的细胞进行扩大培养,成功获得了活力较高的稳定转染细胞系。本实验为验证在Nanog基因后定点敲入报告基因来正确筛选iPSCs提供了生物材料。