农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2019年第7期

• 基于核糖体跳跃的多顺反子共表达技术在拟南芥上的应用

  吴立柱, 安叶芝, 张洁, 孙天杰, 王冬梅

  2A肽的核糖体跳跃技术是一种新型技术。其2A肽是长度为18~22个氨基酸的顺式作用水解酶元件,具有结构短小、蛋白分割效率高的特点,因而被越来越多应用于多顺反子表达载体的构建中。该项技术目前主要集中于酵母(Saccharomyces cerevisiae)和哺乳动物细胞的研究中,在植物中的报道较少。为探索该技术在植物中的应用研究,本研究利用猪捷申病毒2A (Porcine teschovirus-1 2A, P2A)和东亚细亚病毒2A (Thosea asigna virus 2A, T2A),首次将人工合成的转录因子XVE (X, the DNA-binding domain of the bacterial repressor LexA; V, the acidic transactivating domain of VP16; E, the regulatory region of the human estrogen receptor)、绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein, GFP)和抗除草剂基因(bialaphos resistance, Bar)3个基因的开放阅读框(open reading fragment, ORF)串联后受35S启动子调控,构建成多顺反子共表达载体pX6-2A,转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)后经PCR鉴定获得了转基因阳性植株;Western blot结果显示XVE,GFP和Bar 3个目的蛋白全部被分割完成,说明P2A和T2A肽在植物材料中可以转录、表达和翻译,且在分割过程中不会互相干扰,是一种理想的多顺反子表达方式。本研究结果表明P2A和T2A在植物材料中能够完成高效分割,行使其“核糖体跳跃”的功能,适用于在植物材料中的应用研究,该研究结果对2A肽在转基因植物中的推广应用具有重要的理论和借鉴意义。

• 山葡萄VaCBL01基因克隆及其与VaCIPKs蛋白互作分析

  申威, 姚文孔, 郑巧玲, 张宁波, 徐伟荣

  类钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcineurin B-like proteins, CBLs)为近年来新发现的一类植物Ca2+传感器蛋白,能与其互作的蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases, CIPKs)选择性特异结合,在调控植物响应非生物胁迫信号转导中发挥重要的作用。为了鉴定葡萄属(Vitis)植物CBLs基因参与逆境胁迫的功能特点,以抗寒种质山葡萄'左山-1' (Vitis amurensis 'Zuoshan-1')为试材,采用同源克隆获得了类钙调磷酸酶B蛋白家族成员VaCBL01基因。分析其序列与结构表明,VaCBL01基因(GenBank No. MH921999) ORF为642 bp,编码213个氨基酸,有4个EF-hand保守结构域,蛋白N端具有豆蔻酰化位点。VaCBL01位于葡萄第2条染色体的5 571 989~5 581 623基因座。系统进化聚类分析表明,VaCBL01与欧洲葡萄(Vitis vinifera)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、番茄(Solanum lycopersicum)和毛果杨(Populus trichocarpa)中CBL01蛋白同源性最高,分别为100%、95.3%、95.3%与94.8%,并具有较近的系统进化距离。利用qRT-PCR检测VaCBL01基因在不同组织器官的表达量及响应脱落酸(abscisic acid, ABA)与低温胁迫的表达模式,结果显示,该基因为组成型表达,但在卷须中表达相对较高;其表达与ABA和低温胁迫有关。同时,通过酵母双杂交互作分析研究发现,19个山葡萄VaCIPKs均无自毒性和自激活活性,并且山葡萄VaCBL01与VaCIPKs蛋白之间的相互作用的特异性和强度不同。VaCBL01与12个CIPKs (VaCIPK01, 02, 04, 06, 09, 10, 11, 12, 13, 16, 17和18)有强烈的互作;与另外5个CIPKs (VaCIPK03, 07, 15, 19和20)互作强度较弱,但与2个CIPKs (VaCIPK08和14)没有任何互作作用。本研究结果为深入开展葡萄CBL-CIPK信号网络功能研究提供了基础资料。

• 丹波黑大豆GmMATE2基因的克隆及功能鉴定

  胡俊, 刘卢生, 韩蓉蓉, 魏运民, 汪莹, 蒋曹德, 玉永雄

  丹波黑大豆(Glycine max 'Tamba')是一种耐铝植物,其耐铝机制是根尖分泌柠檬酸络合铝离子。为了发掘其优异的耐铝基因资源,本研究以丹波黑大豆铝胁迫转录组数据为基础,利用反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)克隆了1个编码丹波黑大豆柠檬酸通道蛋白基因,命名为GmMATE2(GenBank No. MF497433.1)。该基因的CDS序列长度为1 674 bp,预测编码557个氨基酸,分子量为60.38 kD,等电点为9.54。GmMATE2蛋白不稳定性指数为28.38,是稳定蛋白质。氨基酸序列分析表明,GmMATE2含有9个跨膜结构、1个Polysacc_synt_C结构域及2个多药及毒性复合物排出转运蛋白(multidrug and toxic compound extrusion, MATE)家族特有的MatE结构。进化树分析表明,GmMATE2与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、白车轴草(Trifolium repens)和鹰嘴豆(Cicer arietinum)的MATE蛋白亲缘关系较近。丹波黑大豆在铝胁迫(pH 4.5, 0.5 mmol/L CaCl2, 100 μmol/L AlCl3)下,利用半定量RT-PCR分析表明,GmMATE2在根尖上调表达,24 h时表达量最高,根尖柠檬酸的分泌量随着时间的延长而增多,表明该基因参与铝胁迫反应。构建过表达载体pBI121-GmMATE2,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum),获得3株转基因烟草植株。对转基因烟草进行耐铝分析,在铝胁迫(pH 4.5, 0.5 mmol/L CaCl2, 50 μmol/L AlCl3)下,qRT-PCR分析表明,在转基因烟草中GmMATE2上调表达;转基因烟草根尖柠檬酸分泌量是野生型的2.56~3.79倍;转基因烟草根相对伸长量是野生型的1.91~3.45倍;转基因烟草根尖铬天青S染色较野生型浅。上述结果表明,丹波黑大豆GmMATE2是柠檬酸通道蛋白基因,能提高转基因烟草柠檬酸分泌量及耐铝性。本研究为改良铝敏感植物的耐铝性提供了基因资源。

• 高油酸油菜脂肪酸代谢相关微效基因筛选及验证

  王晓丹, 肖钢, 张振乾, 官春云

  油菜(Brassica napus)油酸遗传机理复杂,目前多集中于主效基因脂肪酸去饱和酶2 (fatty acid desaturase 2, FAD2)的研究,对与其相关的微效基因研究较少。为发掘相关基因,促进高油酸油菜脂肪酸代谢研究,本研究以20个高油酸油菜品系为材料,通过气相色谱(gas chromatography, GC)测定其脂肪酸组成,并利用qRT-PCR技术测定经miRNA测序初步筛选得到的与脂肪酸代谢相关基因1,2-氧代二烯酸还原酶(1,2-oxo-phytodienoic acid reductase, OPR)与乙酰转移酶(acetyltransferase, AT)基因的表达情况,同时分析二者与不同脂肪酸成分间的关系。结果表明,油酸含量与亚油酸、亚麻酸含量均呈极显著负相关,亚油酸与亚麻酸以及棕榈酸之间两两呈显著或极显著正相关;OPR与AT基因在整个生长期表达规律相似,在苗期表达量逐渐升高,在花期盛开的花中表达量最高,角果期则逐渐下降,但OPR基因表达量比内参基因低得多,AT则相反;综合两基因表达情况并结合脂肪酸成分分析可知,AT在5~6叶期叶、蕾薹期叶以及35 d自交种中均与油酸、亚油酸、亚麻酸有显著(极显著)相关性;OPR在整个角果期自交种中与油酸呈显著正相关、与亚油酸和亚麻酸呈显著负相关。研究结果表明,OPR和AT基因可能为控制油酸合成的微效基因,且AT可用于早期筛选高油酸材料。本研究结果为高油酸油菜分子机理研究提供了基础资料。

• 棉花GhJAZ10基因的克隆及其对干旱胁迫的响应

  李东亮, 王彩香, 赵阁, 肖钰, 葛晓阳, 李付广, 杨青华

  JAZ (jasmonate ZIM-domain)是调控茉莉酸信号途径的主要调节因子,在调控植物发育、响应生物和非生物胁迫中具有重要作用。本研究从陆地棉(Gossypium hirsutum) '中棉所24' (CRI24)中克隆出GhJAZ10基因(GenBank No. XM_016834302.1),全长723 bp,编码240个氨基酸,含有TIFY和Jas保守结构域。通过融合GFP报告基因并瞬时转化烟草(Nicotiana tabacum)进行亚细胞定位,结果显示,GhJAZ10定位于细胞核。采用qRT-PCR分析该基因的组织表达模式和PEG6000处理下不同栽培种中JAZ10的表达模式,结果显示,JAZ10在花的各部分组织、根和茎中具有较高的表达量;在四倍体陆地棉(CRI24和陆地棉标准系TM-1)、二倍体亚洲棉(Gossypium arboretum) '石系亚1号'和二倍体野生棉雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)等4种材料中,PEG6000处理可上调JAZ10表达。将GhJAZ10通过蘸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),并通过抗性筛选得到纯合的转基因株系,结果显示,转基因株系的气孔数目比野生型显著减少,干旱条件下根长和鲜重显著增加,胁迫响应基因DREB2A (dehydration-responsive element binding protein 2A)、RD22 (responsive to desiccation 22)、DREB1A和DREB1B在转基因株系中均被诱导上调表达。本研究从分子水平初步证明了GhJAZ10与干旱胁迫应答的关系,为深入探讨其抗旱的分子机制提供了理论参考。

• 海岛棉GbAGL15和GbAIL5的克隆及其在低温诱导XH16体胚发生同步化过程中的表达

  周静, 郭家雁, 杨瑞思, 陈全家, 曲延英, 高文伟, 张霞

  体细胞胚胎发生的同步化有助于加快作物分子育种的进程,体胚发生过程中Agamous-like15 (AGL15)、Aintegumenta-like5 (AIL5)等关键基因特异性表达起着类似开关的作用。为了进一步探明低温诱导体细胞胚胎同步化发生的分子机理,本研究利用同源序列从海岛棉(Gossypium barbadense) XH16胚性愈伤组织中克隆得到GbAGL15 (GenBank No. MK580460)和GbAIL5 (GenBank No. MK591943)核苷酸序列,并利用qRT-PCR技术研究低温处理后胚性细胞中GbAGL15和GbAIL5基因的表达模式。结果表明,GbAGL15基因编码区全长为753 bp,编码250个氨基酸,含有MADS-MEF2-like结构域和K-box保守区,与雷蒙德氏棉(G. raimondii) GrAGL15、亚洲棉(G. arboretum) GaAGL15亲缘关系较近;GbAIL5基因编码区全长为1 626 bp,编码541个氨基酸,含有2个AP2结构域,与陆地棉(G. hirsutum) GhAIL5在同一进化分支上。qRT-PCR显示,在胚性愈伤组织低温处理后GbAGL15基因与对照组相比表达量极显著的降低(P<0.01),GbAIL5基因的表达量呈现缓慢下降的趋势,推测GbAGL15和GbAIL5基因参与体细胞胚胎发生并起调控作用,在低温条件下其基因表达被抑制,致使低温处理下胚性愈伤组织发育分化停滞,从而促进体胚的同步化发生。本研究为揭示海岛棉体细胞同步化发生的分子机制提供了理论依据,有助于海岛棉体细胞胚发生的遗传转化体系的建立。

• 小滴玻璃化法超低温保存海岛棉XH33胚性细胞的研究

  李伦政, 古丽娜尔·艾拜都拉, 杨瑞思, 周静, 陈全家, 曲延英, 张霞

  目前棉花转基因技术高度依赖于体细胞胚胎发生方式,而在体细胞胚发生过程中的胚性细胞保存和利用需要继代培养,可能引起保存材料发生遗传变异或导致物种退化,不利于资源保存和利用,而超低温保存能最大限度地保持材料的遗传稳定性。本研究以海岛棉(Gossypium barbadense) XH33胚性细胞为材料,分别从预培养、玻璃化溶液及处理时间、化冻方法以及恢复培养方法等方面进行优化,建立小滴玻璃化法超低温保存新疆海岛棉胚性细胞的方法;进一步通过流式细胞术、SSR分子标记和生理指标检测等方法验证小滴玻璃化法超低温保存后的胚性细胞遗传稳定性。结果表明,4 ℃条件下,XH33胚性细胞在0.3、0.5、0.7 mol/L梯度浓度蔗糖培养基上预培养3 d,然后在植物玻璃化溶液(plant vitrification solutions 2, PVS2)中装载20 min和脱水20 min;液氮保存12 h后,经40 ℃水浴解冻,并以0.5、0.7、1.0 mol/L梯度浓度蔗糖溶液洗涤;暗培养3 d后正常培养,细胞存活率高达55.55%。流式细胞术和SSR分子标记结果表明,超低温冷冻并未影响细胞的遗传稳定性;生理指标检测结果显示,冷冻后细胞的生理活性并未发生显著变化。本研究建立了海岛棉胚性细胞小滴玻璃化法超低温保存的技术体系,为海岛棉胚性细胞的长期保存提供了参考依据。

• 利用mtDNA D-loop区研究贵州猪种的遗传多样性与起源

  赵忠海, 周迪, 李辉, 易恒洁, 龙清孟, 师新彩, 卜小雁, 陈林, 杨华婷, 李兴才

  线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)作为核外遗传物质,承载着重要的遗传信息,其D-loop区序列能反应出物种的遗传多样性。为了对贵州猪(Sus scrofa domesticus)种的遗传多样性进行评估,本研究选取了高坡猪、关岭猪、从江香猪、黔南黑猪、黔北黑猪、柯乐猪、江口萝卜猪、宗地花猪、白洗猪和糯谷猪共10个贵州省地方猪种与梅山猪、荣昌猪和大白猪3个外地品种作为研究对象,利用PCR扩增技术结合直接测序的方法对mtDNA的D-loop区全序列进行扩增分析。结果显示,实验群体的mtDNA D-loop区全序列为1 117~1 148 bp,共12种长度的序列,除了宗地花猪的碱基组成差异较大,其他品种的碱基含量基本无差异,均表现为T的含量最高,C的含量最低,碱基A+T含量明显高于C+G;在有效测序结果的149条拼接序列中发现66个多态位点,定义了16种单倍型,单倍型多样性为0.421 5。分析高坡猪群体与其他猪种群体之间遗传关系,发现其间基因交流较少,基因交流值(Nm)均小于1;高坡猪与宗地花猪之间的遗传分化指数最高,遗传分化指数(Fst)值为0.412 78,高坡猪与黔南黑猪和关岭猪的遗传分化指数较低,说明三者之间的遗传关系较近。进行品种间的遗传多样性分析时发现,高坡猪与黔北黑猪亲缘关系较近,而宗地花猪与其他12个品种的亲缘关系都较远。综合本研究结果可推测,目前10个贵州地方猪种的遗传多样性受到外来品种的影响。本研究为进一步了解贵州猪种起源分化以及遗传多样性提供理论支持,并为地方猪种保护提供参考资料。

• PER1基因组织表达及多态性与绵羊季节性繁殖的相关性研究

  向光明, 刘秋月, 王翔宇, 狄冉, 胡文萍, 马琳, 曾宪垠, 储明星, 曹晓涵

  绵羊(Ovis aries)的季节性繁殖限制了中国绵羊产业的发展,从分子水平上探究影响绵羊季节性繁殖的关键基因具有重要意义。为了探究钟基因1 (period 1 gene, PER1)基因表达水平及其多态性与绵羊季节性繁殖的相关性,本实验通过半定量反转录PCR技术(semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, sqRT-PCR)和荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)技术研究PER1基因在季节性发情的苏尼特羊和常年发情的小尾寒羊不同组织(松果体, 下丘脑, 垂体, 卵巢, 输卵管和子宫)中的表达,同时采用Sequenom MassARRAY®SNP技术,对季节性发情绵羊品种(草原型藏羊, 苏尼特羊, 滩羊)和常年发情绵羊品种(小尾寒羊, 湖羊, 策勒黑羊)中PER1基因g.27342699G>A和g.27346502A>G的多态性进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明,PER1基因在不同发情性状绵羊所选的各个组织中均表达,其表达量在季节性发情的苏尼特羊中均高于常年发情的小尾寒羊,且在松果体、卵巢和输卵管中达到显著差异(P<0.05)。分型结果表明,PER1基因的两个多态位点g.27342699G>A和g.27346502A>G均存在3种基因型,但只有g.27342699G>A位点的等位基因频率在季节性发情和常年发情的绵羊品种中达到显著差异水平(P<0.05)。关联分析结果表明,PER1基因2个SNPs位点多态性与小尾寒羊各胎产羔数无显著关联。从以上结果可以看出,在重要的繁殖相关组织(松果体, 卵巢和子宫)中,PER1基因在季节性繁殖绵羊品种中表达量均高于常年发情绵羊品种,初步推测PER1的高表达很可能与季节性发情调控有关,这将为研究季节性发情机制提供理论依据。

• 陕北白绒山羊POU1F1基因3'-UTR多态性及其与生长性状的相关分析

  杨韩, 张阳海, 王敏, 康雨欣, 朱海鲸, 蓝贤勇, 屈雷, 闫海龙, 潘传英

  垂体特异性转录因子1 (pituitary specific transcription factor 1, POU1F1)是POU家族(垂体特异性转录因子Pit-1, 八聚体结合蛋白Oct-1 和Oct-2 及美丽新小杆线虫神经Unc-86)成员之一,对哺乳动物生长发育起着重要作用。为了探究POU1F1基因侧翼序列多态性对陕北白绒山羊(Shaanbei white cashmere goats, SBWC goats) (Capra hircus)生长性状的遗传效应,本研究以621只陕北白绒山羊为研究对象,利用DNA直接测序法检测POU1F1基因3'-非翻译区(3'-untranslated region, 3'-UTR)的多态位点并对其进行基因分型,同时分析多态位点不同基因型与陕北白绒山羊生长性状之间的关联性。结果表明,在POU1F1基因3'-UTR检测到一个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP) (NC_030808.1:g.34235967T>C),其位于3'-UTR第164位(c.876+164A>G)。该位点等位基因A和G的频率分别为0.894和0.106,有效等位基因数(number of effective alleles, Ne)为1.235,基因纯合度(homozygosity, Ho)为0.810,基因杂合度(heterozygosity, He)为0.190,多态信息含量(polymorphism information content, PIC)为0.172,属于低度多态;该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。进一步的相关性分析表明,c.876+164A>G位点与山羊的体长和管围性状显著相关(P<0.05),且AG型个体在体长及管围方面显著优于其他基因型个体,而对其他体尺指标在统计学上无显著影响(P>0.05)。此外,通过生物信息学分析发现,当该位点突变时,可能会影响转录因子—骨髓增生异常综合征1/亲嗜性病毒整合位点-1样基因1 (myelodysplasia syndrome 1/ecotropic viral integration site1-like gene 1, MEL1)与POU1F1基因的正常结合,从而解除对POU1F1基因的抑制,促进该基因表达,进而影响个体生长发育。综上,POU1F1基因c.876+164A>G位点对陕北白绒山羊体长和管围等生长性状有显著影响,可以作为陕北白绒山羊生长性状分子标记辅助选择的候选标记,为陕北白绒山羊的选育改良提供科学资料。

• 花椒窄吉丁雌、雄成虫触角差异表达基因的初步筛选

  巩雪芳, 谢寿安, 杨平, 胡洪焰, 郭莉, 车显荣, 陈迪, 王延来, 吕淑杰

  花椒窄吉丁(Agrilus zanthoxylumi)是我国北方花椒(Zanthoxylum bungeanum)产区一种重要的毁灭性的蛀干害虫,该昆虫主要通过触角的灵敏性和特异性识别挥发性气味分子,触角对其生存和繁衍起着重要作用。为了筛选出花椒窄吉丁雌、雄成虫触角中差异表达的基因,初步解析花椒窄吉丁触角中与信息素结合功能相关的候选差异基因,本研究选取雌、雄成虫触角为研究对象进行了转录组测序,在获得转录组测序数据后,借助生物信息学软件对其进行分析,筛选出了花椒窄吉丁成虫触角中雌、雄两性间差异表达的基因,并进行相关差异表达基因的功能富集统计。花椒窄吉丁雌、雄成虫触角转录组数据共获得36 209个unigenes,共检测到726个基因有显著表达差异,其中459个基因上调,267个基因下调。通过基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析发现,差异基因显著富集于结合功能、催化活性、细胞进程、代谢过程、细胞组分、细胞器。共有472条差异基因在KEGG数据库中得到了注释,对其进行Pathway富集分析表明,共参与到165条代谢途径中,表达上调共394个,表达下调共78个基因。本研究首次利用转录组测序技术对花椒窄吉丁成虫触角活性成分富集的遗传基础进行了分析,在组学层面上分析探讨了成虫触角差异表达的基因,对于揭示基因功能、了解基因间相互关系,进一步完善触角感受外界气味物质的机理起着至关重要的作用,同时也为害虫生物防控技术提供基础资料。

• 凹大叶蝉线粒体全基因组序列分析及系统发育关系

  俞鹏飞, 李倩, 王梦馨, 潘铖, 崔林, 韩宝瑜

  凹大叶蝉(Bothrogonia ferruginea)是我国一类重要的农业经济害虫,测序和分析凹大叶蝉线粒体基因组,并在线粒体水平上探讨凹大叶蝉在头喙亚目中的系统发育地位,对凹大叶蝉系统分类研究具有重要的意义。本研究采用PCR扩增与克隆测序技术,拼接获得凹大叶蝉线粒体基因组全序列,基于蛋白质编码基因的串联序列构建系统发育树。凹大叶蝉线粒体基因组全长15 262 bp (GenBank No. KU167550),包括13个蛋白编码基因(protein-coding genes, PCGs),22个tRNA基因,2个rRNA基因和一段A+T富集区,呈现出与头喙亚目昆虫一致的核苷酸组成和基因排布顺序。基因组碱基A+T含量为76.48%,AT偏度率为0.170 2。基因重叠区域共计14处,基因间隔区域共计10处。A+T富含区内存在ATTTA碱基序列并在其后存在一个典型的微卫星结构(TA)25。叶蝉科昆虫A+T富集区的串联重复区被发现存在ATCTA和CCCTCT两段特殊结构,而角蝉科和其他头喙亚目昆虫未发现此特殊结构。头喙亚目22个种基于线粒体基因组的系统发育关系发现为沫蝉总科+(蜡蝉总科+角蝉总科),凹大叶蝉与檬果褐叶蝉(Idioscopus nitidulus)等4种叶蝉归属于头喙亚目角蝉总科叶蝉科。凹大叶蝉线粒体基因组的基因排布与叶蝉科其他昆虫完全相同,基于线粒体基因组的头喙亚目系统发育关系与传统形态学研究结果一致：凹大叶蝉归属于头喙亚目角蝉总科叶蝉科。本研究为头喙亚目系统分类的深入研究提供了数据资料。

• 苏云金芽胞杆菌Vip3Aa11蛋白定点突变对甜菜夜蛾和棉铃虫杀虫活性的影响

  刘明, 孙海燕, 李海涛, 高继国

  营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins, Vips)与杀虫晶体蛋白相比,在氨基酸序列进化上没有同源性,杀虫作用位点上也无竞争关系。由于Vips蛋白结构尚未解析,其杀虫作用机制的研究相对滞后。为明确影响苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt) Vip3Aa11蛋白杀虫活性的关键氨基酸,本研究对Vip3Aa11中3个氨基酸位点进行定点突变,构建3个突变体蛋白G200S、F442S、S726T,并对其进行甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)及棉铃虫(Heliothis armigera)的杀虫活性测定。结果显示,突变体蛋白S726T对甜菜夜蛾的杀虫活性是野生型Vip3Aa11的4倍,对棉铃虫的杀虫活性没有显著变化;其他突变体蛋白对甜菜夜蛾及棉铃虫的杀虫活性均无显著变化。Vip3Aa11与各突变体蛋白对胰蛋白酶的敏感性一致。二级结构预测表明突变体蛋白S726T的构象发生了α-螺旋后移,说明S726T突变体引起的杀虫活性提高可能与蛋白结构的空间细微变化有关。本研究比较了Vip3Aa11与各突变体蛋白之间的杀虫活性差异,并初步分析了差异产生的原因,为研究Vip3Aa类蛋白的结构和杀虫机理提供了参考依据。

• 嗜线虫致病杆菌PirAB毒素对棉铃虫相关酶活性的影响

  郭笑笑, 杨晴, 刘淑琴, 王勤英, 南宫自艳

  昆虫病原线虫(entomopathogenic nematode)共生菌及杀虫毒素一直是农业害虫生物防治领域的研究热点。PirAB (photorhabdus insect related toxin AB)蛋白是来自昆虫病原线虫共生菌的一种特殊二元毒素,本研究针对该毒素的杀虫特性及对寄主昆虫酶活的影响开展相关研究。首先对嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila) HB310菌株的pirAB基因进行原核表达,采用血腔注射的方法测定PirAB毒素对四龄棉铃虫(Helicoverpa armigera)的生物活性,并进一步测定对寄主体内乙酰胆碱酯酶、解毒酶(羧酸酯酶和多酚氧化酶)、保护酶(过氧化物酶和酪氨酸酶)活力的影响。结果表明,重组PirAB蛋白对四龄棉铃虫表现出很高的血腔注射活性(LD50=2.003 μg/头)。在注射LD50剂量的PirAB毒素后,寄主体内乙酰胆碱酯酶活性与对照组差异不显著;羧酸酯酶活性呈现激活、抑制、再次激活的剧烈变化,处理36 h后趋于稳定;多酚氧化酶活性同样出现先激活、后抑制的变化趋势,24 h后活性变化趋于平稳,并且显著低于对照组(P<0.05);酪氨酸酶活性在毒素处理后基本处于抑制状态,12~36 h之间出现1次显著变化,急剧降低并再次升高,与对照组活性持平;过氧化物酶活性整体变化趋势不明显,持续低于对照组。本研究为揭示寄主昆虫对PirAB毒素的免疫机制提供了基础资料。

• 大肠杆菌二核苷酸环化酶催化c-di-GMP生物合成

  贾宾, 张维, 郭豫杰, 孔江南, 杨雪宸, 庞博文, 杨国宇, 郑悦亭

  环二鸟苷酸(bis-(3'-5')-cyclic dimeric guanosine monophosphate, c-di-GMP)是广泛存在于细菌中的第二信使分子,可通过STING (stimulator of interferon genes)信号通路参与先天免疫应答,是一种潜在的疫苗佐剂。为明确其先天免疫调节机制和评估免疫佐剂效果,c-di-GMP的高效合成急需解决。为建立一种相对简单、高效的c-di-GMP生物合成方法,实现体外制备c-di-GMP,本研究构建大肠杆菌(Escherichia coli)二核苷酸环化酶(dinucleotide cyclase V, DncV)重组表达载体,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达和His亲和纯化获得目的蛋白DncV;利用超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography, UPLC)检测DncV重组蛋白体外催化GTP生成c-di-GMP的反应。研究结果表明,IPTG诱导型表达载体pET-28a-His-DncV构建成功,亲和纯化获得的DncV重组蛋白纯度达到92%;该重组蛋白能够通过酶促反应一步生成c-di-GMP;金属离子对该酶活性影响显著,其中3种金属离子(Mg2+, Mn2+, Co2+)可提高催化效率,另外7种金属离子(Cu2+, Zn2+, Ni2+, Mo2+, Bo2+, Fe2+, Ca2+)抑制酶促反应。本研究建立了E. coli DncV重组蛋白催化合成c-di-GMP的方法体系,为c-di-GMP的大规模制备和功能研究提供了基础资料。

• 一株耐冷好氧反硝化菌的同时硝化反硝化特性

  向书迪, 冶青, 冯密, 李振轮

  在之前的研究中,本实验室从长期淹水的冬水田中分离筛选出一株耐冷好氧反硝化菌株Y-12,本研究采用菌株Y-12,利用单一氮源(铵态氮(NH4+-N), 硝态氮(NO3--N)和亚硝态氮(NO2--N))和不同浓度的混合氮源(铵态氮加硝态氮或铵态氮加亚硝态氮)研究其在15 ℃时的硝化、反硝化及同时硝化反硝化特性。结果表明,在15 ℃条件下,当氮源为铵态氮时,菌株Y-12对NH4+-N和总氮(total nitrogen, TN)的去除率分别为100%和46.2%;当氮源为硝态氮时,对NO3--N和TN的去除率分别为99.7%和53.6%;当氮源为亚硝态氮时,对NO2--N和TN的去除率分别为99.9%和57.7%;对低浓度混合氮源(5 mg/L NH4+-N+5 mg/L NO3--N, 5 mg/L NH4+-N+5 mg/L NO2--N)的总氮去除率分别为50.0%和52.4%;对高浓度混合氮源(100 mg/L NH4+-N+100 mg/L NO3--N, 100mg/L NH4+-N+100 mg/L NO2--N)的总氮去除率分别为31.8%和24.7%,且均能有效去除铵态氮、硝态氮和亚硝态氮。混合氮源条件下pH上升至9.0左右时菌株仍能生长。实验证明菌株Y-12是一株耐冷好氧反硝化菌,且具有一定的耐碱能力,对低温和碱性废水(特别是含铵态氮)处理有较好的优势和应用潜力,为晚秋至初春时期同时处理含多种氮源的污水提供了理论基础和备选菌株。

• 植物生长调节剂诱导无籽果实研究进展

  李慧, 沙马石体, 胡军超, 袁明

  无籽果实以其可食率高、口感好和食用方便等优点深受消费者青睐。无籽是果实一个重要经济性状,也是品种选育一项重要指标。未经受精作用而子房发育的单性结实和受精后种子败育都可以得到无籽果实。本文综述了生长素、赤霉素、细胞分裂素和乙烯在无籽果实形成过程中的作用及其机制,并探讨了果实形成过程中植物激素的相互作用。

• 转基因大豆MON89788实时荧光重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

  谢实龙, 汪小福, 丁晨露, 祝旋, 汤婷, 马同富, 蔡健, 徐俊锋

  MON89788是较早被批准商业化种植的转基因大豆(Glycine max)品种,种植范围广,产品流通量大。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA),针对MON89788的转化体特异性序列设计了引物和探针,利用正反向引物筛选的方法获得了最佳引物组合,并对反应的温度、引物和探针的浓度进行了优化选择。结果表明,RPA在29.5~43.1 ℃范围内都能扩增,对温度的容忍度较大,高浓度的探针会影响实时荧光RPA的扩增效率。同时对实时荧光RPA检测体系的特异性、灵敏度和适用性等进行测试,最终建立了MON89788实时荧光RPA检测方法。该检测方法特异性强,对MON89788的绝对检测限(absolute limit of detection, aLOD)可达到40拷贝,相对检测限(relative limit of detection, rLOD)为0.05%,对实际样品的检测在39 ℃,10 min内完成,是实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测时间的0.07~0.13倍。该恒温、快速的检测方法为转基因成分的快速检测提供了新的技术支持,有望用于转基因成分的现场快速检测。

• 鉴别猪流行性腹泻病毒基因型的一步法双重qRT-PCR

  何海健, 吴瑗, 刘正奎, 王志鹏, 陈琳, 王磊, 宋厚辉, 王晓杜

  猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是目前导致猪(Sus scrofa domestica)群严重腹泻的主要病原体之一,临床中危害最严重的是PEDV变异毒株(GⅡ型)。建立快速准确的诊断方法可鉴别临床上PEDV的基因型,有利于开展不同基因型的PEDV防控。本研究针对PEDV的纤突蛋白(spike, S)基因N端的相对保守区设计1对引物,同时针对变异毒株(GⅡ型)和经典毒株(GⅠ型)的差异区域设计2个探针,探针采用5-羧基荧光素(5-carboxyfluorescein, FAM)(GⅡ型)和5-六氯荧光素氨基磷酸酯(5-hexachloro-fluorescein hosphoramidite, HEX)(GⅠ型)荧光信号分别标记,通过扩增条件摸索、特异性、敏感性、重复性等实验,建立一种基于探针的一步法双重qRT-PCR检测技术,用于鉴别猪流行性腹泻病毒的不同基因型。结果显示：本研究建立了该方法的标准曲线,该方法在10-1~108拷贝数/μL范围内,检测GⅡ毒株(R2=0.9892)和GⅠ型毒株(R2=0.9914)具有较好的扩增效率,Ct值与浓度之间具有较好线性关系;检测灵敏度分别为GⅡ毒株7.34拷贝数/μL和2.3×102半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose, TCID50)/0.1 mL、GⅠ型毒株4.32拷贝数/μL和4.3×103 TCID50/0.1 mL;GⅠ型和GⅡ型之间没有交叉反应,且与猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪瘟病毒(Classic swine fever virus, CSFV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus, RV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)及猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)等病毒核酸之间没有交叉反应,特异性较好;组间和组内变异系数低,重复性好;临床样品检测结果与病毒分离方法符合率为100%。本研究为临床疑似PEDV感染病料的检测提供快速准确的鉴别方法,并可确定其基因型,为防控该病提供技术支持。

• 核糖体工程技术选育阿维拉霉素高产菌株

  刘华华, 陈宇航, 陈敏

  阿维拉霉素是一种新型的代谢调节剂和消化促进剂,被广泛应用于国内外畜禽养殖中。菌种产素能力低、发酵工艺不成熟等因素限制了阿维拉霉素在国内的工业化生产。本研究通过核糖体工程技术,采用链霉素对实验室保藏的绿色产色链霉菌菌株(Streptomyces viridochromogenes gs 77)进行抗性选育,以获得阿维拉霉素高产突变菌株。经过药敏试纸法和高效液相色谱法(HPLC)筛选获得一株阿维拉霉素高产突变菌株S. viridochromogenes gs 77-54,摇瓶第8天时阿维拉霉素产量达到最大,为出发菌株的1.80倍,传代实验表明突变菌株高产性能遗传稳定。对突变前后菌株的形态特征和rpsl基因(编码核糖体蛋白S12)分析,结果显示突变菌株的气生菌丝长直形、较为粗壮,孢子为直径约1.1 µm×0.6 µm的椭圆形,与出发菌株存在明显区别。rpsl基因序列分析结果发现,该基因片段出现点突变,第356位的G突变为A,由精氨酸突变为谷氨酰胺。本研究筛选到阿维拉霉素高产突变菌株,为绿色产色链霉菌菌种选育提供了新的参考资料。