农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2022年第8期

• 小麦YSK2型脱水素基因WDHN2的克隆及表达分析

  张红梅, 龚明贵, 伍家发, 张敏, 刘帅, 薛豪彬, 曹智豪, 潘永康

  非生物逆境胁迫严重影响小麦(Triticum aestivum)的生长发育和产量,脱水素(dehydrin, DHN)是一类非生物逆境胁迫诱导表达蛋白,在保护细胞免受水分亏缺和温度变化的伤害过程中发挥重要作用。为研究脱水素在植物响应非生物逆境胁迫过程中的作用,本研究利用同源克隆技术,从小麦中克隆了1个YSK2型脱水素基因,命名为WDHN2 (GenBank No. OK094572)。该基因的开放阅读框为501 bp,编码1个含有166个氨基酸残基的蛋白;含有4个保守区域,分别为1个Y片段、1个S片段和2个K片段,与节节麦(Aegilops tauschii)脱水素(GenBank No. XP_020188302.1)亲缘关系最近。生物信息学分析表明,WDHN2蛋白属于高度亲水性蛋白,高级结构以无规则卷曲为主;亚细胞定位预测表明,WDHN2蛋白定位于细胞核;另外,S片段为主要的磷酸化部位。qPCR分析表明,WDHN2基因受干旱、高盐、低温和脱落酸(abscisic acid, ABA)诱导表达。构建原核融合表达载体pET28a-WDHN2并转化大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21(DE3),用异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达,获得25 kD的WDHN2蛋白和重组大肠杆菌。重组菌的抗性实验表明,WDHN2蛋白可以增强大肠杆菌对渗透胁迫、高盐、低温和高温胁迫的抗性。上述研究结果提示WDHN2可能参与小麦响应逆境胁迫的信号途径。本研究丰富了小麦响应非生物胁迫分子机制的研究内容,为深入探讨WDHN2基因的功能提供基础资料。

• 木薯MeAHL19的互作蛋白筛选及鉴定

  张建禹, 王晓彤, 耿沙, 毋志浩, 任思杨, 李瑞梅, 姚远, 郭建春, 刘姣, 胡新文

  AT-hook核定位蛋白(AT-hook motif nuclear localized protein, AHL)是一类具有AT-hook基序的核定位蛋白,在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。为探究木薯(Manihot esculenta) AHL家族成员MeAHL19的生物学功能以及其在蛋白互作网络中的作用。本研究采用T4连接法构建诱饵载体pGBKT7-MeAHL19,利用酵母(Saccharomyces cerevisiae)双杂交技术(yeast two-hybrid, Y2H)在木薯cDNA文库中筛选MeAHL19的互作蛋白,采用实时荧光定量PCR技术分析MeAHL19及其互作蛋白的基因表达模式。结果显示：酵母双杂交筛库获得20个阳性克隆,经PCR扩增并测序比对后鉴定出8个候选互作蛋白,Y2H回转验证发现,MeAHL19蛋白与核酮糖二磷酸羧化酶小链(ribulose bisphosphate carboxylase small chain, RBCS)蛋白可在体外互作;双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)实验进一步验证了MeAHL19与RBCS在本氏烟草(Nocotinan benthamiana)叶肉细胞中发生互作。基因表达模式分析表明,MeAHL19主要在根中表达,而RBCS在根、茎和叶中的表达水平基本一致;MeAHL19与RBCS在木薯中共同响应非生物胁迫和外源激素应答。本研究为进一步探究MeAHL19在木薯逆境响应过程中的生物学功能提供了科学参考。

• 换锦花花青素合成酶基因(LsANS)的克隆及启动子功能分析

  薛惠敏, 周洋丽, 高燕会

  换锦花(Lycoris sprengeri)是石蒜属植物中花色特殊的红蓝复色花,其花色形成机理复杂,而花青素合成酶(anthocyanidin synthase, ANS)是植物花青素合成途径末端的一个关键酶。本研究采用分子生物学方法,对LsANS基因cDNA和启动子序列的功能进行分析,结果表明,LsANS基因cDNA全长1 401 bp (GenBank No. MT664240), ORF 1 068 bp,编码355个氨基酸;进化树分析表明,LsANS与红花石蒜(L. radiata)同源性最高为98.5%。qRT-PCR检测发现,LsANS基因在大花苞时期表达量最高,在盛花期最低;5种无性系(H1~H5)中,LsANS在H4表达量最高,在H1表达量最低;HPLC检测显示,在不同花发育时期,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷与天竺葵素-3-O-葡萄糖苷在花苞时期的含量高于其他时期;在不同无性系中,天竺葵素-3-O-葡萄糖占所测花色苷含量比例最高的为无性系H4,在无性系H1中所占比例最低,推测LsANS参与天竺葵素的生物合成。克隆到长为2 114 bp的LsANS启动子序列,含有MYB转录因子结合位点、参与光、激素及逆境胁迫等顺式作用元件。构建pBI121-LsANSpro::GUS融合表达载体,瞬时转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),发现其根、叶片和花显示蓝色,可知启动子LsANSPro具有启动下游基因的作用。本研究为进一步探讨ANS基因在石蒜属植物花色形成过程中的作用及机理提供理论依据。

• AtDXS和AtDXR共表达对烟草萜类代谢产物的影响

  张涵, 冷璐, 祖庆学, 聂忠扬, 林松, 成志军, 李国明, 陆引罡

  1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, DXS)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase, DXR)分别是萜类化合物前体物质脱氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway, DXP)合成途径的第1个和第2个限速酶,在烟草(Nicotiana tabacum)次生代谢过程中发挥着重要的调控作用。本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana) DXS和DXR基因为基础,选择目前植物基因表达最常用的启动子CaMV 35S (35S-promoter, originated from Cauliflower mosaic virus)和终止子NOS (nopaline synthase-terminator, derived from Agrobacterium tumefaciens),人工合成全基因序列DXS-NOS和35S-DXR,构建共表达载体pSH737-DXS-DXR,通过农杆菌(Agrobacterium tumefacien)介导的遗传转化,成功获得DXS和DXR共表达的烟草转基因植株。通过GUS化学活性测定、PCR和Southern blot检测,证明该融合基因已成功导入烟草再生植株基因组并获得表达。RT-PCR检测结果显示,转基因植株的DXS基因表达较对照显著增加(P<0.05)。GC-MS测定结果表明,转基因植株的新植二烯和腺毛分泌物均较对照有不同程度的增加(P<0.05)。本研究利用遗传改良技术为烟草育种提供了研究材料,为进一步利用代谢工程手段调控烟草萜类物质的生物合成提供参考依据。

• 秦川牛FABP4、FASN和TCAP基因多态性位点与生长和胴体性状的关联性分析

  迟志娇, 澈力木格, 成功, 苏雅, 成立新, 刘剑锋, 曹贵方, 包斯琴, 昝林森, 佟彬

  肉牛(Bos taurus)的生长速度和胴体品质在肉牛产业中具有重要的经济价值。脂肪酸结合蛋白4 (fat acid binding proteins 4, FABP4)和脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FASN)在脂肪酸的合成过程中具有关键作用,是影响肉牛脂肪沉积和脂肪酸组成的关键功能基因。肌联蛋白帽(titin-cap, TCAP)作为一种肌丝蛋白在肌原纤维的组装过程中发挥着重要作用。TCAP基因g.346G>A位点、FASN基因g.17924G>A位点和FABP4基因g.3691G>A位点与肉牛的生长、胴体和肉质性状高度相关。为探究上述3个位点对秦川牛生长和胴体性状的影响及其在不同肉牛品种中的多态性,本研究利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MassARRAY)技术对350头秦川牛的以上3个基因的3个位点进行了基因分型和遗传多态性分析,并分析了其与秦川牛生长和胴体性状的关联性。结果表明,FASN基因g.17924G>A位点、FABP4基因g.3691G>A位点及TCAP基因g.346G>A位点在本研究所选的秦川牛群体中均符合哈迪-温伯格平衡。在350头秦川牛群体中,FASN基因g.17924G>A位点与秦川牛尻长与腰角宽显著相关(P<0.05),有益等位基因(G)频率与韩国牛和安格斯牛差异极显著(P<0.01)。FABP4基因g.3691G>A位点与秦川牛腰高、腰角宽和胸围显著相关(P<0.05),与体重、体斜长、尻长和胸深极显著相关(P<0.01),有益等位基因(G)频率与韩国牛差异极显著(P<0.01)。TCAP基因g.346G>A位点与秦川牛体高与腰高极显著相关,与体重、体斜长、坐骨端宽和肌内脂肪含量显著相关(P<0.05),有益等位基因(G)频率与韩国牛差异极显著(P<0.01)。综上所述,TCAP基因g.346G>A位点、FASN基因g.17924G>A位点和FABP4基因g.3691G>A位点与秦川牛的生长和胴体性状显著相关。本研究结果可为秦川牛分子标记辅助育种提供有效分子遗传标记,为秦川牛的遗传改良提供参考依据。

• 牦牛YTHDF2基因克隆及表达谱分析

  马兰花, 张永峰, 顾亚荣, 陈祎玮, 阎萍, 潘和平

  YT521-B homology domains 2 (YTHDF2)作为RNA结合蛋白,能够识别N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)修饰,在哺乳动物生长发育中起着关键作用。为了解牦牛(Bos grunniens) YTHDF2基因在牦牛脂肪沉积中的作用,本研究克隆牦牛脂肪组织中的YTHDF2 CDS区并进行生物信息学分析,利用qPCR技术探究YTHDF2 mRNA的时空表达规律。结果发现,YTHDF2 mRNA CDS区全长1 743 bp,共编码580个氨基酸;YTHDF2亲缘关系与野牦牛最近;氨基酸等电点是8.87,不稳定系数(Ⅱ)为50.00,蛋白总平均亲水性为-0.66,YTHDF2蛋白总体表现出较强的亲水性,有1个大小为133 bp的YTH保守结构域,无信号肽和跨膜结构域,共有69个潜在磷酸化位点。YTHDF2蛋白高级结构由无规则卷曲(67.59%)、α-螺旋(15.15%)、延伸链(12.24%)和β-转角(4.66%)相互连接而成。YTHDF2与甲基化修饰相关蛋白相互作用,对RNA特异性结合具有重要作用。qPCR结果显示：在空间维度上,YTHDF2基因在牦牛7个组织中均有表达,背最长肌中表达量最高(P<0.05);时间维度上,18和30月龄2个阶段脂肪组织中的YTHDF2表达差异不显著;进一步研究发现在牦牛前体脂肪细胞分化过程中,YTHDF2表达量呈现上升的趋势,4、8和12 d的表达量显著高于0 d (P<0.05))。研究结果显示,牦牛YTHDF2是1个具有YTH保守结构域的碱性不稳定水溶性蛋白,初步表明YTHDF2在牦牛脂肪沉积过程中发挥着重要的作用。本研究为进一步研究牦牛YTHDF2基因对脂肪沉积调控及其功能提供了参考。

• B4GALNT2基因多态性与蒙古羊和乌珠穆沁羊产羔数的关联性分析

  高一杰, 王锦, 朝鲁蒙, 仓明, 于海泉, 王建国, 包斯琴, 刘永斌, 张文广, 马青, 佟彬

  产羔数是绵羊(Ovis aries)重要的经济性状之一,决定肉羊产业的生产效率。β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2 (β-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 2, B4GALNT2)基因上存在的g.36938224A>T位点,是影响法国拉科讷绵羊(Lacaune sheep)排卵率的关键候选位点,而B4GALNT2基因被认为是新的影响绵羊繁殖力的候选功能基因。为明确B4GALNT2基因的已知多态性位点与蒙古羊(Mongolia sheep)和乌珠穆沁羊(Ujimqin sheep)产羔数的关联性,挖掘蒙古羊B4GALNT2基因的特异性突变及其与蒙古羊和乌珠穆沁羊产羔数的关联性,本研究采用6个绵羊品种共计480个样本(蒙古羊250只, 乌珠穆沁羊110只, 呼伦贝尔羊(Hulunbuir sheep) 30只, 滩羊(Tan sheep) 30只, 小尾寒羊(Small-tailed Han sheep) 30只和湖羊(Hu sheep) 30只),利用直接测序技术对上述480个样本B4GALNT2基因g.25929884A>T位点(GenBank No. NC_040262.1)进行检测并挖掘新多态性位点,利用MassARRAY技术对上述480个样本B4GALNT2基因g.25921552C>T SNP、g.25935026C>T SNP和远端缺失同源盒3 (distal-less homeobox 3, DLX3)基因c.*803A>G位点进行基因分型,进而分析已知和新突变位点与蒙古羊和乌珠穆沁羊产羔数的关联性及其在6个绵羊品种中的遗传多样性。结果表明,在4个已知多态性位点中,B4GALNT2基因g.25929884A>T位点和DLX3基因c.*803A>G SNP在上述绵羊品种的实验群体中不存在,B4GALNT2基因的g.25921552C>T位点和g.25935026C>T位点存在,但与蒙古羊和乌珠穆沁羊的产羔数无关;同时在B4GALNT2基因中新发现8个多态性位点,其中g.25929637G>A (P<0.05)、g.25929679T>C (P<0.01)、g.25929819A>G (P<0.01)和g.25929965A>T (P<0.05)位点对蒙古羊产羔数有显著影响;除了滩羊品种中的g.25921552C>T位点以外,其他9个检测到的多态性位点均满足Hardy-Weinberg平衡;根据PIC判定标准,10个突变位点在6个绵羊品种中均表现为低度多态或中度多态。本研究为提高蒙古羊的产羔数提供有效的分子遗传标记,同时也为蒙古羊的遗传改良提供了科学依据。

• HDAC6与AREG在滩羊卵巢不同发育阶段卵泡中的表达特征及相关性分析

  范闪闪, 柳雨均, 徐娅秀, 杨易, 刘新峰, 王超

  组蛋白去乙酰化酶6 (histone deacetylase 6, HDAC6)是一种重要的表观遗传修饰蛋白,双向调节蛋白(amphiregulin, AREG)是一种重要的上皮样生长因子(epidermal growth factor-like, EGF-like),二者对哺乳动物的生殖均具有重要调控作用。为了探讨HDAC6及AREG在滩羊(Ovis aries)卵巢不同发育阶段卵泡中的表达规律,分析二者在卵泡发育过程中的相关性,本研究通过免疫组化、免疫荧光及Western blot的方法,检测HDAC6及AREG在滩羊卵巢不同发育阶段卵泡中的定位及表达模式,并利用Pearson法分析HDAC6及AREG在卵泡发育过程中的相关性。结果显示,HDAC6在滩羊卵巢不同发育阶段卵泡的颗粒细胞和卵母细胞中均有表达,且主要在颗粒细胞和卵母细胞细胞质中表达。随着卵泡发育,HDAC6在不同发育阶段卵泡中的表达水平呈先升后降的趋势,且其表达水平在直径大于6 mm的卵泡中极显著的低于直径小于2 mm的卵泡(P<0.001);AREG主要表达于滩羊卵巢不同大小卵泡的颗粒细胞中,且主要在颗粒细胞质中表达。随着卵泡发育,AREG在不同发育阶段卵泡中的表达水平呈逐渐上升趋势,且其表达水平在直径大于6 mm的卵泡中极显著的高于直径小于2 mm的卵泡(P<0.01)。相关性分析进一步发现,HDAC6与AREG在滩羊不同直径卵泡中的表达均呈负相关关系,其中直径小于2 mm的卵泡中HDAC6与AREG的表达呈中度负相关,直径2~6 mm的卵泡中HDAC6与AREG的表达呈极强负相关,直径大于6 mm的卵泡中HDAC6与AREG的表达呈极弱负相关。以上结果表明,HDAC6和AREG在滩羊卵巢不同发育阶段的卵泡中均有表达,且二者的表达模式总体上呈负相关的关系,提示二者可能通过负相关的调控方式参与了滩羊卵巢中卵泡的发育过程。本研究为深入探讨滩羊卵巢不同发育阶段卵泡中颗粒细胞和卵母细胞内HDAC6及AREG的表达关系及二者对滩羊卵泡发育和卵母细胞成熟的影响与可能机制提供了重要参考。

• 贵州白山羊SIRT1基因组织表达及其多态性与血清脂代谢指标的关联性分析

  惠茂茂, 陈祥, 阮涌, 李世军, 周志楠, 杨沛方, 张艳

  沉默信息调节因子1 (silent mating type information regulation 2 homolog 1, SIRT1)通过去乙酰化参与脂肪动员、影响脂肪代谢。为探究贵州白山羊(Capra hircus)中SIRT1基因多态性,并筛选与贵州白山羊血清脂代谢指标相关的SNP位点,本研究对SIRT1进行生物信息学分析,分析SIRT1基因在各组织中的表达情况及SNPs与血清中胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸的关联性。结果显示,SIRT1基因在11个组织中均有表达,其中肝脏、背最长肌中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01);贵州白山羊SIRT1基因共检测出11个突变位点,均位于1、6外显子上;遗传学分析发现,g.21206621T>C、g.21206920T>G、g.21207071A>C、g.21215871G>A、g.21216960T>C、g.21217717T>C和g.21217777A>G位点PIC均处于中度多态水平,g.21207042C>T、g.21217404T>C突变位点群体基因遗传平衡偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.01);连锁不平衡分析显示,g.21206621T>C、g.21206920T>G、g.21207071A>C、g.21215871G>A、g.21216960T>C、g.21217717T>C、g.21217777A>G位点之间,g.21207042C>T、g.21217404T>C两个位点之间互相存在强连锁不平衡效应;生物信息学分析可知,该蛋白质分子式为C3514H5530N968O1153S26,系非跨膜蛋白,有3个N-糖基化位点,二、三级结构主要以无规则卷曲结构占比最高。g.21206920T>G、g.21207071A>C、g.21216060C>A、g.21216960T>C位点突变后最小自由能不变,其他位点均发生改变。关联性分析发现,g.21206920T>G和g.21217777A>G位点处胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸含量在不同基因型之间差异显著(P<0.05);g.21206621T>C、g.21216960T>C和g.21217717T>C位点处胆固醇、游离脂肪酸含量在不同基因型之间差异显著(P<0.05);g.21207071A>C位点处甘油三酯和游离脂肪酸含量在不同基因型之间差异显著(P<0.05);游离脂肪酸在g.21215871G>A位点处不同基因型之间差异显著(P<0.05)。本研究结果表明,SIRT1基因可作为贵州白山羊脂肪代谢与沉积的候选分子标记,为明确SIRT1基因调控脂肪代谢的相关位点和开展山羊遗传标记提供了理论参考。

• 基于RNA-seq技术分析microRNA 29a对八眉猪仔猪小肠上皮细胞基因表达的影响

  谢雯, 任昊, 魏涛, 张莹莹, 张怀霞, 陈倩, 贾建磊

  小肠上皮细胞是小肠发挥吸收营养物质和肠道屏障作用的重要基础。microRNA 29a (miR-29a)对动物生长发育过程中的细胞凋亡、分化和增殖有着重要的影响作用。为明确miR-29a对仔猪(Sus scrofa)小肠上皮细胞基因表达的影响,本研究先构建miR-29a的模拟物和抑制物组,收集转染后48 h的细胞,提取RNA后构建文库,进行Illumina测序,筛选得到差异表达基因,并对差异基因进行基因本体(Gene Ontology, GO)功能注释、KEGG通路富集分析,绘制目的基因的共表达网络,并随机选取4个基因通过qPCR来验证转录组数据的准确性。本研究共得到9个转录组文库,经测序质量控制得到的总有效数据量(clean base)为55.42 Gb,与参考基因组的比对率达到95%以上。利用DESeq2软件分析测序得到的表达基因,结果显示miR-29a抑制物组(VPA)与阴性对照组(VPC)之间有7 102个基因显著差异表达,其中VPA组有2 558个上调基因,3 544个下调基因;miR-29a模拟物组(VPT)和VPC组之间共有2 829个显著差异表达基因,其中1 563个基因在VPT组中为上调基因,1 266个基因在VPT组中为下调基因;VPA和VPT两组样品中共有503个差异表达基因,VPA组中有197个上调表达基因,306个下调表达基因。对差异基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,发现miR-29a处理后的肠上皮细胞正处于非常活跃的细胞增殖和分化阶段,得到的差异基因主要富集于DNA复制和细胞周期通路中。qPCR结果验证了测序结果的准确性。本研究表明,miR-29a可能通过影响小肠上皮细胞的CDKN2C、E2F1、POLE等基因和MCM家族来调控细胞的凋亡,进而影响小肠的吸收和肠道屏障功能。上述结果为研究miR-29a对八眉猪仔猪肠道的影响提供了基础资料。

• A型多杀性巴氏杆菌感染后小鼠肾脏组织转录组分析

  刘志勇, 程逸文, 黄惠娴, 蒋俊明, 杜丽, 满初日嘎, 陈思, 王凤阳, 陈巧玲

  巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)引起的人畜共患病,对畜牧经济发展造成严重影响,然而目前Pm的具体感染致病机制尚不完全清楚。为了研究Pm感染宿主肾脏组织所引起的免疫变化,探究Pm对宿主的感染机制,本研究利用腹腔感染建立羊源A型多杀性巴氏杆菌(HN02菌株)感染小鼠(Mus musculus)的模型,收集其肾脏组织进行转录组测序。转录组分析结果显示,共有3 836个基因差异表达,其中1 741个差异表达基因显著上调,1 426个差异表达基因显著下调;基因本体论(Gene Ontology, GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)注释发现,Pm感染肾脏组织过程中差异表达基因主要富集于跨膜转运蛋白活性、线粒体、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)信号通路、人类乳突病毒(Human papillomavirus, HPV)感染和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路等信号传导、能量代谢和免疫应答过程;免疫相关信号通路关联分析后发现,其中部分基因同时参与不同的信号通路,选取v-rel网状内皮细胞过多症病毒癌基因同源物A (v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A, ReLA)、B细胞κ轻肽基因增强子核因子抑制因子α (nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor alpha, NFKBIA)、肿瘤坏死因子受体超家族成员1A (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1A, TNFRSF1A)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和磷酸肌醇3激酶调节亚基3 (phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3, PIK3R3)等基因进行qRT-PCR验证,结果表明,这些基因的表达趋势和测序结果一致。本研究初步证明了小鼠肾脏在抵抗Pm感染过程中有一系列免疫反应参与,其中先天性免疫在肾脏组织抗Pm感染过程中发挥着重要作用,该结果为进一步研究Pm与宿主互作机制提供了数据支持。

• 精胺对雌鹅空肠、回肠多胺代谢关键基因的表达及多胺水平的影响

  易治鑫, 蒋易龙, 李林祥, 姜冬梅, 康波

  精胺能促进肠道黏膜损伤修复,提高肠道消化酶活性,调节肠道多胺稳态和肠道功能。为研究精胺对鹅(Anser cygnoides)空肠和回肠多胺代谢关键基因表达及多胺水平的影响,用5和10 mg/kg精胺灌胃成年四川白鹅雌鹅,运用qPCR分析鹅空肠和回肠组织中多胺代谢关键基因表达量,高效液相色谱法检测空肠和回肠组织多胺含量。结果表明,5 mg/kg精胺处理组雌鹅空肠组织鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制剂2(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor 2, AZIN2)、鸟氨酸脱羧酶抗酶1 (ornithine decarboxylase antizyme , OAZ1)和OAZ2基因表达量以及亚精胺和精胺含量显著高于对照组(P<0.05),而AZIN1和乙酰多胺氧化酶(acetylpolyamine oxidase, APAO)基因表达量显著低于对照组(P<0.05);5 mg/kg精胺处理组雌鹅回肠组织AZIN2和精胺合成酶(spermine synthase, SPMS)基因表达量显著高于对照组(P<0.05),而亚精胺/精胺N'-乙酰转移酶(spermidine/spermine-N'-acetyltransferase, SSAT)基因表达量显著降低(P<0.05);10 mg/kg精胺组雌鹅空肠组织AZIN2、OAZ2、鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase, ODC)、APAO和精胺氧化酶(spermine oxidase, SMO)表达量以及精胺含量显著高于对照组(P<0.05),而亚精胺合成酶(spermidine synthase, SPDS)表达量和腐胺含量显著降低(P<0.05);10 mg/kg精胺能显著上调雌鹅回肠AZIN2、ODC、SPDS和APAO表达(P<0.05),并显著降低腐胺含量(P<0.05)。本研究结果表明,外源性精胺可介导雌鹅小肠组织多胺代谢基因表达,参与调控小肠组织多胺稳态,且精胺对雌鹅空肠和回肠组织多胺稳态的影响程度存在一定差异,为研究鹅小肠多胺代谢功能提供了基础数据。

• 复方中草药对虹鳟脾脏非特异性免疫指标及免疫相关基因表达的影响

  潘玉财, 黄进强, 李永娟, 吴深基, 赵璐, 雷明荃, 孙同振, 王晓谰

  中草药具有丰富的活性物质,具有提高机体免疫力、抗病及无残留等特性,已在水产养殖中被广泛应用。为探讨饲料中添加不同水平的复方中草药(黄芪(Astragalus radix), 党参(Codonopsis pilosula), 当归(Angelica sinensis), 甘草(Glycyrrhiza uralensis), 麦冬(Ophiopogon japonicus), 茯苓(Poria cocos), 山楂(Hawthorn), 金银花(Lonicera japonica), 板蓝根(Isatidis radix)和大青叶(Isatis indigotica Fortune))对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脾脏非特异性免疫及免疫相关基因表达的影响,本研究选取120尾虹鳟为实验对象,随机分为4组,分别在基础饲料中添加0 (对照组)、10、20和30 g/kg复方中草药连续投喂35 d。在投喂第7、21和35 d时取脾脏组织用于非特异性免疫指标的测定,并利用qPCR分析虹鳟脾脏中15个免疫相关基因的表达差异。结果显示,与对照组相比,在投喂的3个时期复方中草药均能显著提高虹鳟脾脏中总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、溶菌酶(lysozyme, LZM)及酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)的活性(P<0.05),其中以20 g/kg组效果最佳;与对照组相比,10、20和30 g/kg组丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量均在投喂的3个时期显著下降(P<0.05),且30 g/kg组效果最佳。基因表达结果显示,与对照组相比,投喂第35 d时,20 g/kg组能显著诱导脾脏中Toll样受体3 (Toll-like receptor 3, tlr3)、Toll样受体7 (tlr7)、髓样分化因子88 (medullary differentiation factor 88, myd88)、白细胞介素1β (interleukin-1β, il-1β)和细胞核因子κB抑制剂α (nuclear factor kappa B inhibitor alpha, nfkbia)基因的表达(P<0.05);各处理组肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, tnf-α)基因表达差异不显著,Toll样受体8 (tlr8)在30 g/kg组显著上调(P<0.05);同时,免疫相关基因干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3, irf3)、干扰素调节因子7 (irf7)、黑色素瘤分化相关蛋白5 (melanoma differentiation-associated protein 5, mda5)、RIG-I样受体2 (RIG-I-like receptor 2, lgp2)、白细胞介素8 (il-8)、干扰素β (interferon-β, ifn-β)、信号转导和转录激活因子1 (signal transducer and activator of transcription 1, stat1)和janus激酶1 (janus kinase 1, jak1)表达量也在20 g/kg组中显著上调(P<0.05)。本研究表明,该复方中草药可以增强虹鳟非特异性免疫能力和免疫相关基因的表达,且饲料中复方中草药建议添加量为20 g/kg。本研究为促进复方中草药作为免疫刺激剂在水产养殖中的合理应用及发展提供了科学依据。

• 番茄灰霉病生防内生细菌BR-1的筛选鉴定及其生防性能分析

  李腊, 史洪丽, 余婷婷, 刘庆, 简伟, 杨星勇

  筛选对番茄(Solanum lycopersicum)灰霉病具有优秀拮抗作用的内生细菌对防治灰霉病、提高番茄产量及降低采后番茄损失具有重要作用。本研究采用LB培养基培养结合梯度稀释法从百部(Stemona japonica)块根组织分离出内生细菌,通过平板对峙法筛选出对灰霉菌(即灰葡萄孢菌, Botrytis cinerea)具有良好拮抗作用的菌株;根据形态特征、生理生化和16S rDNA序列分析,对拮抗菌株进行鉴定;通过平板对扣法测定拮抗菌株挥发物的抑菌能力;采用果实刺伤接种法分析拮抗菌株对灰霉病的防治效果及其在番茄果实上的定殖能力;通过种子萌发实验测定种子萌发率、根长、芽长,评估拮抗菌株对番茄的促生效果。结果显示,成功筛选获得1株具有固氮、溶磷效果的菌株BR-1,鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli);平板对峙和刺伤接种实验结果一致表明,BR-1菌株能够通过抑制菌丝生长而显著抑制灰霉菌扩增,其平板抑菌率达到73.38%,进一步分析发现BR-1菌株挥发物呈现显著抑菌活性;广谱抑菌实验表明,BR-1菌株对串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)、花生尾孢菌(Cercospora arachidicola)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、瓜棒孢霉菌(Corynespora cassiicola)、芸薹链格孢菌(Alternaria brassicae)具有不同程度的抑制作用,特别是对串珠镰孢菌的抑菌率达到72.97%;种子萌发实验表明,BR-1菌株可以显著提高番茄种子萌发率、促进番茄幼苗生长,并且能成功定殖番茄果实。本研究分离、筛选获得具有显著抗病、促生效果的生防内生细菌BR-1,为番茄灰霉病的生物防治提供了重要的生物资源。

• 水稻AGL17-like亚家族研究进展

  李鲁华, 王忠妮, 徐如宏

  AGL17-like亚家族属于MADS-box基因家族,是一类植物中高度保守的重要转录因子。研究发现水稻(Oryza sativa) AGL17-like亚家族成员(包括OsMADS23, OsMADS25, OsMADS27, OsMADS57和OsMADS61 5个基因)主要在营养器官中表达,其广泛参与根的生长发育、响应营养元素的供应以及逆境胁迫的响应等生物学过程。本综述重点阐述水稻AGL17-like亚家族成员和特异靶向水稻AGL17-like亚家族成员的miR444的研究进展,将有助于进一步开展该亚家族蛋白在调控植物生长发育和逆境胁迫等方面的研究,为推进分子育种工作提供一定的参考。

• 香蕉枯萎病菌效应蛋白研究进展

  王田, 陈代朋, 高雅, 王渝华, 周思语, 付羽佳, 郑丽

  香蕉(Musa spp.)作为全球重要的粮食作物和贸易农产品,对社会经济发展具有重要作用。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)引起的土传维管束真菌病害,该病害对香蕉产业可造成毁灭性危害,严重制约了香蕉产业的发展。种植抗病品种是预防枯萎病发生的最经济有效的方式,然而抗病育种目前尚未取得突破性进展。近年的研究表明,效应蛋白是一类重要的毒性因子,其在病原菌的侵染、定殖以及与寄主植物的互作过程中发挥重要作用。本综述总结了香蕉枯萎病菌效应蛋白的研究进展,并就近年来香蕉枯萎病菌效应蛋白的生物信息学预测和分析、转录组学分析等多方面研究进行了讨论,着重介绍了一类重要的SIX (secreted-in-xylem)效应蛋白,为研究病原尖孢镰刀菌与香蕉的互作机制、香蕉抗病品种的培育以及香蕉枯萎病的防控策略提供科学依据。

• 苦荞薄壳性紧密连锁SSR标记的开发及验证

  陈峥峰, 薛贤滨, 黎瑞源, 贾琼, 陈庆富, 石桃雄

  苦荞(Fagopyrum tataricum)是我国重要的杂粮作物之一,其果壳类型不同导致脱壳效率不同,对苦荞产业发展有很大的影响。目前关于苦荞果壳类型的分子标记研究较少。为给苦荞果壳特性的改良及苦荞种质果壳类型的早期判断提供参考和选择依据,本研究开发并验证了与苦荞薄壳特性紧密连锁的SSR分子标记。结果表明,在薄壳基因1.4 Mb的定位区间内共扫描到286个SSRs,其中单核苷酸和二核苷酸重复类型数目最多,分别为92个和103个,出现次数最多的基序分别是A/T和AT/AT;SSRs重复次数大多集中在4~10次。共成功设计、合成了186对SSR引物,其中5对具有多态性的SSR标记与RILs群体的果壳类型形态学标记(a7GK)的连锁分析表明,SSR标记FtgGKssr-149和FtgGKssr-175与果壳类型连锁最紧密。对32个苦荞品种(系)果壳率和多态性SSR标记的关联分析表明,标记FtgGKssr-147、FtgGKssr-149和FtgGKssr-175与果壳率显著或极显著关联。本研究得到了3个与果壳类型紧密连锁以及和果壳率显著关联的SSR标记,可用于薄壳苦荞种质的分子标记辅助选择,对加速薄壳苦荞品种的育种进程具有重要意义。

• 奶牛妊娠相关糖蛋白PAG6多克隆抗体的制备及鉴定

  李志明, 袁梦仪, 许海涛, 蔡德霖, 王相国, 肖龙菲, 安红, 王颖秋, 王骞, 郭勇, 齐晓龙, 倪和民

  基于抗原抗体反应检测奶牛(Bos taurus)血液中妊娠相关糖蛋白(pregnancy-associated glycoproteins, PAGs)是目前世界上应用最普遍的牛早孕检测技术,以boPAG6作为标志物应用于母牛早期妊娠诊断的准确性更高,因此制备高敏感性的boPAG6多克隆抗体,能为奶牛早期妊娠诊断试剂盒的研发提供支持。本研究利用PCR技术扩增荷斯坦奶牛boPAG6 (GenBank No. NM_176617.2)基因,构建重组质粒pET30a-boPAG6;在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中表达His-boPAG6蛋白并优化,以重组蛋白His-boPAG6作为免疫原免疫BALB/c小鼠(Mus musculus)制备多克隆抗体,用ELISA方法检测血清效价,Western blot方法检测纯化后的抗体分别与重组蛋白His-boPAG6和奶牛血清的特异性反应,利用免疫荧光技术定位boPAG6在原代滋养层细胞中的表达。结果显示,本研究成功构建出大小为6 534 bp的重组质粒pET30a-boPAG6,并在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)终浓度为0.5 mmol/L、诱导时间为8 h的条件下表达的His-boPAG6量最高,其蛋白分子质量为50 kD。以纯化后浓度为0.412 mg/mL的His-boPAG6蛋白免疫,ELISA中抗血清的效价为1∶102 400,多克隆抗体能特异性识别His-boPAG6抗原并有效区分妊娠和未妊娠奶牛血清,还可检测到原代滋养层细胞中存在boPAG6蛋白。本研究成功制备了boPAG6多克隆抗体,为奶牛早期妊娠ELISA检测系统的开发提供了理论支持。

• 黄瓜绿斑驳花叶病毒SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测方法的建立

  田沂民, 吴建祥, 陈磊, 罗金燕, 滕凯, 叶军, 杜伟, 于翠

  黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)是我国重要的检疫性植物种传病毒,在世界各地均有发生,造成西瓜(Citrullus lanatus)、黄瓜(Cucumis sativus)、甜瓜(Cucumis melo)等作物的严重经济损失。CGMMV可由种子直接传播至下一代秧苗,为保障种子贸易顺利进行,有必要建立快速而准确的病毒检测方法。本研究以截获的带毒种子为材料,针对CGMMV建立了SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测方法,其中设计筛选特异、灵敏的引物是关键。利用多次筛选得到的引物对建立了SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测方法,实验结果表明该方法能够特异地检测CGMMV,不与其他侵染葫芦科植物的病毒发生交叉反应;灵敏度是RT-PCR方法的1 000倍,是TaqMan探针实时荧光RT-PCR方法的100倍;且整个检测过程可在2.5 h内完成,是一种快速、灵敏、可靠的检测方法;应用该方法及TaqMan实时荧光RT-PCR方法同时对国内外198份种苗样品进行检测,结果显示kappa值大于0.82,说明两种方法具有高度一致性,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR方法有效、可靠,为种子快速通关提供新的技术手段。