农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2020年第7期

• 小麦热激转录因子基因TaHsfA2-12的特性及耐热性调控功能

  苑赛男, 胡栋, 刘畅, 彭义峰, 张华宁, 张玉杰, 张园园, 于学超, 李国良, 郭秀林

  植物中的热激转录因子(heat shock transcription factors, Hsfs)在耐热性获得、耐热性传代记忆及其他胁迫过程中发挥重要的调控作用。本研究通过同源克隆技术从37 ℃热胁迫1.5 h的小麦(Triticum aestivum)幼叶中克隆获得一个新的基因TaHsfA2-12 (GenBank No. MK931301),其编码序列全长1 134 bp,编码377个氨基酸残基。蛋白质序列含DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD)、核定位信号序列RRKELAEALLSKKRGR、核输出信号序列LLSLGLE和激活域序列ESFWKELLSL。TaHsfA2-12蛋白质与粗山羊草(Aegilops tauschii)中AtHsfA2蛋白一致性高达98%。通过瞬时转化烟草(Nicotiana tabacum)表皮细胞并经4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色发现,正常条件下该蛋白定位于细胞核。qRT-PCR分析表明,正常生长条件下TaHsfA2-12在小麦幼嫩和成熟的根、茎、叶以及雌蕊、雄蕊、萼片、幼胚和成熟胚等多个组织中组成型表达,多数组织中表达量较低,成熟种子中表达量较高(P<0.05)。37 ℃热胁迫和20% PEG6000显著上调TaHsfA2-12的表达(P<0.05),水杨酸(salicylic acid, SA)和过氧化氢则下调该基因表达。表型观察显示,TaHsfA2-12不仅能提高热胁迫下转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株的基础耐热性和获得耐热性,还能恢复拟南芥缺失突变体AtHsfA2的耐热表型,不同株系叶绿素含量与表型相一致。不同热胁迫处理后,转基因拟南芥植株多个热激蛋白(heat shock protein, Hsp)基因的表达均高于野生型对照。本研究结果为深入研究小麦Hsfs家族基因特性与功能提供理论依据。

• 13个甘蓝型油菜GPATs编码基因的酵母遗传互补功能鉴定

  段芊芊, 林怡馨, 丁硕, 魏琳燕, 甘毅, 郑月萍, 刘宏波

  3-磷酸甘油酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferases, GPAT)是催化植物甘油脂从头合成第1步酰化反应的限速酶。分离和鉴定甘蓝型油菜(Brasscia napus)的GPAT编码基因将有助于深入解析种子中甘油脂的合成代谢机制。本研究通过反转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)扩增获得13个甘蓝型油菜中具有酰基转移酶保守结构域的候选编码基因,构建至酵母(Saccharomyces cerevisiae)异源表达载体yADH1-pYES2-Kan V2 (外源基因表达受葡萄糖诱导, 受半乳糖抑制)。重组酵母表达载体酶切和测序验证结果显示,克隆的13个基因片段大小和序列与预期相符;通过氨基酸序列比对分析,发现克隆基因编码的氨基酸序列分别含有1~2个跨膜结构域和4个酰基转移酶保守序列。进一步利用本实验室创建的高效条件致死型酵母双敲除突变体菌株ZAFU1筛选体系(BY4742, gat1Δgat2Δ+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2])进行遗传互补验证,结果显示,在葡萄糖诱导条件下,BnGPAT1-1、BnGPAT4-1、BnGPAT4-2和BnGPAT9-1基因的异源表达能恢复ZAFU1的生长,表明其具有类似酵母酰基转移酶编码基因YKR067w (命名为GAT1)的功能。本研究结果可为甘蓝型油菜含油量的遗传改良提供参考依据。

• 利用CRISPR/Cas9技术构建表达鲤长链脂肪酸延长酶5基因(Elovl5)的转基因斑马鱼

  王雅欣, 杨晨茹, 赵宇杰, 孙晓晴, 李尚琪, 张研, 刘英杰, 李炯棠

  CRISPR/Cas9技术广泛应用于基因敲除,利用敲入包含荧光蛋白和目标基因的片段,有助于早期筛选实验动物。长链脂肪酸延长酶5 (elongation of very long chain fatty acids 5, Elovl5)是鱼类调控高不饱和脂肪酸合成的关键酶之一。为在斑马鱼(Danio rerio)研究鲤(Cyprinus carpio) Elovl5活性,本研究构建包含Tol2序列、斑马鱼短链肌球蛋白2基因(myosin light chain 2, Mylz2)启动子、红色荧光蛋白基因(red fluorescence gene, DsRed2)、斑马鱼Elovl5启动子、鲤Elovl5基因、2A剪切肽和绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的载体,扩增获得一段长7.5 kb的片段。利用CRISPR/Cas9方法,将此片段敲入斑马鱼基因组。敲入成功的斑马鱼在受精72 h后开始于肌肉显红色荧光。对利用红色荧光筛选敲入成功的斑马鱼,进一步用PCR扩增DsRed2予以确证。在存活斑马鱼中,基因敲入阳性率为28.7%。相比对照组,仅在实验组观察到鲤Elovl5表达。实验组的18碳不饱和脂肪酸含量下降18.6%,20碳和22碳不饱和脂肪酸含量提高31.8%,其中20:4n-3不饱和脂肪酸含量是对照组的2.4倍(P<0.05)。本研究采用CRISPR/Cas9技术,构建转鲤Elovl5斑马鱼,提高了斑马鱼高不饱和脂肪酸含量,为进一步研究鲤不饱和脂肪酸合成的遗传机制提供基础。

• 转基因水稻筛查检测阳性质粒pUC18-RICE-screen的构建及分子评价

  马卉, 焦小雨, 许学, 李夏莹, 陈子言, 吴爽, 潘伟芹, 张秀杰, 汪秀峰

  标准物质是转基因生物安全监管和检验检测工作中进行质量控制的关键。目前,国内用于转基因检测的阳性对照资源匮乏,主要为基体标准物质,难以满足转基因生物安全监管和检测工作的需要。质粒标准物质作为转基因检测标准物质新的发展方向,具有广泛的应用价值。本研究通过收集整理相关数据库信息,获得了国内外19种主要转基因水稻(Oryza sativa)品系的遗传信息,全面分析其外源基因表达框中调控元件/基因的组成情况及使用频率,并结合目前现有转基因检测技术标准,确定了以水稻内标基因磷脂酶D基因(phospholipase D gene, PLD)、蔗糖磷酸合酶基因(sucrose phosphate synthase gene, SPS)和靶标基因CaMV35S启动子(35S promoter from Cauliflower mosaicvirus, PCaMV35S)、Ubiquitin启动子(ubiquitin promoter from maize, PUbiquitin)、CaMV35S终止子、NOS终止子(terminator of nopaline synthase gene, TNOS)、抗草丁膦除草剂基因(bialaphos resistance gene, Bar)、潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin phosphotransferase gene, HPT)、苏云金芽胞杆菌基因(Bacillus thuringiensis gene, Bt)等9个调控元件/基因用于构建阳性质粒pUC18-RICE-screen。该质粒通过人工合成技术获得,经酶切、测序、PCR验证,以及对检测不同筛查元件/基因的适宜质粒浓度进行综合评价,结果表明,该质粒可用于本研究所涉19个转基因水稻的筛查检测,且其作为阳性对照用于各筛查元件/基因PCR和qRT-PCR筛查检测的适宜浓度范围为1×103~1×105 copies/μL。本研究为转基因水稻安全监管提供了一种不依赖于转基因水稻原材料的阳性对照,也为解决转基因水稻阳性标准品匮乏问题供了技术支持。

• 小麦-黑麦1RS-1BS/1BL小片段易位系抗赤霉病鉴定及分子细胞遗传学分析

  吕婷婷, 张珍悦, 姚晓妮, 张寒冰, 李家创, 刘淑会, 杨群慧, 武军, 陈新宏

  赤霉病(Fusarium head blight, FHB) 是小麦的主要病害之一,对小麦(Triticum aestivum; 2n=6x=42, AABBDD)正常生长和产量造成了严重的威胁。黑麦(Secale cereal; 2n=2x=14, RR) 具有发达的根系以及较强的抗逆性与抗病性,是改良小麦性状的重要遗传资源。为了提高小麦抗赤霉病的能力,本实验通过墨西哥黑麦与普通小麦W770B杂交,经多代选育获得了一批能够稳定遗传的衍生后代。在小麦扬花期,采用单花滴注法(single flower inoculation, SFI)对亲本及其衍生后代进行赤霉病抗性鉴定,结果显示亲本黑麦对赤霉病表现中抗,W770B表现高感,衍生后代12-5-1表现中抗。进一步通过基因组原位杂交(genome in situ hybridization, GISH)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、特异序列扩增分子标记(sequence characterized amplified regions, SCAR)、简单重复序列分子标记(simple sequence report, SSR)对中抗赤霉病的衍生后代12-5-1进行形态学及细胞遗传学的鉴定与分析。结果表明：12-5-1根尖细胞中含有42条染色体2n=42;花粉母细胞减数第一次分裂中期,染色体能正常配对形成21个二价体2n=42=21Ⅱ,并且能正常分离。以黑麦基因组为探针对12-5-1进行GISH鉴定,观察到小麦的2条染色体端部有黄绿色信号,说明小麦染色体与黑麦染色体发生了易位;FISH鉴定表明12-5-1中易位染色体为小麦的1BS与黑麦的1RS发生了易位;因此推断小麦与黑麦杂交发生了染色体小片段易位。利用黑麦特异性标记AF1/AF4与1RS的SCAR标记进行鉴定,结果只在黑麦和衍生后代12-5-1中扩增出相应的条带; SSR分析结果显示小麦1BS染色体上的3对引物(Xgwm11、Xgwm31、Xgwm550)不能在12-5-1中扩增出目标条带,其余引物均能扩增出相应的目标条带,表明12-5-1是一个1RS-1BS/1BL的小麦-黑麦小片段易位系。该抗病衍生后代的创制为小麦抗赤霉病育种提供了新的种质资源。

• 转GmWRKY70基因大豆的PCR检测及其T-DNA侧翼序列分析

  杨清华, 董德坤, 操晶, 梅娜, 陈芬, 胡兴旺, 朱丹华

  对转基因株系的PCR检测以及对T-DNA侧翼基因组序列的深入分析,可以充分了解转基因株系的特异性分子特征。本研究利用农杆菌(Agrobacterium)介导的大豆(Glycine max)子叶转化方法,获得了3个转GmWRKY70基因的大豆株系。本研究对除草剂抗性基因(bialaphos resistance, Bar)、目标基因GmWRKY70以及载体构建特异性片段进行PCR检测,利用高效热不对称交错PCR (high-efficient thermal asymmetric interlaced PCR, Hi-TAIL PCR)对T-DNA侧翼序列进行整合位点分析。结果表明,3个转GmWRKY70基因的大豆株系均为阳性株系。T-DNA在43 119 699~43 119 712 bp之间反向整合到大豆染色体Chr07中。T-DNA整合导致大豆染色体Chr07插入位点12 bp缺失。对于引入的T-DNA,发现左边界(left border, LB)的80 bp序列和右边界(right border, RB)的22 bp序列被截短。在导入的LB端和大豆基因组DNA的整合位点上发现了两个碱基对的微同源性,而RB未发现同源性。本研究设计新的整合位点特异性引物,并验证这种转化事件,为促进分子辅助选择在育种计划中的应用提供了资料基础。

• 血橙果肉MYB转录因子的克隆与表达分析

  夏荣娜, 李凛, 杨鑫, 王建辉

  花青苷是一种高活性的黄酮多酚类化合物,广泛存在于各种植物中。MYB转录因子调控植物体内花青苷生物合成。本研究从血橙(Citrus sinensis)果肉中克隆了MYB转录因子,并进行生物信息学分析及基因表达研究;同时,构建原核表达载体PET28-CsMYB,所获得重组蛋白经新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus)免疫制备多克隆抗体,进而使用Western blot技术分别检测了不同样本之间MYB的差异表达。研究结果表明,血橙MYB型转录因子的核酸全长表达序列为789 bp,编码262个氨基酸,编码蛋白的1~56位与57~111位氨基酸分别具有MYB保守结构域R2和R3,将其命名为CsMYB (GenBank No. KT757348)。将不同植物来源的MYB氨基酸全长序列进行多重比对分析并构建系统进化树,结果表明,CsMYB编码蛋白与已报道的荔枝(Litchi chinensis)花青苷调控蛋白(LcMYB1)聚在同一个进化支上,两个蛋白的氨基酸序列同一性为56.1%。对血橙不同组织进行基因差异表达分析,结果显示,CsMYB在果肉组织中高表达;同时参与花青苷生物合成与运输途径的查尔酮合成酶基因(chalcone synthase, CHS)与谷胱甘肽巯基转移酶基因(glutathione S-transferase, GST)在果肉中也呈现高表达;CsMYB基因表达随着果实发育与成熟而逐渐升高;与低花青苷含量的血橙芽变突变体比较,正常花青苷积累的果肉组织中CsMYB基因表达更高,并且CHS表达变化趋势与CsMYB一致。Western blot结果表明,只在血橙果肉样本中有36 kD的MYB蛋白杂交条带。综上所述,CsMYB可能参与调控血橙果肉花青苷的生物合成,本研究可为血橙果实着色机制研究与遗传育种提供参考依据。

• 陆地棉胆色素原脱氨酶基因的克隆及表达分析

  陈义珍, 李浩, 傅明川, 王立国, 刘任重, 柳展基

  叶色突变体是研究高等植物叶绿素代谢、叶绿体发育、光合作用和激素生理等一系列生理代谢过程的理想材料,也是遗传和育种研究中的重要材料。胆色素原脱氨酶(porphobilinogen deaminase, PBGD)是植物叶绿素生物合成的关键酶。本研究以陆地棉(Gossypium hirsutum) '鲁棉418'的花斑叶突变体为材料,克隆了4个GhPBGDs,分别命名为GhPBGD1A (GenBank No. MN849924)、GhPBGD1D (GenBank No. MN849925)、GhPBGD2A (GenBank No. MN849926)和GhPBGD2D (GenBank No. MN849927)。测序结果表明,正常叶片与花斑叶片中的4个基因序列相同;4个基因均含有5个外显子和4个内含子,预测结果均定位于叶绿体;进化分析表明,GhPBGD蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和油菜(Brassica napus)的PBGD同源蛋白亲缘关系较近。另外,4个基因启动子顺式作用元件中含有光响应元件、厌氧环境及多种激素相关的应答元件。qRT-PCR结果表明,4个GhPBGD基因在正常棉株的叶、花、铃和苞叶中均有表达,其中在叶片中的表达量最高;与正常叶相比,花斑叶中GhPBGD基因的表达量都显著降低。以上结果表明,GhPBGD基因家族可能参与调控叶色突变。本研究可为深入探讨叶色缺失突变体的分子机理提供参考依据。

• 陆地棉胁迫相关蛋白基因GhSAP8的克隆及其耐盐性分析

  王亦学, 董艳辉, 张欢欢, 郝曜山, 孙毅, 吴慎杰

  胁迫相关蛋白(stress associated proteins, SAPs)是具有A20结构域和(或) AN1结构域的一类锌指蛋白,广泛参与植物对逆境胁迫的响应。本研究通过同源克隆的方法获得陆地棉(Gossypium hirsutum) GhSAP8基因(GenBank No. XM_016813997.1),全长519 bp,编码172个氨基酸,预测蛋白分子量为18.22 kD,等电点为7.51。GhSAP8包含1个A20和1个AN1结构域,是典型的SAP蛋白结构域组合方式。qRT-PCR检测结果显示,GhSAP8基因在叶片中表达量最高,盐胁迫处理使该基因表达量增加,提示其可能参与盐胁迫响应。将GhSAP8基因构建到植物表达载体pCAMBIA1300并进行拟南芥(Arabidopsis thaliana)转化,在150 mmol/L NaCl处理条件下,过表达GhSAP8的拟南芥存活率(53%~70%)显著高于野生型对照(27%),表明过量表达该基因可提高拟南芥的耐盐能力。另外,在盐胁迫条件下,盐胁迫相关应答基因Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase 1, AtP5CS1)、脱水诱导基因(responsive to desiccation 29 B, AtRD29B)、盐超敏感基因(salt overly sensitive 1, AtSOS1)和Na+/H+转运蛋白基因 (sodium/hydrogen exchanger 1, AtNHX1)在转基因拟南芥中的基因表达量均显著高于野生型对照;而非盐胁迫条件下,转基因拟南芥中仅部分株系的AtP5CS1、AtRD29B和AtSOS1基因表达量高于野生型对照。上述结果提示,GhSAP8基因可能通过调控盐胁迫响应基因的表达来增强拟南芥的耐盐能力。本研究可为培育耐盐的转基因棉花提供候选基因。

• NLS-GFP融合基因植物表达载体的构建与应用

  栾宏瑛, 陈爱娥, 王荟洁, 刘晶, 王洪洋, 李灿辉

  植物细胞高度分隔成不同的膜亚细胞结构,在不同的地点适当地装配相关的蛋白来执行特定的细胞反应。细胞核是细胞的控制中心,以高度协调的方式进行蛋白质表达和运输。细胞核定位信号(nuclear localization signal, NLS)能够促进蛋白定位于细胞核中,对研究蛋白的细胞生物学功能有重要作用。基于目前NLS植物表达载体存在局限性,本研究用无缝克隆技术,将NLS与绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein gene, GFP)融合,插入植物双元表达载体pRI101-AN中,获得一个新的pRI101-NLS-GFP植物表达载体。利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导瞬时表达体系在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中表达pRI101-NLS-GFP,以未融合NLS的pRI101-GFP为对照,荧光观察表明NLS-GFP融合蛋白主要聚集在细胞核,而pRI101-GFP荧光遍布整个细胞。同时利用马铃薯晚疫病致病疫霉菌(Phytophthora infestans)分泌的精氨酸-某氨基酸-亮氨酸-精氨酸(arginine-x-leucine-arginine, RXLR)效应蛋白PITG_04314 (PITG: Phytophthora infestans T30-4 gene, GenBank No. XM_002905913)进一步研究该载体是否将融合蛋白成功导入细胞核中。前期研究证明PITG_04314定位于细胞核,伴有细胞质的背景,而细胞核是其毒性功能的主要场所。为进一步证实PITG_04314的细胞定位,通过无缝克隆技术将PITG_04314融合到pRI101-NLS-GFP和pRI101-GFP中。发现与前期研究结果一致,GFP-PITG_04314定位于细胞核,伴有细胞质的背景,而NLS-GFP-PITG_04314聚集于细胞核中。瞬时超量表达GFP-PITG_04314和NLS-GFP-PITG_04314都能促进晚疫病的侵染,表明细胞核是PITG_04314发挥毒性的场所。研究结果表明,基于无缝克隆技术的NLS-GFP融合基因植物表达载体系统可以使目标蛋白定位于细胞核中。该载体有望在病原菌蛋白细胞生物学功能研究中得到广泛应用。

• 基于高通量测序的晒塘前后鳗鲡养殖池塘微生物群落结构差异分析

  王瑞宁, 王淼, 黄秋标, 衣萌萌, 李忠徽, 李庆勇, 朱德兴, 卢迈新

  晒塘能够杀灭池塘中的有害微生物,分解底泥中的有机物,是池塘养殖中最常用的一种修复手段。为了解晒塘前后池塘生态系统中微生物的多样性、分布和功能,本研究以鳗鲡(Anguilla japonica)养殖池塘为研究对象,通过测定晒塘前后鳗鲡养殖池塘水体和底泥中的氨氮(NH4+)、亚硝酸盐(NO2-)、硝酸盐(NO3-)、总氮(total nitrogen, TN)和总磷(total phosphorus, TP)等理化指标,以及高通量测序分析池塘水体和底泥中的微生物群落结构在晒塘前后的变化,探讨晒塘对池塘养殖环境及其微生物群落结构的影响。结果表明：晒塘对鳗鲡养殖池塘水体中NO2-、NO3-、TN和TP含量的下降有显著的积极作用(P<0.05),对底泥中TP含量的下降亦有显著的积极作用(P<0.05)。高通量测序分析显示,晒塘之后,养殖池塘水体和底泥中均以变形菌门(Proteobacteria)为主,在物种门水平上,变形菌门(Proteobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)等有益菌群增加,蓝菌门(Cyanobacteria)等有害菌群减少;在物种属水平上,新鞘氨醇杆属(Novosphingobium)、沉积物杆状菌属(Sediminibacterium)、Limnohabitans、红杆菌属(Rhodobacter)等有益菌群增加,微囊藻(Microcystis)、Ellin6067等有害菌群下降。本研究表明,晒塘能够改变水体和底泥中微生物的群落结构,对池塘环境修复有显著成效,为今后改善养殖池塘环境提供理论参考。

• 基于微卫星亲权鉴定对钱塘江中下游三角鲂增殖放流效果的研究

  张敏莹, 王邢艳, 张婉平, 童奇烈, 方弟安, 周彦锋, 徐东坡

  三角鲂(Megalobrama terminalis)经济价值高,是我国重点提倡大水面增养殖的优良品种,也是钱塘江流域重要的渔获种类。近年由于过度捕捞、环境破坏、水域污染、水工建设和运输等原因,其天然资源衰退严重。本研究基于微卫星标记的亲权鉴定技术,选用12对扩增效果好的微卫星荧光标记引物,对来自4个良种场的301尾亲本和371尾回捕三角鲂个体进行了基因分型和多态性分析。研究结果表明,各位点等位基因数为15~68,观测杂合度为0.244~1.00 (平均值为 0.757),期望杂合度为0.726~0.969 (平均值为0.863),12个位点均表现为高度多态性(PIC>0.5),多态信息含量为0.693~0.967 (平均值为0.849)。其中有4个微卫星位点的无效等位基因频率大于0.2,为避免影响模拟亲子鉴定分析,其数据不参加后续软件分析。统计得出8个微卫星座位累计亲权排除率为99.997 5%。亲子鉴定结果表明,在371尾回捕三角鲂中有4尾与亲本之间存在亲子关系,被确认来源于三角鲂增殖放流群体,由此推算出放流群体对自然资源的贡献率为1.08%。本研究结果对钱塘江三角鲂资源保护和指导其科学增殖放流具有重要意义。

• 转cry1Ab/cry2Aj和g10evo-epsps基因玉米双抗12-5对家蚕的安全性评价

  祝旋, 姜媛媛, 来勇敏, 陈笑芸, 汪小福, 徐晓丽, 徐俊锋

  对非靶标生物可能造成的影响是转基因作物(如转Bt基因玉米(Zea mays))环境安全性评价的重要方面。由于家蚕(Bombyx mori)与转Bt基因玉米的靶标害虫具有较近的亲缘关系,转Bt基因玉米有可能通过花粉飘落到邻近地块的桑叶上从而对家蚕产生影响。本研究通过室内生测的方法评价了转cry1Ab/cry2Aj基因玉米'双抗12-5'花粉对家蚕生长发育和生殖的潜在影响。实验采用在桑(Morus alba)叶上涂抹不同浓度的转基因玉米'双抗12-5'或其非转基因对照玉米花粉饲喂家蚕。结果表明,当桑叶上转基因玉米'双抗12-5'花粉达40 g/L (10000粒/cm2)时,家蚕的存活率显著下降,并在喂食8 d后全部死亡,而0.4 g/L(100粒/cm2)和4 g/L(1000粒/cm2)花粉处理对家蚕的存活率无显著影响。与无花粉处理和非转基因亲本对照花粉处理相比,0.4 g/L和4 g/L转基因玉米花粉处理使各龄期家蚕的体重显著降低,发育历期显著延长,但对家蚕化蛹率、羽化率、茧重、蛹重、茧层重和产卵量无显著影响。对5龄期家蚕体内抗氧化酶活性的检测显示转基因玉米'双抗12-5'处理组超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)和过氧化氢酶(hydrogen peroxide, CAT)酶活性显著升高,且花粉浓度越高酶活性越高。以上实验结果表明转基因玉米'双抗12-5'在桑叶表面的分布达100粒/cm2时对家蚕的生长产生影响,并且密度越高影响越大,但是在实际生产过程中,受距离、天气条件、花期等各种环境因素的影响,桑叶上漂移沉积的玉米花粉数量达不到实验所用的密度,因此转Bt基因玉米的种植对家蚕养殖风险较低。本研究为评价转基因抗虫玉米对家蚕的潜在风险提供理论依据。

• 普氏野马两种肠道寄生虫ITS序列的扩增与分析

  李乔, 赵建友, 杜晓华, 卢伟, 张春林, 董建英, 温永强, 周应杰, 刘霞

  普氏野马(Equus ferus ssp. przewalskii)作为一种濒危保护动物,其健康成长和种群数量的扩大对种质资源保护具有特殊价值,其体内寄生虫可对机体产生不同程度的病理损害。本研究拟鉴定国家林业局甘肃濒危动物保护中心普氏野马肠道内寄生虫的种类,首先分离普氏野马群体驱虫后粪便中的虫体,进行形态学特征初步鉴定,之后运用生物信息学方法对扩增虫体的内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列进行比对。结果显示,普氏野马肠道共分离出2种虫体,形态学鉴定初步推断为马副蛔虫(Parascaris equorum)和杯环属线虫(Cylicocyclus sp.),分别命名为PE和CN;PE虫体ITS区全长865 bp (GenBank No. MT579850),其中ITS-1、5.8S rDNA和ITS-2的长度分别为421、156和288 bp,其与马副蛔虫的同源性为99.88%;CN虫体ITS区全长843 bp (GenBank No. MT581488),其中ITS-1、5.8S rDNA和ITS-2的长度分别为370、153和320 bp,与鼻状杯环线虫(Cylicocyclus nassatus)的核酸序列同源性为99.41%。上述结果表明,普氏野马体内获取的PE虫体为马副蛔虫、CN虫体为鼻状杯环线虫。本研究结果可为普氏野马的健康圈养提供参考依据。

• 小麦叶锈菌10个候选效应蛋白特点及其qRT-PCR分析

  张悦, 李建嫄, 张娜, 魏学军, 杨文香, 刘大群

  由小麦叶锈菌(Puccinia triticina, Pt)引起的小麦叶锈病是影响小麦(Triticum aestivum)稳产高产的一类重要病害。Pt产生的吸器是产生效应蛋白的主要场所,而效应蛋白是Pt致病的关键。为明确这些效应蛋白在与寄主互作过程中的表达特性,本研究在利用转录组测序获得635个小麦叶锈菌候选效应蛋白的基础上,从中随机选取了10个候选效应蛋白进行结构及qRT-PCR分析。结果发现这些蛋白符合真菌效应蛋白的基本结构特性,并且与已经报道的小麦叶锈菌生理小种BBBD和小麦秆锈菌(P. graminis f.sp. tritici)高度同源,其中3个基因含有已知的保守结构域[Y/F/W]xC,1个含有[L/I]xAR结构域,2个蛋白具有糖基水解活性,1个蛋白具有双加氧酶活性。qRT-PCR分析发现,有6个候选效应蛋白表现为后期诱导上调表达,有4个基因分别在6~48 hpi呈现前期诱导上调表达。研究结果为揭示小麦与叶锈菌的互作机制奠定了基础,同时更利于小麦叶锈菌效应蛋白的深入研究。

• 玉米大斑病菌GATA转录因子氮源响应表达模式分析

  王建霞, 王擎, 赵玉兰, 李天聪, 龙凤, 朱行, 申珅, 郝志敏

  GATA转录因子家族含有锌指蛋白保守结构域,能够识别并结合5'-(A/T)GATA(A/G)-3'基序,从而调控真核生物多种功能基因的转录及表达,与病原真菌的生长发育、氮源利用等密切相关。为探索玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica) GATA转录因子家族功能,本研究利用Softberry数据库(http://linux1.softberry.com/berry.phtm)对玉米大斑病菌的GATA转录因子家族进行基因结构、保守结构域及启动子预测;利用qRT-PCR技术检测氮源浓度水平及种类对该家族成员基因转录水平的影响。结果表明,玉米大斑病菌GATA转录因子家族共有7个成员。与KNO3为氮源相比,在NH4Cl为唯一氮源的培养基中,菌丝生长速率加快且分生孢子产量降低了15倍左右,7个GATA转录因子转录水平上调2~4倍;与正常氮源水平的理查培养基相比,KNO3含量为0时,菌丝生长速率升高且分生孢子产量降低约10倍,同时,GATA转录因子均出现20~40倍的表达上调,说明氮限制条件下高度诱导了GATA转录因子的表达。以上结果初步明确了GATA转录因子对于氮代谢的响应,揭示了氮的有效性及GATA转录因子在玉米大斑病菌发育中的调控作用,为玉米大斑病的防治提供了新的思路。

• 利用CRISPR/Cas9系统构建猪MUC4和SLC12A8基因打靶载体

  王文文, 俞英, 张勤

  产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) F4ac是引起新生仔猪(Sus scrofa)腹泻的一种主要病原菌。黏蛋白4 (mucin 4, MUC4)和溶质运载蛋白家族12成员8 (solute carrier family 12 member 8, SLC12A8)基因是影响仔猪对ETEC F4ac 易感性的候选基因,且这两个基因的物理位置位于数量性状基因座(quantitative trait locus, QTL)定位的F4ac受体基因区段内。本研究采用CRISPR/Cas9系统,分别构建了5个和6个MUC4及SLC12A8基因敲除载体。首先以猪MUC4和SLC12A8基因为靶点,分别设计合成5对和6对单导向RNA (single guide RNA, sgRNA),并插入到pX330质粒。将测序成功的载体对猪的小肠上皮细胞系IPEC-J2进行基因打靶,T7E1酶切实验证明MUC4和SLC12A8分别有3个和5个打靶载体具有基因敲除活性。其中MUC4的3个打靶载体的切割效率依次是8.4%、6.7%和6.2%,SLC12A8的5个打靶载体的切割效率依次是18.8%、19.1%、12.2%、18.1%和13.1%。利用Western blot进一步检测打靶后目的蛋白表达情况,结果表明pX330-MUC4-3、pX330-MUC4-4和pX330-MUC4-5打靶使目的蛋白表达有不同程度的降低,其中pX330-MUC4-4敲除效率最高。而SLC12A8的5个打靶载体中,pX330-SLC12A8-2、pX330-SLC12A8-5和pX330-SLC12A8-6打靶使目的蛋白表达有不同程度的降低,其中pX330-SLC12A8-5敲除效率最高。本研究为后续获得猪MUC4及SLC12A8基因缺失型细胞株提供实验材料和技术支撑,为进一步研究基因功能提供基础材料。

• 酸疮痂链霉菌实时荧光定量PCR检测体系的构建及应用

  陈利达, 谢学文, 石延霞, 柴阿丽, 潘好芹, 李磊, 李宝聚

  马铃薯疮痂病是国内外马铃薯(Solanum tuberosum)产区普遍发生的病害,严重影响马铃薯的产量和质量。本研究以马铃薯疮痂病病原菌—酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)的毒素基因序列设计特异性引物Aci-3/4,从酸疮痂链霉菌基因组DNA中特异性扩增出大小为192 bp的目的片段。灵敏度检测表明,建立的酸疮痂链霉菌实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qPCR)检测体系的灵敏度是常规PCR的1 000倍。对测试样品基因组DNA进行扩增的结果表明,qPCR检测病薯和病土DNA扩增的循环阈值(cycle threshold, Ct)均在25~32,而常规PCR未检测到病土DNA条带。本研究建立的酸疮痂链霉菌实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速、准确地检测马铃薯带菌病薯和土壤中酸疮痂链霉菌含量,可为马铃薯疮痂病早期监测和有效防治提供有效的技术手段。

• 日本脑炎病毒NS1蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立

  杨克露, 裴超, 刘朝霞, 周登元, 曹胜波, 陈焕春, 宋云峰

  日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是危害人民健康的一种重要人畜共患病原,仍然缺乏敏感性高的抗原检测方法。NS1蛋白是JEV表达的一种分泌性蛋白,是该病毒诊断的理想靶标。本研究用构建的非结构蛋白1 (non-structural protein 1, NS1)单克隆抗体,建立了可检测NS1蛋白的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(double antibody sandwich ELISA, DAS-ELISA)方法。用针对JEV NS1蛋白不同位点的单克隆抗体杂交瘤细胞株(5H2和2F6)制备腹水,经Protein G纯化后,以5H2包被酶标板作为捕获抗体,HRP标记的2F6为检测抗体。ELISA条件优化的结果显示,捕获抗体和酶标抗体最佳浓度分别为25和2.296 μg/mL。用该方法检测系列稀释的NS1蛋白,蛋白浓度范围在78.125~625.000 ng/mL时,检测OD450值和蛋白浓度之间具有良好的线性关系,说明该方法可用于NS1蛋白的定量检测。用该方法检测猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒等均显示阴性,说明特异性良好。重复性试验结果显示,该方法批内重复性为0.7%~2.6%,批间重复性为0.6%~2.1%。用该方法检测了JEV感染的小鼠(Mus musculus)脑组织匀浆,在小鼠发病期可明显检测到NS1蛋白。本研究建立了检测JEV NS1蛋白的ELISA方法,为该病毒的诊断提供了一种工具。