农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2024年第11期

• 水稻粒型全基因组关联分析

  龚成云, 朱裕敬, 桂金鑫, 石居斌, 罗新阳, 曾哲, 张海清, 贺记外

  水稻(Oryza sativa)粒型是决定水稻产量、稻米外观、营养品质和商品价值的重要因素,粒型主要受遗传因素的调控。挖掘并利用水稻粒型优异基因资源并解析其调控水稻粒型的分子机制,是进一步改良稻米品质和提高水稻产量的重要策略。本研究以410份3K水稻核心种质为研究材料,于种子成熟后测量粒长、粒宽和粒厚,结合种质基因型进行水稻粒型全基因组关联分析(genome-wide association analysis, GWAS),并对定位到的粒型QTL进行候选基因以及候选基因单倍型分析,筛选这些QTL的候选基因。结果表明,GWAS共检测到5个粒型相关的QTL,分布在水稻1、3、5、7和8号染色体上,控制粒长的QTL有qGL3、qGL7和qGL8,其中qGL3与GS3共定位,qGL7与GL7共定位,而qGL8为控制粒长的新QTL位点;控制粒宽的QTL有qGW5,与GW5共定位;控制粒厚的QTL为qGT1,与d61共定位。初步筛选到qGL8的候选基因为Os08g0421800。分析粒长QTL不同单倍型在种质中的聚合情况,结果显示,qGL3、qGL7和qGL8候选基因优异单倍型聚合在'B073'、'B081'等8份种质中,这8份种质谷粒均为细长型。本研究为水稻粒型的遗传改良提供了新的种质资源和理论支撑。

• 小麦WUS基因亚家族的全基因组鉴定及其在雄蕊和雌蕊中的表达分析

  赵若男, 邹瑞, YAMAMOTO Naoki, 陈真勇, 吴一超, 蒋进, 彭正松, 杨在君

  WUSCHEL (WUS)是一种同源结构域转录因子,其作为WOX家族的一个进化分支,可能通过调节特定靶基因的表达,在植物细胞的胚胎发生和芽再生中发挥重要作用。本研究利用生物信息学方法在小麦(Triticum aestivum)的全基因组中一共鉴定出25个WUS基因,不均匀分布在第1、第2、第3和第5同源群染色体上,并且其在第3同源群染色体上发生了串联重复现象。保守结构域分析显示,该家族成员均含有motif 1和motif 3,基因结构和进化树显示,聚类在一起的WUS蛋白具有类似的基因结构。在TaWUSs的启动子区共鉴定出18类激素响应与非生物胁迫类的响应元件。组织表达谱分析显示,25个TaWUSs在小麦中拥有明显的组织表达特异性,且多数在花器官高表达。qRT-PCR结果进一步证实了TaWUS-2A1、TaWUS-3B2、TaWUS-3D2、TaWUS-5A1、TaWUS-5B1和TaWUS-5D1在正常雄蕊中高表达,而TaWUS-3D1在正常雌蕊中高表达。尤其是TaWUS-1A、TaWUS-1B、TaWUS-1D和TaWUS-2D1在雌蕊化雄蕊中高表达,预示其可能在调控小麦同源转化型雄性不育突变体(HTS-1)中雄蕊同源转化为雌蕊性状的形成中发挥作用。本研究为进一步解析小麦WUS亚家族基因的功能提供了理论基础。

• 马铃薯干旱响应基因StGAMyb-like1克隆、表达及蛋白互作分析

  邓玉荣, 魏晶晶, 刘升燕, 杨亮, 王晓凤, 杨江伟, 张宁, 司怀军

  作为MYB转录因子家族中最大的亚家族,R2R3-MYB转录因子广泛参与植物生长发育、物质代谢等过程,并且具有提高植物胁迫耐受性的潜力。前期研究在马铃薯(Solanum tuberosum)中鉴定出1个与拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtMYB33同源的StGAMyb-like1基因(GenBank No. XM_015303144.1),该基因是R2R3-MYB的第18亚组GAMYB中的成员,且能够响应干旱胁迫。本研究以马铃薯品种'Desiree'为材料,克隆得到StGAMyb-like1基因,其CDS长为1 572 bp;生物信息学分析发现,该基因启动子区含有多种激素响应元件,其蛋白序列与番茄(Solanum lycopersicum)的相似度最高。组织差异性表达分析发现,StGAMyb-like1基因在叶片中具有更高的表达丰度。对木质素合成途径中的香豆酸-3-羟化酶编码基因StCYP98A3启动子序列进行分析,发现该基因具备与MYB转录因子结合的MBS (MYB binding site)元件。通过酵母单杂交、双荧光素酶报告基因分析和β-D-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase, GUS)检测,证实StGAMyb-like1可与StCYP98A3基因启动子结合并转录激活该基因表达。本研究可为深入探讨StGAMyb-like1基因功能提供参考依据。

• StWIP2基因调控马铃薯对晚疫病的抗性

  朱迪, 周云, 杨生龙, 孙海宏, 贺苗苗

  伤害诱导蛋白(wound-induced proteins, WIPs)在植物应答病原菌侵染的防御反应中发挥了重要作用。本研究从马铃薯(Solanum tuberosum) '青薯9号'中克隆了StWIP2基因(GenBank No. NM_001288699.1),并对StWIP2基因进行生物信息学分析,同时构建StWIP2基因过表达载体和沉默载体,运用反向遗传学手段对StWIP2基因在与晚疫病互作中的功能进行鉴定。生物信息学分析发现,StWIP2基因的CDS全长为636 bp,共编码211个氨基酸。qPCR分析发现,StWIP2基因在'春薯5号'中表达量最高,在二倍体马铃薯DM中表达量最低。在水杨酸(salicylic acid, SA)、脱落酸(abscisic acid, ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)和晚疫病菌胁迫处理下,StWIP2基因均受到调控。过表达StWIP2能够提高植株H2O2和丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量、抗氧化酶的活性及相关防卫基因病程相关蛋白1 (pathogenesis related protein 1, StPR1)、StPR5和乙烯响应因子(ethylene responsive factor 1, StERF1)的表达水平来推迟植株发病的时间,提高植株对晚疫病的抗性水平。沉默StWIP2基因后,植株H2O2和MDA的含量降低,抗氧化酶活性降低;防卫基因植物防御素基因1.2 (plant defensin gene 1.2, PDF1.2)、StERF1、过氧化物酶基因(peroxidase, StPOD)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase, StPAL)的表达量降低,StPR1和StPR5的表达受到抑制,植株对晚疫病的抗性水平下降。上述结果表明,StWIP2基因在与晚疫病互作的过程中起到正调控的作用,StWIP2基因可以作为马铃薯抗病育种的候选基因资源加以利用。

• 甘蓝型油菜泛素结合酶BnaPHO2基因克隆及表达分析

  王明, 山清影, 张晶晶, 杜坤

  PHO2 (PHOSPHATE2)作为磷转运蛋白的负调控因子,通过行使其泛素结合酶活性在植物体内磷的代谢平衡中发挥作用。本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana) PHO2为基础,探究甘蓝型油菜(Brassica napus)中与之同源性最高的BnaPHO2蛋白特性及其功能。以生物信息学数据为参考,对BnaPHO2基因表达模式、亚细胞定位以及酵母自激活活性进行分析,并利用原核表达系统获得BnaPHO2融合蛋白。结果显示,BnaPHO2蛋白由865个氨基酸组成,分子量为95.7 kD,蛋白理化特性稳定;保守结构区域含有与泛素蛋白和泛素连接酶共价结合的位点;在系统发育上与同科的白菜(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea)的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示,BnaPHO2基因在油菜的根、叶等营养器官中的相对表达量较高,且积极响应高磷胁迫。烟草(Nicotiana tabacum)瞬时转化结果显示,BnaPHO2定位于细胞膜和细胞核。酵母自激活检测表明,BnaPHO2全长无自激活活性。在28 ℃下经1 mmol/L IPTG 诱导16 h后,分别获得N端融合6×His标签和C端融合谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase, GST)标签的BnaPHO2纯化蛋白。BnaPHO2蛋白特性的阐明及异源蛋白的表达为后续开展体外互作、泛素化等研究提供理论参考和基础资料。

• 普通菜豆PvIQD基因家族鉴定及其非生物胁迫下的表达分析

  董雪, 赵敏, 李佳, 邱傅懿, 王燕, 赵建栋, 畅建武, 郝晓鹏

  IQ67结构域(IQ67 domain, IQD)基因编码一类含有IQ67保守结构域的钙调蛋白结合蛋白,在调控植物器官形态和响应逆境胁迫中发挥重要作用。本研究通过生物信息学分析在普通菜豆(Phaseolus vulgaris)基因组中鉴定出34个PvIQD基因,对其理化性质、基因复制、系统进化、基因结构和表达模式等进行相关分析。结果表明,PvIQD基因不均匀地分布在11条染色体上,存在2个片段重复基因对,没有串联重复基因对。Ka/Ks比值均小于1,表明PvIQD基因在进化中受到纯化选择。系统进化分析显示,PvIQD基因家族成员被分为4个亚家族(Ⅰ~Ⅳ),28个PvIQD基因与大豆(Glycine max)的GmIQD基因有一对二的聚类关系。基因结构分析显示,PvIQD基因包含2~6个外显子,大部分PvIQD蛋白序列含有motif1和motif7,同一亚家族具有相似的基因结构和保守基序,IQ基序中的Gln7、Arg11、Gly12、Leu14和Arg16是高度保守氨基酸。共线性分析发现,普通菜豆与双子叶植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大豆比与单子叶植物水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea mays)有更加密切的亲缘关系,与大豆的亲缘关系最为密切。RNA-seq数据分析显示,6个PvIQD基因在不同发育阶段的多个组织中均有高表达,组织特异表达基因PvIQD2和PvIQD19分别在绿色成熟豆荚和根瘤中表达量最高。qRT-PCR结果表明,8个PvIQD基因能够响应干旱和盐胁迫,表现出不同的表达调控模式。本研究为探索PvIQD基因抵御非生物胁迫的调控作用机制提供了参考。

• 紫苏PfSAD3和PfSAD4基因克隆及功能分析

  尹苗, 王尧, 王壮琳, 胡婷, 陈树溦, 周雅莉, 邢志, 王计平, 李润植

  Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶(Δ9-stearoyl-ACP dehydrogenase, SAD)是植物体内不饱和脂肪酸合成积累的关键酶。为探究SAD在紫苏(Perilla frutescens)脂肪酸生物合成中的作用,本研究克隆了PfSAD3和PfSAD4基因,并对其进行生物信息学分析及功能验证。以'晋紫苏1号'种子为实验材料,分离得到PfSAD3 (GENE_023515)和PfSAD4 (GENE_042129)基因的全长序列,其ORF长度分别为1 173和1 116 bp;使用MEGA 11.0对PfSAD3和PfSAD4蛋白序列、拟南芥(Arabidopsis thaliana)及其他物种SAD序列构建进化树,发现PfSAD3与白头翁(Leucas cephalotes) LcSAD亲缘关系较近,PfSAD4与蓖麻(Ricinus communis) RcSAD亲缘关系较近。进一步构建酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达载体pYES2.0-PfSAD3和pYES2.0-PfSAD4,分别转入野生型酵母INVSc1和缺陷型酵母BY4389中,结果表明, PfSAD3和PfSAD4过表达使酵母总脂肪酸及不饱和脂肪酸含量显著升高(P<0.05),并使缺陷型酵母恢复合成棕榈油酸(C16:1)和油酸(C18:1)的能力。通过添加外源脂肪酸分析PfSAD3和PfSAD4蛋白的底物选择特异性,结果表明,与PfSAD3相比,PfSAD4对C18:0更具偏好性,酶活性更强。将PfSAD3和PfSAD4基因在野生烟草(Nicotiana tabacum)中过表达来验证其功能,结果表明,转基因烟草叶片总脂肪酸及不饱和脂肪酸含量显著升高(P<0.05),与酵母实验结果基本一致。本研究为深入解析紫苏等油料作物不饱和脂肪酸合成的分子调控机制及利用基因工程手段培育富含油脂的油料作物新品系提供科学基础和分子靶标。

• 半夏HD-Zip基因家族全基因组鉴定及表达分析

  刘梦梦, 刘晓, 尤倩, 伯晨, 朱艳芳, 段永波, 薛建平, 王德信, 薛涛

  环境胁迫引发的半夏(Pinellia ternata)倒苗,严重限制了其产业的发展,同源异型域-亮氨酸拉链蛋白(homeodomain-leucine zipper, HD-Zip)家族基因广泛参与植物的逆境响应调控。为发掘参与半夏倒苗调控的HD-Zip基因,本研究开展了半夏基因组水平HD-Zip家族基因的鉴定分析。结果发现,半夏中共鉴定出17个HD-Zip家族基因,其中15个成员挂载至9条染色体上。进化分析显示,鉴定出的17个HD-Zip家族成员包括9个HD-ZipⅠ亚家族成员和8个HD-ZipⅡ亚家族成员,蛋白序列中均具有高度保守性的HD结构域(WFQNRR)。亚细胞定位预测显示,17个HD-Zip家族成员均定位于细胞核中;共线性分析表明,8个PtHDZ基因形成4对同源基因对,且1个基因与水稻(Oryza sativa)之间存在共线性关系。顺式作用元件预测分析表明,鉴定的PtHDZ基因启动子均含激素、胁迫响应元件和转录因子结合位点等元件。组织表达模式分析显示,半夏HDZ家族基因在不同组织中呈现差异表达,多数基因在根和块茎中高表达;高温胁迫下表达模式分析发现,14个PtHDZs受高温诱导表达,2个PtHDZs的表达受高温抑制。本研究为解析半夏的倒苗机理及分子育种提供了基因资源。

• 牛卵泡颗粒细胞中Wnt/β-catenin与Notch信号通路关键因子的表达规律

  党文庆, 何敏, 曲玉涵, 张凯, 杨小峰, 秦小伟, 韩琦, 郭翔宇, 吕丽华

  颗粒细胞的增殖、凋亡和类固醇激素的合成在卵泡的发育过程中发挥重要作用,这些功能受信号通路的调控。本研究分别对牛(Bos taurus)第1卵泡波偏差前(pre-deviation, PD)和偏差发生时(onset of diameter deviation, OD)第1大卵泡F1和第2大卵泡F2的颗粒细胞进行转录组测序并对其中的Wnt/β-catenin与Notch通路的关键组分进行表达量验证,进而探讨两条信号通路、细胞周期和细胞凋亡的关键基因及类固醇激素合成相关基因的表达规律。结果显示,PDF1、PDF2、ODF1和ODF2颗粒细胞中表达量高的通路关键组分对应的基因为：无翼型MMTV整合位点家族成员10a (wingless-type MMTV integration site family, member 10a, Wnt10a)、Wnt2b、卷曲蛋白3 (frizzled1, Fzd3)、低密度脂蛋白相关受体8 (low density lipoprotein-related receptor 8, LRP8)、蓬乱蛋白3 (dishevelled3, Dvl3)、轴蛋白1 (Axin1)、糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase 3β, GSK3β)、β-catenin (catenin beta 1, CTNNB1)、转录因子7样2 (transcription factor 7-like 2, TCF7L2)、淋巴增强因子1 (lymphoid enhancer factor1, LEF1)、B-细胞淋巴瘤因子9 (B-cell CLL/lymphoma 9, BCL9)及Notch2、Dll4、与YRPW基序蛋白2相关的发状分裂相关增强子(Hes related with YRPW motif2,Hey2);细胞周期相关基因有：细胞周期蛋白2 (cyclin2, CCND2)、细胞周期蛋白依赖性激酶4 (cyclin-dependent kinase4, CDK4)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B (cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1B);线粒体凋亡途径主要由BCL2-associated X (BCL2-associated X, Bax)基因进行调控,并由Caspase3和Caspase6来执行;类固醇激素合成基因有：3β-羟基类固醇脱氢酶基因(3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)、细胞色素P450家族成员11A1 (cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1, CYP11A1)和CYP19A1,且OD卵泡颗粒细胞E2合成能力增强;Wnt2定位于偏差过程的卵泡颗粒细胞中,在OD卵泡颗粒细胞中表达量显著升高(P<0.05);Wnt2b蛋白定位于卵泡颗粒细胞和膜细胞中,并在OD卵泡颗粒细胞中表达量极显著降低(P<0.01);两条信号通路中CTNNB1、LEF1、Notch2和Hey2基因的表达量均在OD卵泡颗粒细胞中极显著升高(P<0.01)。本结果表明,牛第1卵泡波偏差过程中F1、F2卵泡颗粒细胞基因表达具有特异性,Wnt/β-catenin和Notch信号通路关键组分的表达趋势一致,这将为探索卵泡发育过程中颗粒细胞功能的分子调控机制提供参考依据。

• miR-133a_R+1调控ALDH5A1的表达对奶牛胎衣不下的影响

  汪玥, 吕琛, 姚丹, 赵兴绪, 张勇

  Micro RNA (miRNA)参与哺乳动物许多生理活动,其中miR-133a在胎盘和子宫生长发育过程中具有重要的调控作用。通过测序及靶基因预测软件发现miR-133a_R+1与ALDH5A1在胎衣不下奶牛(Bos taurus)胎盘组织中差异表达且可能存在靶向调控关系。本研究以正常排出及胎衣不下奶牛胎儿胎盘组织和健康奶牛子宫内膜上皮细胞(bovine endometrial epithelial cells, BEND)为实验对象,苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin, HE)观察胎儿胎盘组织的病理变化,实时定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测miR-133a_R+1与乙醛脱氢酶5家族成员A1 (aldehyde dehydrogenase 5 family member A1, ALDH5A1)在胎儿胎盘组织中的表达情况,采用免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测ALDH5A1蛋白在胎儿胎盘组织中的定位,选取转染效率最佳条件100 nmol/L、12 h构建过表达miR-133a_R+1的BEND细胞模型,通过qRT-PCR与Western blot检测细胞中ALDH5A1基因及其蛋白表达水平。结果显示,RP胎儿胎盘绒毛短而稀疏,零散破碎。RP胎儿胎盘组织中miR-133a_R+1基因的表达量极显著上调(P<0.01),ALDH5A1在结缔组织、细胞滋养层中表达且表达量极显著下调(P<0.01),过表达miR-133a_R+1的BEND细胞中ALDH5A1基因及蛋白表达水平均极显著下调(P<0.01)。实验结果表明,miR-133a_R+1通过靶向调控ALDH5A1的表达影响奶牛RP,为今后miRNA在奶牛RP中的作用机制研究提供了理论基础。

• 低温对合作猪肝脏抗氧化能力和脂质代谢的影响

  贾蕊, 李瑶, 王龙龙, 王鹏飞, 闫尊强, 张鹏霞, 杨巧丽

  低温是影响我国北方地区养猪业效益的因素之一,导致猪只生产性能下降,仔猪病死率升高,严重制约着我国养猪业的高效发展。本研究旨在解析低温对合作猪(Sus scrofa)肝脏抗氧化能力和脂质代谢的影响。选用75日龄健康合作猪,常温饲养7 d后随机分为低温组(CH)和常温对照组(NH)。低温组在装有温度控制装置的室内(-15±2) ℃饲养,常温对照组在室内常温(23±2) ℃饲养,共处理15 d。分别于处理后的0、5、10、15 d空腹前腔静脉采集供试猪血液,第15天屠宰采集肝脏组织,采用ELISA检测血清抗氧化指标、肝脏脂质代谢物;qPCR检测脂质代谢相关基因的表达。结果显示,随低温处理时间延长,合作猪血清总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量呈先增加后降低趋势,T-AOC活性在10 d时达最高值1.94,显著高于其他处理时间(P<0.05),MDA活性在第5天最高,极显著高于第10和15天(P<0.01);血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性均呈增加趋势,其中SOD在低温处理10 d时极显著升高(P<0.01),GSH-Px和CAT活性在低温处理5 d时活性极显著升高(P<0.01)。与常温对照组相比,低温组合作猪肝脏氧化损伤标志物蛋白质羰基(protein carbonyl, PCO)和8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2deoxyguanosine, 8-OHdG)含量极显著升高(P<0.01);低温组合作猪肝脏脂代谢相关酶中脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACC)活性显著降低(P<0.05),脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)、肝脂酶(hepaticlipase, HL)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1 (stearoyl-CoA desaturase 1, SCD1)活性均极显著降低(P<0.01);肉碱棕榈酰转移酶(carnitine palmitoyltransferase enzyme, CPT)活性极显著升高(P<0.01);低温组合作猪血清甘油三酯(triglyceride, TG)含量在5 d时最高,为0.82,15 d时显著降低至0.61 (P<0.05);肝脏脂代谢相关基因胆固醇调节元件结合蛋白1c (sterol regulatory element-binding protein-1c, SREBP-1c)和过氧化物酶体增殖物激活受体α (peroxisome proliferators-activated receptors α, PPARα)的表达量显著降低(P<0.05),p300/CBP相关因子(p300/CBP associated factor, PCAF)的表达量极显著增加(P<0.01)。综上所述,低温会造成合作猪肝脏氧化损伤,处于寒冷环境时合作猪能够通过增强肝脏脂质代谢提高其寒冷适应性。本研究为进一步探索合作猪抗寒性状形成的机制提供了参考依据。

• 小麦豆粕饲粮添加ε-聚赖氨酸盐酸盐对蛋鸡生产性能、蛋品质和肝脏脂质代谢的影响

  刘梦琪, 史明骅, 吴健清, 樊金云, 汪涵, 杨松柏, 赵阿勇, 周晓龙

  我国大豆年产量较低,无法满足生产生活需求,严重依赖进口,国际上大豆价格不断飞涨,而小麦替代玉米可以实现豆粕减量。ε-聚赖氨酸盐酸盐(ε-poly-L-lysine hydrochloride, ε-PLH)是一种天然防腐剂和抗菌剂,常用于食品等领域。本研究旨在探讨小麦豆粕饲料添加ε-PLH对蛋鸡(Gallus gallus domesticus)生产性能、蛋品质和肝脏脂质代谢的影响。实验选取21周龄海兰褐蛋鸡共120只,随机分为4组,每组5个重复,每个重复6只鸡,分为对照组、小麦组、小麦+0.01% ε-PLH组和小麦+0.05% ε-PLH组,进行3周的换粮饲养,正式实验期为12周。结果表明,对照组和3个处理组产蛋率和料蛋比均无显著差异,小麦+0.01% ε-PLH组和小麦+0.05% ε-PLH组的平均蛋重显著高于对照组(P<0.05);小麦组、小麦+0.01% ε-PLH组和小麦+0.05% ε-PLH组蛋形指数、蛋白高度和哈氏单位显著高于对照组(P<0.05),小麦+0.01% ε-PLH组蛋壳厚度显著高于对照组和小麦组(P<0.05);小麦+0.01% ε-PLH组能够显著上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARG)、脂肪酸去饱和酶2 (fatty acid desaturase 2, FADS2)和脂肪酸结合蛋白1 (fatty acid binding protein 1, FABP1)等脂质代谢相关基因的表达量(P<0.05)。由此可见,小麦替代玉米并添加ε-PLH可以改善蛋鸡的生产性能、蛋品质和缓解肝脏脂质沉积。本研究为将ε-PLH应用于畜禽养殖提供理论和实践支持,也为国家玉米豆粕减量替代政策提供备选方案。

• 鸡ITM2A基因生物学特性及其在成肌细胞增殖分化中的作用

  贾其辉, 曹玉珠, 邢雨欣, 马乘霖, 管宏波, 王倩, 康相涛, 田亚东, 李转见, 刘小军, 李红

  整合膜蛋白(integral membrane protein 2A, ITM2A)在肌肉发育等多种生物学过程中发挥重要作用。本课题组前期研究显示,ITM2A基因被定位与鸡(Gallus gallus)体重显著相关,但ITM2A在鸡骨骼肌增殖分化过程中的生物学功能并不清楚。本研究运用在线软件对鸡ITM2A蛋白质进行生物信息学分析;选取6只7日龄AA肉鸡(Arbor Acres Plus),采集心、肝、脾、肺、肾和胸肌、腿肌等器官和组织样品用于组织表达谱分析,选取不同发育时期胸肌和腿肌组织用于时序表达分析。利用qPCR技术检测ITM2A的相对表达水平,使用PCR技术扩增ITM2A基因CDS,构建重组质粒过表达载体。分离鸡原代成肌细胞(chicken primary myoblasts, CPMs),检测CPMs诱导分化不同时期ITM2A的相对表达量。在CPMs中过表达ITM2A,检测细胞增殖、细胞分化相关标志基因的表达,评估ITM2A的生物学功能。生物信息学分析结果显示,ITM2A蛋白由251个氨基酸残基组成,主要由α螺旋(38.25%)和β折叠(37.75%)组成;属于不稳定、亲水性、非分泌蛋白,具有1个跨膜结构,主要定位于细胞膜,可能与鳍芽起始因子同源物(fin bud initiation factor homolog, FIBIN)、核糖体蛋白质侧翼柄亚基P0 (ribosomal protein lateral stalk subunit P0, RPLP0)、连环蛋白α样1 (catenin alpha like 1, CTNNAL1)等蛋白存在相互作用;与火鸡(Meleagris gallopavo)同源性最高,亲缘关系最近。组织表达分析结果显示,ITM2A在检测组织中广泛表达,在肺脏和脾脏中表达最高,胸肌、腿肌中表达最低。时序表达分析显示,随孵化天数的增加,在胸肌和腿肌中的ITM2A表达逐渐下降,在孵化后1周时达到最低。与对照组相比,过表达组ITM2A表达量极显著高于对照组(P<0.01),细胞增殖相关标志基因相对表达水平无显著变化,细胞分化相关标志基因肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MYHC)、生肌决定因子(myoblast determination, MYOD)和成肌细胞融合因子(myomarker, MYMK)表达量显著上调(P<0.05)。ITM2A基因的表达在CPMs增殖时期呈下降趋势,随着诱导天数的增加ITM2A表达呈上升趋势。本研究表明,ITM2A能够促进鸡成肌细胞的分化,为进一步研究ITM2A影响鸡肌肉发育的分子机制提供了依据。

• 健康成年公鸭睾丸大小比较及其相关调控基因表达分析

  朱春红, 陶志云, 王志成, 宋卫涛, 刘宏祥, 章双杰, 徐文娟, 顾昊天, 王逸飞, 李慧芳

  本研究旨在通过对健康成年公鸭(Anas platyrhynchos)睾丸大小和产精液量差异个体睾丸组织进行转录组测序和生物信息学分析,筛选出与睾丸大小以及生精能力相关的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)及信号通路,为公鸭睾丸功能性选育提供数据支撑。本研究选用230日龄健康成年公鸭40只,根据睾丸称重结果分组睾丸轻组(GS)和睾丸重组(GL),根据精液采集量多少分组产精液量少组(GF)和精液量多组(GM),各组分别采集睾丸组织利用BGIseq平台进行转录组mRNA测序,对筛选到的DEGs进行GO和KEGG功能注释和富集分析,qRT-PCR验证挑选的DEGs表达水平。结果显示,体重差异不显著公鸭中,部分个体睾丸大小有显著性差异;睾丸大小差异不显著公鸭中,人工采精训练后采集精液量有显著差异。睾丸重差异组和精液量差异组共分析到383个DEGs,不同分组间共同DEGs数为36个,qRT-PCR结果显示,转录组测序结果准确可靠。GO和KEGG分析结果表明,DEGs显著富集于信号转导、细胞膜、膜的整体组成、细胞质膜、G蛋白偶联受体活性、细胞分裂正向调节、cAMP信号、PI3K-Akt信号、钙信号等相关通路,GPR50、GPR132、GRER1、IGF1、TACR3、HTR1F、FGF19、FGF3、GABRG1、ADCY1等基因富集其中,可能与睾丸功能紧密相关。本研究初步筛选了公鸭睾丸大小以及生精能力差异的基因,为水禽睾丸功能的遗传育种提供了的理论依据。

• 琼英山古茶园土壤细菌群落多样性及组成研究

  闫钘, 杨雄伟, 崔仕方, 黄晓霞

  云南省凤庆县琼英山古茶园作为珍稀的自然遗产,具有重要的生态、文化和经济价值,其可持续发展离不开健康的土壤微生态环境。为探究琼英山古茶园土壤细菌群落结构特征,本研究以琼英山古茶园根际和非根际土壤为研究对象,基于16S rRNA基因扩增子测序技术分析土壤细菌群落多样性与结构特征及与土壤化学性质的关系。结果显示：(1) Alpha多样性分析表明,山谷根际或非根际土壤细菌群落丰度显著大于山顶根际或非根际土壤;山顶或山谷根际土壤和非根际土壤之间,细菌群落丰度和多样性差异不显著。(2)细菌优势门均为酸杆菌门(Acidobacteriota)(21.15%~26.76%)和变形菌门(Proteobacteria)(15.06%~20.79%),优势属一致为念珠菌固体杆菌属(Candidatus_Solibacter)(2.6%~3.6%)、酸杆菌属(Acidibacter)(2.6%~3.4%)和苔藓杆菌属(Bryobacter)(2.2%~2.6%)。(3) Beta多样性分析表明,细菌群落的组成和结构相似,但具有一定的差异性。(4)冗余分析(redundancy analysis, RDA)表明,土壤有机质是影响根际土壤细菌群落组成和结构的主要环境因子。综上,本研究初步探讨了琼英山茶园山顶和山谷古茶树根际与非根际土壤细菌群落结构特征,可为茶园古茶树的保护和利用提供参考依据。

• 生防菌株贝莱斯芽胞杆菌ZF513的分离鉴定及其对黄瓜猝倒病的防治效果

  闫丽霞, 李磊, 丁常宗, 石延霞, 柴阿丽, 范腾飞, 谢学文, 李宝聚

  由瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)引起的黄瓜猝倒病是黄瓜(Cucumis sativus)生产上一种危害严重的苗期病害,严重影响了黄瓜的产量和品质。为了获得对黄瓜猝倒病具有拮抗效果的生防菌株,本研究采用梯度稀释涂布法分离了健康黄瓜根际土壤中的芽胞杆菌(Bacillus sp.),通过活体盆栽试验得到生防菌株ZF513对黄瓜猝倒病防效最好,达86.64%。经形态学、生理生化检测、唯一碳源利用测定及分子鉴定,判定生防菌株ZF513是贝莱斯芽胞杆菌(B. velezensis)。采用平板对峙法测定显示,菌株ZF513对8种植物病原菌(瓜果腐霉, 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani), 尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum), 茄病镰孢菌(F. solani), 多主棒孢菌(Corynespora cassiicola), 辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici), 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea), 茄匍柄霉菌(Mphylium solani))均具有明显的拮抗作用,具有广谱的抑菌能力,其中对瓜果腐霉抑菌率达65.23%。盆栽试验测定结果表明,菌株ZF513对黄瓜植株生长促生作用明显,并且在浓度为1×108 cfu/mL,用量为10 mL/株时,对黄瓜猝倒病防效最高,达72.61%,此浓度下的菌株可以在黄瓜根际土壤中以浓度为1×105 cfu/g含量稳定定殖,可以在育苗期间保护黄瓜植株免受病害侵入。综上所述,菌株ZF513在防治黄瓜猝倒病方面具有潜在的应用价值。

• 密旋链霉菌Act12对柑橘采后酸腐病及果实品质的影响

  戚华铃, 陈盈营, 周艳, 刘锴栋, 张鸿雁

  柑橘酸腐病是柑橘(Citrus reticulata)采后常见的病害之一,导致柑橘腐烂酸臭,严重影响柑橘采后贮藏效果。微生物防治柑橘酸腐病具有绿色、环保、无抗药性等优势,是农业健康发展的方向。本研究通过平板对峙培养法和生长速率法分析密旋链霉菌(Streptomyces pactum) Act12对酸腐病病原菌白地霉(Geotrichum candidum)的抑制作用,采用针刺接种法评价防治效果,进一步测定Act12发酵滤液对柑橘抗性酶、抗性物质及果实品质的影响。结果显示,Act12对白地霉的抑菌率为76.04%,20%浓度的发酵滤液对白地霉的抑菌率达到97.17%;Act12对8种水果病原菌都有抑菌活性;在常温贮藏条件下,Act12滤液显著降低柑橘酸腐病的病情指数(P<0.05),防效达到88.20%;20%浓度的发酵滤液处理后果实抗性酶—多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、几丁质酶(chitinase, CHI)和葡聚糖酶(glucanase, GLU)活性及抗性物质果皮总酚和类黄酮含量皆显著增加(P<0.05),可溶性固形物和还原糖含量显著增加(P<0.05),可滴定酸显著下降(P<0.05),果实品质有所提高。本研究为柑橘果实采后酸腐病生物防治提供理论参考和新的资源。

• 兔出血症病毒2型浙江株鉴定及致病性研究

  郝方姣, 季权安, 黄叶娥, 崔雪梅, 胡子喆, 宋厚辉, 鲍国连, 刘燕

  兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus type 2, RHDV2)严重威胁家兔(Oryctolagus cuniculus)养殖生产安全。本研究旨在鉴定浙江省某肉兔养殖场疑似RHDV2感染疫情的病原,明确分离株的致病特性及其对兔肠道菌群结构的影响。首先采集病死兔肝脏样品,采用RT-PCR技术扩增RHDV2的衣壳蛋白基因VP60 (capsid protein),通过测序及系统进化树分析进行病原鉴定;进一步通过动物回归试验明确分离毒株的感染和致病特性,采用16S rDNA测序技术分析空白对照组和RHDV2攻毒组的组间盲肠菌群结构变化。结果显示,测序及同源性分析证实RT-PCR扩增获得的目的片段为RHDV2的VP60部分序列(GenBank No. PQ215520),与国内的RHDV2毒株(GenBank No. OQ570964.1)同源,一致性为98.66%。动物回归试验显示,50日龄幼兔在感染48 h内全部死亡,呈现口鼻出血等典型临床症状;组织切片染色可见肝脏组织结构紊乱,肝实质内有明显的肝细胞片状坏死,肺泡壁有较多炎性细胞侵润,出现大范围肺水肿;提取感染兔肝脏RNA,经RT-PCR扩增及测序,发现目的片段与发病兔场的分离毒株一致。基于16S rDNA的高通量测序结果表明,RHDV2感染组家兔的肠道菌群结构和相对丰度与健康对照组比较存在显著差异,在属水平上筛选出13个差异显著的物种,表明RHDV2感染改变了兔肠道原有的微生态。本研究首次对浙江省RHDV2分离株进行了致病性研究,为RHDV2防控和诊治提供参考依据。

• 宿主蛋白SPCS1通过外泌体途径介导BVDV复制的研究

  张成远, 魏玉荣, 陈俊贞, 杨莉, 李泽宇, 李紫仟, 付强, 史慧君

  牛病毒性腹泻病(bovine viral diarrhea, BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起的在世界范围内发生的牛传染病,为畜牧业带来了巨大的经济损失。前期研究发现敲低牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney, MDBK)中的信号肽酶复合体亚基1 (signal peptidase complex subunit 1, SPCS1)基因的表达有效抑制BVDV复制。为了探究其分子机制,本研究将BVDV感染SPCS1基因敲低(knock-down, KD)细胞后收集细胞上清液外泌体,使用透射电镜、Western blot和纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)对外泌体进行特征鉴定。使用qPCR检测外泌体中BVDV 5'非翻译区(untranslated region, UTR) RNA水平。将外泌体感染MDBK,通过qPCR检测BVDV RNA水平,利用倒置显微镜观察外泌体致细胞病变(cytopathic effect, CPE)情况,根据Reed-Muench方法测定病毒滴度变化情况。透射电镜观察到外泌体呈现为盘状囊泡,Western blot检测到外泌体标志性蛋白TSG101,纳米粒径追踪分析结果在100 nm左右出现峰值,成功提取外泌体。Western blot检测BVDV感染SPCS1 KD细胞外泌体TSG101蛋白与空载体处理的对照细胞(Scramble细胞)相比表达显著降低(P<0.001)。qPCR检测显示,外泌体中BVDV 5' UTR RNA水平显著降低(P<0.001)。MDBK感染BVDV感染的SPCS1 KD细胞源外泌体后与对照组感染Scramble细胞源外泌体相比BVDV mRNA水平显著降低(P<0.001),CPE现象推迟并减弱,子代病毒滴度显著下降(P<0.001)。结果表明,SPCS1敲低后影响BVDV通过外泌体途径复制。本研究为BVDV的防控提供新型抗病毒靶点和理论依据。

• 原生细菌资源在养殖业中的研究现状及应用前景展望

  区炳明, 李清青, 林雪, 李菊琴, 萧碧扬, 钟佩桥, 张敏瑜

  原生细菌是动物体内(主要指肠道)的常驻细菌,对宿主动物无致病性,甚至有益生作用,对宿主动物的健康和生理调节起到重要作用。近年来,在养殖业(畜牧或水产)中,动物原生细菌资源的发掘和应用已逐渐兴起,并大有可为。在促进畜禽生长,提高饲料转化效率,防治肠道病原体,以及畜禽专用的口服疫苗或生物制剂的开发等方面都具有良好应用前景。本文综合叙述了原生细菌在养殖业中应用(包括直接使用和畜禽(或水产)专用疫苗或生物制剂的开发)所具备的天然优势,整理了目前为止国内外利用原生细菌在养殖业中的研究及其相关附属产品开发的研究现状,分析了当前动物原生细菌资源应用的难点、重点以及未来发展方向,以推动原生细菌资源在养殖业中的应用,减少对抗生素的依赖,促进养殖业的可持续发展。

• DELLA蛋白介导的海岛棉新型遗传转化体系的建立

  姑扎丽努尔·吐鲁洪, 张佳伟, 李悦, 王晓云, 张霞

  植物遗传转化技术的关键是植株再生体系的建立,而植物遗传转化体系中抗生素的使用不利于植物细胞分化,从而增加了植株再生体系建立的难度。DELLA蛋白GbGAI4 (GAI: gibberellic acid insensitive)基因的过表达赋予植株矮化的特性是一种肉眼可见、十分容易辨认的植物形态变化,有望作为形态筛选标记用于植株遗传转化体系的建立。本研究首先通过构建pTA7002-GbGAI4载体,通过农杆菌(Agrobacterium)介导法侵染海岛棉(Gossypium barbadense) '新海16'棉花胚尖,借助地塞米松特异性诱导GbGAI4基因表达,初步筛选出具有植株矮化性状的转化植株,并进一步借助RT-PCR技术鉴定出转基因阳性植株,从而建立一种新型棉花遗传转化体系。在此基础上,选择生长调控因子(growth-regulating factors, GRF) GRF4作为基于GbGAI4介导的遗传转化系统的转基因示例基因,获得(4±0.6)%的基因转化率。本研究为棉花分子育种工作提供一种新的遗传转化技术平台。