农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2023年第10期

• 小麦粒重关键数量性状位点qTkw-2D遗传效应分析

  张娜, 张帅, 支丽雅, 宋利强, 刘东涛, 马红勃, 纪军

  小麦(Triticum aestivum)粒重遗传力高、表型稳定,高产育种过程中对粒重的选择效果显著。本研究在前期基因定位的基础上,获得了多环境稳定粒重QTL-qTkw-2D,且该位点在多个群体中被报道。本研究利用与qTkw-2D紧密连锁的分子标记Xcfd233对3 000份育种高代系进行筛选,结合Wheat660K SNP芯片分型,在'科农2011'的F6代获得了qTkw-2D近等基因系。通过对近等基因系籽粒切片的皮层细胞大小分析,明确了qTkw-2D主要通过影响皮层细胞大小影响粒宽。灌浆速率分析结果显示,qTkw-2D主要通过影响中后期灌浆速率影响粒重。对近等基因系多年多地单株及小区水平的粒重和产量进行分析,明确了qTkw-2D位点A单倍型可稳定增加粒重,且在歉收环境对小麦稳产具有重要意义。本研究为小麦粒重遗传改良和粒重功能基因挖掘提供了参考。

• 小麦耐热基因TaHsp17.9的表达分析及功能鉴定

  曾润娴, 邬陈芳, 郭林林, 李杰, 冯永佳, 李培华, 王长发, 韩德俊, 郑炜君

  小麦(Triticum aestivum)是我国重要的粮食作物之一,高温等非生物胁迫严重影响小麦的产量和品质,发掘与鉴定抗逆基因,可以为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。热激蛋白(heat shock proteins, Hsps)是一类在应激条件下维持细胞功能的重要分子伴侣,是一类重要的耐热候选基因。本研究以耐热品种'平遥小白麦'的cDNA为模板,通过PCR扩增得到了小麦TaHsp17.9基因(GenBank No. MN684335)。该基因CDS全长474 bp,编码157个氨基酸。蛋白序列含有植物小热激蛋白 (small heat shock protein, sHsp)特异性的α-晶体蛋白结构域(α-crystallin domain, ACD)。系统进化树分析表明,TaHsp17.9与二粒小麦 (Triticum dicoccoides)的遗传距离最近。qPCR结果显示,TaHsp17.9基因在籽粒中表达量最高,在根中表达量最低。TaHsp17.9受高温和干旱胁迫诱导表达,其表达量分别在1和2 h达到峰值。高温胁迫下,该基因在耐热品种的表达量显著高于热敏感品种。亚细胞定位结果显示,TaHsp17.9蛋白定位在细胞质。对拟南芥(Arabidopsis thaliana) TaHsp17.9过表达株系进行耐热性鉴定,结果显示,TaHsp17.9过表达可以显著提高转基因拟南芥的耐热性。此外,基于STRING数据库筛选到10个可能与TaHsp17.9发生相互作用的候选互作蛋白。本研究结果为深入研究TaHsp17.9基因的功能提供了参考。

• 秸秆还田配施氮肥早期对水稻生长、土壤性质及微生物多样性的影响

  罗嘉润, 宋文杰, 刘伟, 张大弘, 江勋, 卢碧林

  为探究秸秆还田条件下氮肥配施对土壤-水稻(Oryza sativa)微生物系统的影响,以平衡施氮早期秸秆腐解和水稻生长争氮的影响,本研究基于小区试验,以不施肥处理为对照(CK),基肥设置5种碳酸氢铵与复合肥配施处理：100%复合肥处理(S0)、20%碳铵+80%复合肥(S1)、40%碳铵+60%复合肥(S2)、60%碳铵+40%复合肥(S3)和80%碳铵+20%复合肥(S4);以研究氮肥配施6 d后对水稻生长、土壤性质和微生物多样性的影响。结果表明,氮肥配施早期,土壤有机质、pH值、有效磷和速效钾随配施碳铵的增加呈下降趋势,而铵态氮、硝态氮含量呈上升趋势;水稻植株的地上、地下部鲜重、根表面积、根体积和植株碳氮积累量呈现先增加后降低的趋势,除地下部鲜重,处理S2最高,且与其他处理差异显著(P<0.05);土壤细菌、真菌群落的Chao1指数和Shannon指数呈先下降后上升的趋势,以处理S2最低,其中与氨氮相关的氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)、氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)群落,各处理差异不显著;β多样性指数,土壤细菌独占操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)数目以处理S2、S4较高,而真菌独占OTU数目以处理S2最低;土壤优势细菌门为绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteriota),其中处理S2提升了放线菌门的相对丰度,降低了绿弯菌门、变形菌门和酸杆菌门相对丰度,均达显著水平;土壤优势真菌门为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota);经冗余分析(redundancy analysis, RDA)分析,放线菌门、担子菌门与土壤速效氮含量、水稻生长指标显著正相关,变形菌门、子囊菌门与土壤有效钾、土壤有机质、有效磷含量显著正相关,与水稻生长指标显著负相关,绿弯菌门与土壤pH显著正相关,以处理S2与放线菌门最为明显;奇古菌门(Thaumarchaeota)与水稻生长指标、铵态氮、易氧化有机碳、溶解有机碳显著正相关,与pH、硝态氮、有效磷和有效钾显著负相关。秸秆还田下合理配施氮肥方式S2能平衡土壤微生物和水稻对养分的需求。本研究对指导秸秆还田下合理配施氮肥提高土壤肥力和促进作物生长均具有指导意义。

• 烟草NtNRAMP2基因的鉴定及其在镉吸收中功能分析

  杨园园, 程岚, 许佳迪, 李燕燕, 邓兆龙, 郝浩浩, 王平平, 金维环, 郭红祥

  自然抗性相关巨噬细胞蛋白(natural resistance associated macrophage proteins, NRAMPs)在金属跨膜转运中起重要作用。为了研究烟草(Nicotiana tobacum) NRAMP基因在重金属镉(Cd)吸收和转运中的作用,本研究从栽培烟草'K326'中克隆到1个NRAMP亚家族基因,命名为NtNRAMP2 (GenBank No. OP972862);对其进行生物信息学分析和亚细胞定位,并使用qPCR分析其组织表达特异性、外源Cd、脱落酸(abscisic acid, ABA)以及乙烯处理的表达情况。结果表明,NtNRAMP2基因CDS全长为1 629 bp,编码542个氨基酸,包含4个外显子和10个跨膜结构域。进化分析显示其与番茄(Lycopersicon esculentum)和马铃薯(Solanum tuberosum)亲缘关系最近,亚细胞定位于内质网和液泡中。qPCR结果显示,NtNRAMP2基因在烟草不同组织中均有表达,但在根中表达量最高。在不同浓度和时间镉胁迫诱导下,NtNRAMP2表达量都显著升高(P<0.05),外源ABA和乙烯都能诱导烟草根中NtNRAMP2基因表达。同时,构建NtNRAMP2过表达载体,通过农杆菌(Agrobacterium tumefacien)介导转化烟草'K326'并获得18株NtNRAMP2过表达转基因烟株。本研究为进一步探讨NtNRAMP2基因功能提供了参考。

• AcTPR2基因诱导猕猴桃采后对灰霉病的抗性与木质素含量的关系

  李哲馨, 任云, 李强, 决登伟, 唐建民, 宋洪元

  猕猴桃(Actinidia chinensis)是我国山区农民脱贫致富的支柱产业之一。由灰霉菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病极易造成猕猴桃采后腐败,严重制约着猕猴桃产业的发展。研究表明细胞壁的木质化是植物产生抗性的主要机制之一。本课题组前期采用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术获得了沉默表达TOPLESS/TOPLESS-RELATED (TPL/TPR)家族AcTPR2基因的猕猴桃果实。基于此,本研究以灭菌水处理的猕猴桃(WT)、转化未连接AcTPR2基因的空载体组(Tobacco rattle virus, TRV)以及成功实现AcTPR2基因下调表达的转基因组(AcTPR2-TRV)猕猴桃为实验材料,通过检测灰霉菌侵染前后猕猴桃的木质素含量及其合成途径关键酶基因的表达量,探究AcTPR2基因诱导猕猴桃果实对灰霉病的抗性与木质素含量的关系。结果显示,与对照组相比,灰霉菌侵染猕猴桃果实后24~48 h即检测到木质素含量显著增加(P<0.05),说明木质素的积累在猕猴桃抵御灰霉菌侵染的前期就参与了抗病反应,猕猴桃木质素合成途径关键酶苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)基因、肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase, C4H)基因、香豆酸-3-羟化酶(coumaric acid 3-hydroxylase, C3H)基因及肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase, CCR)基因的表达与木质素含量增加趋势相一致;AcTPR2-TRV2组猕猴桃木质素含量及相关基因的表达量在转化成功后24 h即较对照组显著增加(P<0.05),表明在AcTPR2基因沉默后,猕猴桃果实更加迅速地激活了木质素合成信号通路,以加速合成木质素参与猕猴桃对灰霉病的抗性响应。因此,AcTPR2调控的猕猴桃果实细胞壁的木质化与猕猴桃灰霉病的抗性响应有关,是猕猴桃抗病反应的机制之一。研究结果从理论上丰富了猕猴桃的抗病调控机制,也为实践中猕猴桃的抗病分子育种提供重要的基因资源信息。

• 毛竹热休克蛋白70 (HSP70)基因家族的鉴定与表达模式分析

  赵锐, 董茗秀, 陈安静, 高燕丽

  热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70)是一类广泛存在于生物体中的蛋白分子伴侣,在生长发育等过程中具有重要作用。HSP70在毛竹(Phyllostachys edulis)生长发育中的作用尚未见报道。本研究通过生物信息学方法从毛竹基因组中鉴定HSP70基因家族成员,分析其蛋白理化性质、保守基序和基因结构,解析其染色体定位和启动子区域顺式作用元件,构建系统进化树;基于转录组数据和qRT-PCR分析不同生长高度毛竹的HSP70基因表达水平,并对关键的HSP70进行亚细胞定位验证。结果显示,共鉴定出40个毛竹HSP70基因家族成员(PeHSP70-01~40),其中39个为亲水性蛋白,21个含有1个内含子;顺式作用元件分析发现,毛竹HSP70基因启动子中脱落酸相关响应元件最多;系统进化树结果显示,PeHSP70共分为4个亚家族,与水稻(Oryza sativa)亲缘关系更近。转录组数据分析发现,11个PeHSP70基因在毛竹快速生长发育过程中上调表达。qRT-PCR结果显示,4个预测定位于线粒体的基因PeHSP70-23~26在毛竹细胞伸长节中上调表达,进一步的亚细胞定位实验证实其与线粒体共定位。本研究为深入探讨HSP70基因家族在调控毛竹快速生长中的作用机制提供参考。

• 闽楠NRT/NPF基因家族鉴定与表达分析

  李翼贝, 童再康, 韩双, 王立, 韩潇, 张毓婷, 杨琪, 黄华宏, 张俊红

  氮素作为植物不可或缺的大量元素,其含量显著影响植物生长发育,其中硝态氮为闽楠(Phoebe bournei)等诸多陆生植物氮素吸收的主要形式,对硝酸盐转运蛋白(nitrate transporter/peptide transporter family, NRT/NPF)基因家族鉴定与表达分析具重要意义。本研究利用拟南芥(Arabidopsis thaliana) NRT蛋白序列和隐马科夫模型(PF00854, PF07690和PF16974)在闽楠全基因组鉴定出63个NRT/NPF家族成员,不均匀分布于11条染色体,其分子量为22.8~135.6 kD,等电点为5.44~9.41,编码205~1 235个氨基酸,其编码蛋白多为碱性蛋白,且含有2~23个跨膜结构域;系统进化分析将63个PbNRT/NPF分为3个亚家族,其中60个属于NRT1/NPF亚家族,2个属于NRT2亚家族,1个属于NRT3亚家族。共线性分析表明,PbNRT/NPF发生了9个串联重复事件和10个片段重复事件。转录组数据和qRT-PCR分析均表明,PbNRT/NPF成员在叶、根皮部、根木质部、茎皮部和茎木质部5种组织中的表达模式存在显著差异,其中硝酸盐转运蛋白基因PbNPF6.3在根皮部表达显著高于其他组织。qPCR结果表明,PbNRT/NPF成员在不同低氮处理阶段呈差异表达,其中PbNRT2.4和PbNRT2.5表达量在低氮处理下显著上升。本研究为进一步探索PbNRT/NPF家族成员在氮素吸收、转运和利用中的生物学功能提供了重要基础,为闽楠氮素高效利用新品种选育提供依据。

• 四季秋海棠BsUFGT基因克隆及功能验证

  陈敏, 刘静, 刘至柔, 张艳文, 李逸菲, 李永华, 张开明

  四季秋海棠(Begonia semperflorens)是重要的园林观赏植物,其花朵成簇开放,花色艳丽。为了研究四季秋海棠花色形成机理,本研究根据前期获得的四季秋海棠转录组数据,克隆花青素合成途径的关键酶UDP-葡萄糖：类黄酮糖基转移酶(UDP-glycose: flavonoid glycosyltransferase, UFGT)基因,通过荧光定量PCR技术检测其在四季秋海棠不同组织中的表达量,并将其转化烟草(Nicotiana tabacum 'NC89')进行功能验证。结果显示,成功克隆了1条cDNA全长为1 536 bp、编码511个氨基酸的基因序列,将其命名为BsUFGT (GenBank No. OL329828)。BsUFGT相对分子量为56 385.34 D,理论等电点(pI)为5.25,含有UDPGT结构域,定位于细胞膜及细胞核中。qRT-PCR分析显示,四季秋海棠花中的BsUFGT表达量显著高于叶和茎的表达量(P<0.05)。转化烟草发现,转基因烟草花冠中的花青素苷含量高于野生型烟草花冠中的花青素苷含量,表明BsUFGT基因能够促进花青素苷的合成和积累,本研究为四季秋海棠花青素苷合成的分子调节机制提供了理论依据。

• 奶牛乳腺在不同机能状态下乳汁外泌体的异质性分析

  杨芳玲, 王玉, 吴帅帅, 王建发, 朱海鲸, 李陇平, 屈雷, 董书伟

  乳房炎是影响奶牛(Bos taurus)产奶量最大的疾病,但目前尚无高效的防控方法,奶牛乳汁中的外泌体可能在乳房炎发生过程中有重要作用。为研究奶牛在健康、患隐性乳房炎和临床型乳房炎等不同的机能状态下,乳汁中外泌体有何变化,本研究采用超速离心法分离奶牛乳汁中的外泌体,通过纳米粒子追踪、透射电子显微镜和Western blot鉴定外泌体,并比较各组外泌体颗粒直径、数量、蛋白浓度及表面标记分子的差异。结果表明,各组中外泌体的颗粒大小接近,形态符合外泌体特征,组间无明显差异;Western blot结果显示,各组中外泌体分子标记蛋白分化抗原9 (cluster of differentiation 9, CD9)、CD81和肿瘤抑制基因101 (tumor susceptibility gene 101, TSG101)的检测结果均为阳性。隐性乳房炎组的外泌体颗粒最多,其次为临床型乳房炎组,均显著高于健康组(P<0.05);隐性乳房炎组外泌体蛋白含量最高,其次为临床型乳房炎组,两组均显著高于健康组(P<0.05)。本研究从奶牛乳汁中分离到了外泌体,其数量、蛋白含量和表面分子标记在乳腺不同机能状态下发生了较大的变化,表明外泌体可能在奶牛乳腺抗感染过程中有调节作用,为深入认识乳腺的天然免疫防御机制提供理论依据。

• Hippo信号通路相关基因在牦牛不同繁殖周期卵巢中的表达分析

  李一娟, 樊江峰, 余四九, 周应聪, 钱文洁, 姚颖

  Hippo信号通路是调控动物机体组织器官生长发育的关键通路,在哺乳动物卵巢发育中具有重要作用。为了探究Hippo信号通路相关基因—哺乳动物ste20样蛋白激酶1 (mammalian ste20-like protein kinase 1, MST1)、大肿瘤抑制因子1 (large tumor suppressor 1, LATS1)、Yes相关蛋白质1 (Yes-associated protein 1, YAP1)在牦牛不同繁殖周期卵巢中的表达规律。本研究以健康雌性牦牛(Bos grunniens)卵泡期、黄体期、妊娠期的卵巢组织作为实验样品,通过qRT-PCR、Western blot分别从基因和蛋白水平检测上述3个基因在不同繁殖周期牦牛卵巢中的表达差异,利用免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测Hippo信号通路相关基因(MST1, LATS1, YAP1)在不同繁殖周期牦牛卵巢中的分布情况。qRT-PCR结果显示,在卵巢组织中,MST1基因在各时期表达量存在明显差异(P<0.05),卵泡期最高、妊娠期次之、黄体期最低;LATS1和YAP1基因在妊娠期的表达量显著高于卵泡期和黄体期(P<0.05)。Western blot结果显示,MST1、LATS1、YAP1蛋白表达量呈逐渐升高的趋势,其表达水平在妊娠期达到峰值,随后下降,并维持在较低的水平,妊娠期与其他各阶段差异显著(P<0.05)。IHC结果显示,MST1主要分布于卵巢的卵泡颗粒细胞,膜层细胞,颗粒黄体细胞,膜黄体细胞以及卵巢生殖上皮中,LATS1、YAP1在不同周期卵巢中的分布位置与MST1一致。MST1、LATS1、YAP1在牦牛不同繁殖周期卵巢中均有表达,且表达量存在显著差异,提示其可能参与了牦牛生殖生理相关过程的调控。本研究为进一步挖掘Hippo信号通路在牦牛繁殖性能的研究提供相应的理论依据。

• 益母草碱对绵羊精液冷冻保存的影响

  李智星, 卿育洪, 李志远, 曹少奇, 高新梅, 曾维斌, 王静, 胡广东

  精液冷冻保存是有效提升绵羊(Ovis aries)人工授精效率的有效手段之一,在精液保存稀释液中添加抗氧化剂是精液保存过程的关键,益母草碱作为一种抗氧化剂在精液保存的研究中鲜有报告。本研究在多浪羊精液冷冻保存稀释液中分别添加20、40、60、80和100 μmol/mL的益母草碱,通过检测精液品质、抗氧化能力、相关凋亡基因mRNA相对表达量及受胎率等指标,综合评价益母草碱对绵羊精液冷冻保存效果的影响。研究结果表明,与对照组(0 μmol/mL)相比,在冷冻保存稀释液中添加益母草碱后,能显著提高多浪羊冷冻保存精液的活率、顶体完整率和质膜完整率(P<0.05);并显著提升精液超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)和过氧化氢酶(catalase, CAT)的活性,提高总抗氧化能力(total antioxidant eapacity, T-AOC)水平并降低丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量(P<0.05);其中,冷冻保存液中益母草碱添加浓度为60 μmol/mL时保存效果最佳(P<0.05);此外,与对照组相比,在冷冻保存过程中,添加最佳浓度益母草碱组的精子相关凋亡基因肿瘤坏死因子受体超族成员6 (TNF receptor superfamily, member 6, Fas)、半胱天冬酶家族-3 (caspase family omega-3, Caspase-3)和B淋巴细胞瘤-2关联X蛋白(Bcl2-associated X, Bax)的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),抗凋亡基因B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)相对表达量显著升高(P<0.05);同时冷冻保存液中添加浓度为60 μmol/mL组精子的受胎率为60%,高于0 μmol/mL组,达到鲜精阴道输精的最低水平。本研究结果表明,在精液稀释液中添加浓度为60 μmol/mL的益母草碱后可显著改善多浪羊冷冻保存精液品质,提升其抗氧化能力,同时起到抗凋亡作用,使受胎率达到一个良好的水平。本研究为探索益母草碱对提高绵羊精液保存效果提供了有益借鉴。

• 双峰驼TLR10基因的原核表达、抗体制备及组织分布

  曾巍巍, 张睿, 谢东旭, 索南吉, 王亭玮, 刘柯江, 王雯慧

  Toll样受体10 (toll-like receptors 10, TLR10)在病原微生物进入机体后能与配体迅速结合并促进各种免疫细胞活化,在免疫系统中扮演着重要角色,但在机体不同组织器官的表达特点需进一步探究。本研究以NCBI中收录的双峰驼(Camelus bactrianus) TLR10基因(GenBank No. XM_010962682.2)构建pET-28a-TLR10原核表达质粒,在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达TLR10重组蛋白,并用纯化后的蛋白制备双峰驼TLR10多克隆抗体,通过ELISA和Western blot测定抗体的效价和特异性,采用免疫组织化学法观察TLR10在双峰驼心、肝、脾、肺和肾中的表达特征。结果显示,双峰驼TLR10重组蛋白大小为50 kD,主要以包涵体形式表达,免疫日本大耳兔(Oryctolagus cuniculus)后获得的抗体效价为1∶32 000,原核表达的TLR10蛋白能与该抗体特异性结合;免疫组化结果显示,TLR10主要在双峰驼心肌细胞、肝细胞及枯否细胞、脾脏的单核/巨噬细胞、肺脏的支气管上皮细胞、Ⅱ型肺泡细胞和尘细胞以及肾脏的肾小管上皮细胞表达。本研究为进一步揭示TLR10蛋白的功能及其在双峰驼天然免疫和获得性免疫中发挥的生物学作用提供材料。

• 江西地方鸡品种线粒体DNA ND6基因的遗传多样性

  贾晓旭, 陈皖强, 唐修君, 樊艳凤, 陆俊贤, 马尹鹏, 黄胜海, 葛庆联, 顾荣, 高玉时

  江西省拥有众多的地方鸡(Gallus gallus domesticus)品种。为研究江西地方鸡品种的遗传多样性和系统发育关系,本研究采集了江西不同地区的6个地方鸡品种(安义瓦灰鸡, 白耳黄鸡, 崇仁麻鸡, 丝羽乌骨鸡, 东乡绿壳蛋鸡和余干乌骨鸡)的198份血液样本,采用PCR扩增与核酸测序技术相结合的方法对这6个江西地方鸡品种线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)脱氢酶亚基6 (NADH dehydrogenase subunit 6, ND6)基因全序列进行了检测。结果表明,6个江西地方鸡品种的ND6基因序列全长为522 bp,共计检测到7个核苷酸多态位点,根据序列变异共确定了7种单倍型,其中Hap1为主流单倍型。核苷酸多样性、单倍型多样性和平均核苷酸差异分别为0.002 75±0.000 86、0.694±0.024和1.437。中介网络图分析显示,6个江西地方鸡品种单倍型呈星状发散分布。系统发育分析发现,丝羽乌骨鸡、东乡绿壳蛋鸡和余干乌骨鸡聚为一支,安义瓦灰鸡、白耳黄鸡和崇仁麻鸡聚为一支。以上结果表明,江西地方鸡线粒体ND6基因多态信息含量丰富,乌骨鸡可能有不同的母系来源。该研究结果为江西地方鸡遗传资源的种质保护、品种选育和鉴定工作提供了参考。

• 鸭circ_MBNL1在脂肪细胞分化过程中的功能预测

  张傲, 王来娣, 杨婷, 江勇, 王志秀, 陈国宏, 白皓, 常国斌

  环状RNA (circular RNAs, circRNAs)是一种新型内源性非编码RNA,在各种组织中均有表达。本研究以樱桃谷鸭(Anas platyrhynchos domesticus)胚原代细胞分化过程中circRNA测序结果为基础,针对由肌肉盲样剪接调节因子1 (musblind-like 1, MBNL1)基因编码的circ_MBNL1进行鉴定与功能分析。通过PCR扩增和焦磷酸测序技术获得接合序列,采用核质分离消化实验验证了鸭circ_MBNL1主要定位在细胞核中。组织表达谱结果提示,circ_MBNL1主要在鸭脾脏、脂肪和肺组织中表达。生物信息学分析结果表明,circ_MBNL1与预测的靶基因主要富集在脂肪细胞因子信号通路、FoxO信号等通路,推测circ_MBNL1可能参与调控鸭脂肪细胞的分化过程。本研究为深入探究circ_MBNL1在鸭脂肪细胞分化过程中的调控作用提供了理论基础。

• 基于TMT蛋白质组学对Vero细胞粘附相关蛋白的研究

  张潇文, 杨晓莉, 毕冬琳, 杨东亮, 刘方程, 令世鑫, 柏家林, 李琼毅, 张德荣

  细胞-细胞及细胞-细胞外基质的粘附取决于细胞特有的粘附蛋白及其相关调节信号。非洲绿猴肾脏上皮细胞(African green monkey kidney epithelial cells, Vero)是流感病毒(Influenza virus)、新型冠状病毒(Novel coronavirus)等多种病毒繁殖、纯化和疫苗生产的优良细胞株,为进一步探寻与Vero细胞粘附相关的蛋白,继而有效提升大规模高密度悬浮培养,本研究利用基因修饰及无血清培养基细胞技术成功构建悬浮型Vero细胞,并通过串联质谱标签(tandem mass tag, TMT)定量蛋白质组学技术对贴壁培养Vero细胞(adherent culture Vero, Adh_Vero)和悬浮培养Vero细胞(suspension culture Vero, Sus_Vero)中与细胞粘附性能相关的差异表达蛋白进行分析,以期为与悬浮培养Vero细胞粘附相关的候选靶基因筛选提供依据。结果表明,与Adh_Vero细胞相比,Sus_Vero细胞中表达差异显著的蛋白质有190个,其中上调表达蛋白116个,下调表达蛋白74个。通过GO功能注释和KEGG通路富集筛选获得与粘附相关的差异表达蛋白6个,其中5个上调表达蛋白分别是多配体蛋白聚糖-4 (syndecan 4, SDC4)、肌动蛋白调节器(enabled homolog, ENAH)、肌球蛋白轻链12β (myosin light chain 12β, MYL12β)、肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinas, MYLK)和封闭蛋白(occludin, OCLN),1种下调表达蛋白为整合素β2蛋白(integrin β2, ITGβ2)。qPCR检测表明,Sus_Vero中SDC4、OCLN、MYL12β、MYLK以及ENAH的mRNA水平极显著下调(P<0.01),ITGβ2的mRNA水平极显著上调(P<0.01)。Western blot检测表明,Sus_Vero中SDC4蛋白表达量也比贴壁培养细胞中显著减少,与定量蛋白质组学蛋白质表达趋势一致。本研究结果初步揭示了Vero细胞的粘附机制,为进一步运用基因工程技术构建Sus_Vero提供了有效候选靶蛋白。

• 贝莱斯芽胞杆菌ZF438菌株的鉴定及其发酵上清液对辣椒炭疽病的抑菌作用

  赵子璇, 曾先锋, 覃诗扬, 谢学文, 石延霞, 柴阿丽, 李宝聚, 李磊

  辣椒炭疽病(pepper anthracnose)是辣椒(Capsicum annuum)生产中的三大病害之一,可引起辣椒落叶烂果,严重影响辣椒的产量和品质。目前,利用微生物生物防治辣椒炭疽病具有绿色环保且不产生耐药性的优势,是农业健康发展的必然趋势。本研究从辣椒根际土壤中分离到一株生防菌株ZF438 (CGMCC No. 22291),能够高效抑制辣椒炭疽病菌,通过形态学观察、生理生化特性测定及多基因系统发育树构建鉴定其为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。通过平板对峙试验检测ZF438菌株对8种病原真菌和9种病原细菌的抑制效果,发现其具有广谱抑菌活性。进一步测定ZF438菌株的抑菌活性物质在不同温度、pH、紫外照射、超声处理和生物酶中的抑菌稳定性,结果显示,其发酵上清液在4~40 ℃、pH 2.0~10.0、紫外线处理和超声波处理条件下呈现较高的抑菌稳定性。此外,对于辣椒离体果实和活体盆栽条件下,ZF438菌株接种使辣椒炭疽病的发病率和病情指数均显著降低(P<0.05),离体果实防效可达68.26%,活体盆栽防效可达47.93%。本研究验证了贝莱斯芽胞杆菌ZF438的生物学特征,证明其具有良好的生防潜力和应用前景,为辣椒炭疽病的生物防治提供了新的资源。

• 湛江雷州沿海红树林放线菌的多样性、新颖性及其抗肿瘤活性

  李俊杰, 林曼佳, 陈海明, 刘玥利, 梁晓燕, 黄永梅, 罗辉

  红树林多生长在环境特殊多变的潮间带,该环境有利于稀有放线菌的生长及其活性化合物的产生。为探索湛江雷州沿海地区红树林放线菌菌种资源的多样性、新颖性及药用开发潜力,本研究采用10种不同的培养基,使用稀释涂布平板法对红树林根际土壤样品中的放线菌进行了分离。经纯化培养后,进行PCR扩增并对放线菌株的16S rRNA序列进行测序及系统发育分析;同时根据菌株的16S rRNA比对结果及菌落形态特征,选取菌株进行小型发酵并对发酵液进行乙酸乙酯萃取、旋蒸以制备发酵粗提物甲醇溶液。使用CCK-8 (Cell Counting Kit-8)法进行发酵粗提物对人肺癌细胞株A549及人肝癌细胞株HepG2的抗肿瘤活性研究。结果显示,从广东湛江红树林国家级自然保护区位于雷州沿海地区的3处不同采样点收集的8份根际土壤样品中共分离出154株放线菌,隶属于11个目,15个科,19个属,其中优势菌属为小单孢菌属(Micromonspora)(22.7%, 35株);其次是微杆菌属(Microbacterium)(20.8%, 32株)及链霉菌属(Streptomyces)(10.4%, 16株);有分布于4个属的7株16S rRNA序列相似性低于98.65%,为潜在新种。在发酵粗提物抗肿瘤活性筛选研究中,共53株菌株至少对1株肿瘤细胞株具有抗肿瘤活性,占选取的发酵菌株(67株)的79.1%。研究结果表明,广东湛江雷州沿海地区红树林区域的放线菌多样性高,潜在可开发药用资源丰富。本研究为后续对雷州沿海放线菌分布认知的进一步完善以及抗菌等其他生物活性及相关机制研究的开展提供了充足的菌种基础。

• DNA甲基化在家畜繁殖中的研究进展

  雒瑞瑞, 王彩莲, 郎侠

  DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团的过程。作为重要的表观遗传修饰机制之一,DNA甲基化是目前生命科学领域研究的热点。随着测序技术的高速发展,DNA甲基化检测技术也取得了显著的进展。在动物繁殖方面,DNA甲基化程度改变,可能会影响繁殖性状相关基因的表达情况,从而使动物的繁殖性能发生改变。本文从DNA甲基化概述、DNA甲基化的检测方法以及在动物繁殖上的研究等方面做了简要的综述,并探明DNA甲基化的表观遗传机制,为充分发挥家畜繁殖力,选育优质的新品种或品系提供分子育种的理论依据。

• lncRNA生物学作用及其调控牛剩余采食量的研究进展

  明文轩, 赵志艳, 康晓龙

  长链非编码 RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一类影响基因表达及细胞功能的重要表观调控因子,其表达模式具有组织特异性。lncRNA 的生物学作用已在众多疾病及生物表型研究中得到广泛报道。采食量是影响畜禽养殖经济效益的主要因素之一,大量研究主要聚焦于营养及免疫等因素对家畜采食量的影响,但从分子遗传角度对其进行解析与功能研究仍较缓慢。为探究 lncRNA 在牛(Bos taurus)采食行为及剩余采食量(residual feed intake, RFI)调控中的生物学作用,本文概述了 lncRNA 的分子特点及主要调控功能,并从影响牛采食量表型变化相关的重要组织(下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴、肝脏、骨骼肌、脑-肠轴)梳理归纳了 lncRNA 与牛 RFI 表型之间的关系。本文为后续从细胞功能角度揭示lncRNA对RFI的表型调控研究提供依据,为牛高效生产及品种改良提供参考。

• 杨梅品种特异性荧光SSR分子标记数据库构建

  巨鹏举, 朱奕凡, 赵岚, 汪国云, 周超超, 颜丽菊, 柴春燕, 焦云, 陈金辉, 郭秀珠, 高中山

  我国杨梅(Morella rubra)种质资源丰富,地方品系较多。尽管基于杨梅基因组已开发了大量SSR分子标记,但目前尚未形成一套统一用于杨梅品种资源区分鉴定的分子标记,种质资源遗传特异性数据管理较为混乱。本研究基于已开发的杨梅SSR分子标记及连锁图谱定位,从每个连锁群中选择2个扩增片段长度稳定、重复性好的SSR分子标记,采用荧光标记引物,于DNA测序仪上进行片段分析,构建分子标记数据库,形成区分杨梅资源的统一标准;在此基础上分析杨梅各株系的遗传距离,绘制基于遗传距离的聚类树。结果显示,所选取的16个SSR分子标记在杨梅品系材料中的扩增片段大小存在差异,可用于109个杨梅品种与品系的区分,且不同品种与品系的地理来源与遗传距离的远近存在一定程度上的相关性;以地方主栽品种'荸荠种'、'东魁'、'丁岙'和'安海片早生'为扩增片段大小的标准参照,利用16个SSR分子标记的扩增片段构建109份杨梅资源的指纹图谱;进一步选择多态性信息含量(PIC)较高的5个SSR分子标记,可成功区分85% (94/109)的杨梅材料,显示较高的鉴定效率。本研究为杨梅种质资源管理提供更加高效、可靠的方法和标准。