农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2022年第3期

• AMPKα1不同功能位点的突变对小鼠卵母细胞成熟能力的影响

  石丽君, 任雪华, 虞莲, 王丽丽, 雷安民

  单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)作为哺乳细胞内调控代谢的关键酶,在卵母细胞成熟过程中发挥重要作用,但目前AMPK的催化亚基AMPKα1在小鼠(Mus musculus)卵母细胞成熟过程中发挥的作用尚不清楚。本研究利用重叠延伸PCR (splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR)技术对小鼠AMPKα1基因的多个位点进行了突变,分别获得AMPKα1-D157A、AMPKα1-T172D、AMPKα1-S485A以及AMPKα1-S485A-S173A突变体,在Hela细胞系中验证其功能后体外转录得到cRNAs,并通过显微注射技术在小鼠卵母细胞中超表达含有各突变位点的AMPKα1基因。结果显示,AMPKα1及其突变体在Hela细胞的胞质内广泛分布,且超表达AMPKα1-S485A突变体的细胞增殖数量和活性均增加;同时,AMPKα1及其突变体在小鼠卵母细胞中的超表达呈聚集分布,并与减数分裂过程中的染色质分离相关联。与对照组相比,除超表达AMPKα1-S485A组之外,其余各组的超表达都加速了小鼠卵母细胞的成熟进程,而超表达AMPKα1-S485A突变体的卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)率与对照组相比无显著差异,且增加了卵母细胞的极体排出率以及降低了卵母细胞的死亡率。以上结果表明,AMPKα1在小鼠卵母细胞成熟过程发挥着重要作用,为其后续在卵母细胞中的作用研究提供了参考。

• 过表达GbRac1基因增强大豆对疫霉根腐病的抗性

  王钟伟, 张原宇, 刘东波, 牛陆, 杨静, 杨向东, 仲晓芳

  疫霉根腐病(Phytophthora root and stem rot, PRR)是影响大豆(Glycine max)生产的毁灭性病害之一,可造成大豆产量损失10%~50%。转基因技术为抗疫霉根腐病大豆品种培育提供了有效手段。小G蛋白(small GTPases)作为植物信号转导中的“分子开关”,不仅在植物生长发育过程中参与调控植物对外界环境刺激的响应,同时在植物防卫反应的建立中也发挥着重要的作用。本研究将海岛棉(Gossypium barbadense)小G蛋白编码基因Rac1 (Gossypium barbadense Rac family small G protein 1, GbRac1)导入栽培大豆品种'Williams 82'中。Southern blot和逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)检测结果表明,外源基因已整合至大豆基因组中且能够稳定表达。T3和T4代转基因大豆株系的PRR抗性鉴定是采用下胚轴接种法接种疫霉菌1号生理小种,接种7 d后,对照品种'Williams 82'出现叶片萎蔫和植株死亡现象,而多数转基因植株则表现正常,其接种存活率为70.68%~90.63%,而对照存活率仅为40.74%~50.85%。在未接种疫霉菌1号生理小种的生长条件下,过表达GbRac1基因的转基因大豆株系的主要农艺性状与受体'Williams 82'相比没有显著差异。以上研究结果的获得,说明过表达GbRac1基因显著增强了转基因大豆对疫霉根腐病的抗性,且对其他表型性状未产生非特异性的影响。本研究为进一步拓宽大豆抗性遗传基础,培育抗疫霉根腐病大豆新品种提供了基础资料。

• 沉默GbGSTU7基因对海岛棉枯萎病抗性的影响

  邓晓娟, 陆小双, 陈琴, 张梦洁, 曲延英

  GSTU7基因编码谷胱甘肽转移酶(glutathiones transferases, GSTs),本课题组前期通过对枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)感染的海岛棉(Gossypium barbadense)转录组数据分析发现,GbGSTU7 (GenBank No. GB_A03G0575)基因响应抗枯萎病过程。为了验证GbGSTU7基因在海岛棉抗枯萎病中的作用,本研究利用烟草脆裂病毒(Tobacco tattle virus, TRV)诱导的基因沉默系统(virus-induced gene silencing, VIGS)沉默海岛棉抗病材料'06-146'中的GbGSTU7基因,通过qPCR技术分析GbGSTU7基因的表达情况;采用枯萎病7号生理小种侵染GbGSTU7基因沉默植株,以研究基因沉默植株的抗病性,同时对海岛棉谷胱甘肽过氧化物酶的活力进行测定、分析。结果显示,诱导植株GbGSTU7基因的沉默效率为74%,对棉花枯萎病的病情指数升高了31.4,可溶性蛋白含量上升了3倍,谷胱甘肽过氧化物酶活性降低了2倍。表明GbGSTU7基因在海岛棉的抗枯萎病反应中具有重要作用,GbGSTU7的沉默影响了蛋白转运,与谷胱甘肽过氧化物酶协同起到抵御病菌的侵染。本研究为深入探讨GbGSTU7基因参与海岛棉枯萎病中的抗性机制提供了参考依据。

• 薄壳山核桃和山核桃CDPK基因家族的鉴定及表达分析

  赵娟, 朱凯凯, 范平桦, 谭鹏鹏, 彭方仁, 李永荣

  钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase, CDPK)是植物特有的一类丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶,在植物生长发育和逆境信号转导过程中具有十分重要的作用。为了探讨CDPK在薄壳山核桃(Carya illinoinensis)和山核桃(Carya cathayensis)生长发育过程中的作用,本研究利用生物信息学手段从薄壳山核桃和山核桃基因组中鉴定CDPK基因家族,利用MEGA7.0软件进行多序列比对和系统进化树构建,并进行基因结构和保守基序分析。结果显示,本研究成功鉴定了28个薄壳山核桃CDPK基因家族成员(CILCDPK1~28)和25个山核桃CDPK基因家族成员(CCACDPK1~25);进一步构建薄壳山核桃、山核桃、拟南芥(Arabidopsis thaliana)以及水稻(Oryza sativa)的CDPK成员系统进化树,聚类分析结果显示CDPK蛋白分为4个亚组;顺式作用元件分析结果表明,所有CDPK基因均含有激素响应元件,其中数目最多的是脱落酸响应元件。薄壳山核桃和山核桃的转录组数据分析显示,3个CILCDPKs和2个CCACDPKs可能在胚胎发育的3个关键阶段发挥重要作用;薄壳山核桃嫁接愈合过程中,3个CDPK家族基因高表达,可能在薄壳山核桃愈伤组织和维管组织形成时期发挥重要作用。qPCR分析结果显示,CILCDPK1/3/6/11/13/19/25在干旱胁迫下基因表达上调。本研究为探讨CDPK基因家族在植物生长发育及干旱胁迫响应中的作用机制提供参考。

• 番红花R2R3-MYB转录因子的鉴定与时空表达分析

  吴瑞, 林定, 罗栋, 周伊汝, 张凌翼, 邵清松, 邢丙聪

  R2R3-MYB转录因子是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与了植物的次生代谢调控过程。为探究番红花(Crocus sativus)中R2R3-MYB转录因子的时空表达特征并筛选与番红花次生代谢相关的CsR2R3-MYB转录因子,本研究以其全长转录组测序数据为基础,利用生物信息学方法对CsR2R3-MYB转录因子进行鉴定和系统分析,并用qRT-PCR对其时空表达模式进行探讨。从番红花转录组中筛选出42个R2R3-MYB转录因子,理化性质分析结果显示均为不稳定亲水性蛋白,亚细胞定位预测结果显示大部分在细胞核中表达。与拟南芥(Arabidopsis thaliana) R2R3-MYB一同构建进化树,可将CsR2R3-MYB分为26个亚类,根据同源蛋白功能保守特性推测与S7、S19、S20亚组同源的CsMYB9、CsMYB16、CsMYB17、CsMYB18、CsMYB20和CsMYB21通过响应茉莉酸(jasmonic acid, JA)信号参与番红花活性物质的次生代谢调控。基因表达模式结果表明：CsMYB5、CsMYB6、CsMYB7、CsMYB9、CsMYB10、CsMYB13、CsMYB17、CsMYB19、CsMYB21、CsMYB22、CsMYB23、CsMYB26、CsMYB28、CsMYB30、CsMYB31与CsMYB32在柱头中表现出较高的表达量,并且响应了JA信号。前期研究发现JA可促进番红花类黄酮的生物合成,结合系统进化树及表达分析结果,筛选出CsMYB9、CsMYB17和CsMYB21可能通过响应JA信号参与番红花次生代谢进行调控。本研究为后续探究CsR2R3-MYB的功能提供参考,也为番红花次生代谢转录调控研究提供思路。

• YWHAZ基因对前列腺癌22RV1细胞增殖、迁移的影响

  李永, 赵佳福, 罗斌杰, 陈晨, 宋林锦, 许厚强

  前列腺癌是一种异质性疾病,具有高度的临床和基因异质性,拥有多调控治疗靶点。为研究14-3-3蛋白家族各亚型在前列腺癌不同细胞系中的表达图谱,寻找治疗前列腺癌的特异性药物靶点。本研究通过qPCR结合UALCAN-TCGA analysis数据库(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)对不同前列腺癌细胞系中14-3-3蛋白家族各亚型的表达模式进行分析;通过上调和下调酪氨酸3单加氧酶/色氨酸5单加氧酶激活蛋白 ζ (tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta, YWHAZ)基因表达量,采用CCK-8试剂盒(cell counting kit-8)方法和细胞划痕实验验证其不同表达水平对22RV1细胞增殖和迁移能力的影响。结果发现,YWHAZ基因在格里森评分(Gleason score, GS)低于8时,YWHAZ在癌组织中表达量低于正常组织,而在中后期随着格里森评分升高,YWHAZ在前列腺癌细胞系中相对表达量呈现明显上升趋势。CCK-8实验和细胞划痕实验结果发现,干扰和超表达YWHAZ在22RV1细胞中的表达水平后,严重影响了22RV1细胞的增殖和迁移能力。以上结果表明,在前列腺癌发病中后期,YWHAZ可能扮演了原癌基因的角色。相关结果为后续研究靶向该基因的药物提供理论基础和实验思路。

• 藏猪肺组织新转录本注释及功能解析

  袁浩楠, 杨雅楠, 杨天良, 权金强, 赵生国

  藏猪(Sus scrofa)是高原生境中的代表性非模式动物,对其高原反应机制的研究可为其他动物低氧适应机制的探索提供参考依据。为了完善和优化藏猪基因组注释信息,解析藏猪肺组织在转录水平上对低氧环境的响应特征,本研究对不同海拔藏猪的肺脏组织进行RNA-seq测序,构建cDNA文库,将重新组装的测序数据与藏猪参考基因组进行比对分析。结果显示,本研究延伸了334个基因的5'端和3'端,并对1 313个基因的5'端和2 734个基因的3'端分别实现了延伸;挖掘新转录本809个,其中95个新转录本在不同海拔间的表达差异显著(P<0.05)。GO分析显示差异新转录本在细胞代谢、酶催化活性和细胞组分等过程被显著富集(P<0.05);KEGG富集发现差异新转录本显著富集在程序性细胞坏死和核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)炎症信号等通路(P<0.05)。随机挑选9个显著差异的新转录本进行qPCR验证,结果与RNA-seq一致。本研究为完善藏猪基因组注释信息提供了有益补充和借鉴,为进一步研究藏猪适应不同海拔环境的遗传机制提供参考依据。

• 绵羊MYF5基因多态性及其与生长性状的关联分析

  孟科, 张天闻, 梁鹏, 邵顺成, 邹诗凡, 荣轩, 强浩, 冯登侦

  肌源性因子5 (myogenic factor 5, MYF5)被认为是影响肌肉生长发育的重要基因。本研究旨在探究MYF5基因的遗传变异对绵羊(Ovis aries)生长性状的影响,以期为优质肉羊新品种(系)培育提供有效的分子遗传标记。利用液相捕获测序技术获得MYF5基因在杜泊羊、小尾寒羊和滩羊共91只羊中的变异位点,筛选出具有多态性且品种间差异显著的3个SNP位点(124510044, 124509770和124507708)。针对筛选出的位点利用飞行质谱对3个绵羊品种杂交后代的383只绵羊进行检测,并与初生和3月龄的生长性状进行关联分析。结果显示：124510044位点检测出3种基因型,在所有群体中均处于中度多态(0.25≤PIC<0.50);124509770位点检测出3种基因型,在H1代群体中处于低度多态(PIC<0.25),在其他群体中处于中度多态(0.25≤PIC<0.50);124507708位点只检测出缺失1种基因型。在H2代群体中,124510044位点CT基因型个体的3月龄体高显著高于TT基因型(P<0.05),124509770位点CG基因型个体3月龄体高显著高于GG基因型(P<0.05);在不考虑世代的情况下,GG基因型个体3月龄胸围显著高于CC基因型(P<0.05)。124510044和124509770位点为完全连锁不平衡,产生4种单倍型和5种双倍型;双倍型H4H4个体初生和3月龄的胸围显著高于H1H1 (P<0.05)。本研究结果表明,MYF5基因的遗传变异对绵羊的生长性状有影响,124510044和124509770位点可以作为肉羊生长发育和产肉性能的潜在候选遗传标记,本研究为MYF5基因在肉羊的选种选育提供了重要参考,为肉羊的分子标记辅助育种中提供了理论依据。

• 湖羊CNTF基因组织表达、SNPs扫描及其与生长性状关联分析

  程江博, 张德印, 张煜坤, 宋其志, 李晓龙, 赵源, 徐丹, 张小雪, 李冲, 袁律峰, 李发弟, 王维民

  睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)是影响肌肉发育的重要候选基因,可以编码具有多种生物学功能的细胞因子。本研究旨在探讨绵羊(Ovis aries) CNTF基因的组织表达规律,扫描其SNPs并在大规模群体中与生长性状进行关联分析。本研究以1 399只系谱清晰、表型记录准确的湖羊(Ovis aries)群体为研究对象,利用qPCR技术检测了绵羊睫状神经营养因子基因在湖羊10个组织的表达量,采用混合池测序的方法扫描该基因SNPs,并与生长性状进行关联分析。研究结果发现,生长性状间存在较高的正相关,体重与体长、体高、胸围和管围等体尺指标相关性较高(P<0.01)。绵羊CNTF基因广谱表达,在心、肝、脾、肺、肾等10个组织中均有表达,其中在肝脏和瘤胃中表达量较高。在绵羊CNTF基因第1内含子中检测到了g.2576 C>G多态位点,表现为中度多态。性状关联分析结果显示,该多态位点与湖羊80~180 d阶段的体重、体高、体长、胸围、管围等生长性状呈显著关联(P<0.05)。其中,携带GG基因型个体的80、100、120、140、160 d体重和80、100、120 d体高以及160 d胸围显著高于携带CG基因型个体(P<0.05),携带GG基因型个体的140、160、180 d体高和80、100、140和180 d胸围以及各阶段管围均显著高于携带CG基因型和CC基因型个体(P<0.05)。本研究结果表明CNTF基因g.2576 C>G位点可作为候选分子标记用于湖羊生长性状的育种实践。

• 早期补饲开食料对羔羊瘤胃组织转录组的影响

  汪晓娟, 吕凤, 庞鑫, 刘国华, 赵海碧

  瘤胃是反刍动物重要的消化器官,早期补饲开食料可以满足羔羊(Ovis aries)快速生长的营养需要,并促进瘤胃早期发育。本研究通过研究羔羊补饲开食料对瘤胃组织基因表达的影响,旨在阐明开食料对瘤胃发育的作用机理。选取健康的7日龄湖羊公羔22只,随机分为对照组与补饲组,对照组饲喂代乳粉,补饲组在饲喂代乳粉的基础上补饲开食料。28日龄屠宰,采集瘤胃腹囊组织,进行转录组测序分析。结果显示：对照组与补饲组分别获得61.70和58.95 Gb的有效数据,与参考基因组的比对效率在87.85%~89.45%;与对照组相比,补饲后筛选出868个差异表达基因,其中上调基因464个,下调基因404个,主要富集于酶活性、离子通道、膜运输等GO功能及甾类激素生物合成、花生四烯酸代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路、脂肪细胞脂解作用的调节、环腺苷酸等KEGG信号通路。关联性分析显示,含IQ基元GTP酶激活蛋白2重组蛋白(recombinant IQ motif containing GTPase activating protein 2, IQGAP2),溶质载体家族16成员1重组蛋白(recombinant solute carrier family 16, member 1, SLC16A1),锚蛋白重复结构域45 (ankyrin repeat domain-containing protein 45, ANKRD45),3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2, HMGCS2),磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2 (phosophoenolpyruvate carboxykinase 2, PCK2)均与瘤胃乳头长度、乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸(total volatile fatty acid, TVFA)显著正相关(P<0.05);而神经酰胺合酶3 (ceramide synthase 3, CERS3),角蛋白4重组蛋白(recombinant keratin 4, KRT4),可溶性载质转运蛋白22A17抗体(solute carrier family 22A17, SLC22A1),胰岛素样生长因子结合蛋白6 (recombinant insulin like growth factor binding protein 6, IGFBP6)均与其呈显著负相关(P<0.05)。说明羔羊补饲开食料后可能是通过调控与瘤胃上皮增殖和养分代谢相关基因的表达量而促进了瘤胃发育。本研究为进一步探讨补饲开食料对瘤胃发育的机理提供了理论依据。

• 小黄鱼肝脏中hsp90b1和hspb1对温度胁迫的响应

  储天琪, 刘峰, 陈红林, 詹炜, 王梦洁, 秦高婵, 楼宝, 徐万土

  热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)与鱼类响应温度胁迫密切相关。为研究HSPs家族基因(hsp90b1和hspb1)在重要海水鱼类小黄鱼(Larimichthys polyactis)温度胁迫过程中的响应特点,本研究对hsp90b1、hspb1进行克隆分析,采用实时荧光定量PCR技术对2个基因进行组织表达量测定,通过急性和慢性2种温度处理方式对2个基因进行温度响应分析。结果显示,hsp90b1 (GenBank No. OK340652)的CDS序列长度为2 406 bp,编码801个氨基酸;hspb1 (GenBank No. OK340653)的CDS序列长度为609 bp,编码202个氨基酸。2个基因在小黄鱼的肝脏、脑、鳃、肠、肌肉、皮肤和肾脏等组织中均有表达,其中hsp90b1在皮肤中的表达量最高,而hspb1在肌肉中表达量最高。在自然水温为20 ℃ (对照组)时,对小黄鱼分别进行急性高温(32 ℃)和低温(6 ℃)胁迫处理,发现急性温度处理可诱导hsp90b1显著高表达,而hspb1则表现出显著的高温高表达、低温低表达的特点(P<0.05)。以13 ℃ (自然水温)为对照,对小黄鱼分别进行6、8、16和20 ℃长期温度处理(7 d),发现肝脏中hsp90b1表达水平均显著高于对照组(P<0.05),同时高温组(16和20 ℃)的表达水平要高于低温组(6和8 ℃);与hsp90b1不同,hspb1仍呈现出高温高表达、低温低表达的特点(P<0.05)。上述研究表明,hsp90b1和hspb1在小黄鱼温度胁迫过程中出现明显的差异表达,表明其在温度胁迫响应过程中发挥着重要作用。本研究结果为探究小黄鱼响应温度胁迫的分子机制提供了参考。

• 不同光照周期对尼罗罗非鱼生物钟基因表达的影响

  符徐泽, 邹芝英, 肖炜, 祝璟琳, 李大宇, 喻杰, 陈炳霖, 杨弘

  生物钟基因是控制昼夜节律的关键基因。光照是对生物钟影响最大的环境变量,光照周期的改变会导致生物钟基因表达模式变化,进一步影响生物的生活习性和发育繁殖等多项生理活动。为探究不同光照周期对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)生物钟基因昼夜节律的影响,本研究共设置3种光照周期条件,光(L)暗(D)比分别为8 h光照和16 h黑暗(8L∶16D)、12 h光照和12 h黑暗(12L∶12D)及16 h光照和8 h黑暗(16L∶8D),光照强度1 000 lx,光起始时间设定为计时器时间(zeitgeber time, ZT) 0 h,分析尼罗罗非鱼脑、肝脏和眼3种组织中生物钟关键基因：脑肌肉芳香烃受体核转位蛋白样因子1 (brain and muscle arnt-like 1, bmal1)、昼夜节律活动输出周期故障因子a (circadian locomotor output cycles kaput a, clocka)、隐花色素5 (cryptochrome 5, cry5)和周期蛋白1b (period 1b, per1b)的昼夜表达规律。结果显示,正常光照条件下(12L∶12D),脑、肝脏和眼中bmal1、clocka、cry5和per1b表现出明显的昼夜节律性;正常光照条件下(12L∶12D),正调控基因bmal1和clocka峰值相位肝脏中(ZT 13.98 h, ZT 12.02 h),早于脑中(ZT 17.31 h, ZT 14.37 h),负调控基因cry5和per1b峰值相位肝脏中(ZT 7.28 h, ZT 0.92 h),晚于脑中(ZT 4.66 h, ZT 0.76 h);长光照(16L∶8D)导致脑中clocka峰值相位延迟,肝脏中cry5振幅增大;短光照(8L∶16D)使脑中per1b、肝脏中bmal1和眼中cry5振幅变大。上述结果表明,尼罗罗非鱼具有与其他鱼类相似的生物钟系统,不同组织的生物节律不完全一致;光照周期会影响生物钟基因的表达,且各组织的生物钟基因响应有差异。本研究为深入了解尼罗罗非鱼生物钟系统的调节机制提供参考依据。

• 含砷酸性矿山废水对稻田土壤微生物群落结构的影响

  杨泽延, 张翅鹏, 黄臣臣, 张凯璇, 陈爽

  受酸性矿山废水(acid mine drainage, AMD)污染农田土壤性质变化较大,对微生物生长有潜在危害。为探究含砷AMD对稻田土壤微生物群落结构的影响,本研究通过采集贵州省兴仁市高砷煤矿区砷污染稻田(污染区)和未污染稻田(清洁区)土壤,测定上覆水及土壤的理化性质,利用高通量测序技术分析污染区与清洁区的微生物群落组成和多样性。结果表明,污染区土壤酸化,pH介于3.60~4.40,铁(Fe)和砷(As)的平均含量分别为114.26 g/kg和98.70 mg/kg,而清洁区土壤pH平均为5.93,Fe和As平均含量分别为106.25 g/kg和21.63 mg/kg。两区土壤中微生物主要门类为变形菌门(Proteobacteria),平均相对丰度达29.96%;其中污染区S1和S2土壤微生物群落多样性与清洁区土壤有显著差异(P<0.05);与清洁区土壤相比,污染区土壤受含砷AMD灌溉影响嗜酸性菌亚群Gp1、Gp2和Gp13相对丰度分别增加了3.23%、2.88%和1.38%,且脱硫芽孢弯曲菌属(Desulfosporosinus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)只在污染区土壤中检出。铁还原菌群中地杆菌属(Geobacter)和厌氧黏细菌属(Anaeromyxobacter)丰度相对较高,污染区土壤平均占比分别为1.58%和1.60%,清洁区土壤平均占比分别为1.62%和3.02%。冗余分析与Spearman相关性分析表明,土壤酸化及砷污染是影响土壤微生物群落结构的主要环境压力。研究有助于进一步揭示含砷AMD污染土壤环境条件与微生物群落结构变化间的关系,同时可为污染农田生态恢复提供理论依据。

• 基于酵母表面展示的山羊γ-干扰素重组富硒酵母构建及活性分析

  许国洋, 郑华, 高广亮, 余远迪, 戴茜茜, 牟豪, 杨柳, 杨睿

  γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)是一种Ⅱ型干扰素,可以抵抗病毒在机体的感染复制,在畜禽养殖业中具有潜在应用价值,目前关于山羊(Capra hircus) γ-干扰素(goat interferon-γ, CapIFN-γ)的真核表达少有报道。本研究旨在对酵母(Saccharomyces)表面展示系统进行富硒改造,并构建表面展示CapIFN-γ的重组富硒酵母,同时对其进行活性分析。依据酿酒酵母(S. cerevisiae) EBY100生长曲线及富硒特性,筛选亚硒酸钠的最适浓度,对酿酒酵母进行富硒改造。人工合成编码山羊γ-干扰素的成熟肽基因,构建重组质粒pYD1-CapIFN-γ,电击转化富硒酵母,将鉴定正确的重组菌株接种于含2%半乳糖的YNB-CAA液体培养基中诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光实验(indirect immunofluorescence assay, IFA)分析,同时,利用细胞病变抑制法分析重组山羊γ-干扰素对羊痘病毒(Goatpox virus, GPV)增殖的影响。结果显示,亚硒酸钠最适终浓度为60 μg/mL。SDS-PAGE和Western blot鉴定均显示在约25 kD位置出现目的蛋白条带,IFA鉴定显示重组富硒酵母出现绿色荧光信号,且重组蛋白能够抑制羊痘病毒在羊肾细胞中的增殖。本研究成功对酵母表面展示系统进行了富硒改造,并获得了CapIFN-γ重组富硒酵母,为山羊γ-干扰素抗病毒作用的深入研究及新型酵母饲料添加剂的开发提供参考,也为山羊绿色健康养殖及疫病防控提供技术保障。

• 甘草甜素对铜绿假单胞菌生物被膜形成的抑制作用

  黄盼, 王志鹏, 肖琛闻, 季权安, 鲍国连, 刘燕

  铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有多重耐药特性,生物被膜的形成是其重要的耐药机制之一。甘草甜素(glycyrrhizin, GLY)具有抗菌功效。为了探讨GLY对多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株的抗菌活性及生物膜形成的作用效果,本研究从角膜炎病兔(浙江嵊州'白中王'长毛兔)(Leporidae angora)眼分泌物中分离获得铜绿假单胞菌G1株(GenBank No. MZ683158)和G2株(GenBank No. MZ683159),进一步采用微量稀释法测定GLY对G1株和G2株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC),利用结晶紫法定量生物被膜,利用扫描电子显微镜初步观察GLY对铜绿假单胞菌生物被膜形态的影响,采用qPCR方法检测GLY对铜绿假单胞菌生物被膜合成相关调控基因pelA、algA、rhlI、rhlR和pslA表达的影响。结果显示,GLY对G1株和G2株的MIC分别为40和20 mg/mL;G1株和G2株都能形成生物被膜,G1株的形成能力较强;结晶紫染色显示,20 mg/mL GLY处理使G1株和G2株生物被膜的形成量显著减少(P<0.01)。扫描电子显微镜观察发现,5 mg/mL GLY处理使生物被膜的形成显著减少,10 mg/mL GLY处理使菌体分散且未见明显生物被膜结构。qPCR检测结果显示,5 mg/mL GLY处理后,pelA基因表达量升高,但差异不显著;algA、rhlI、pslA和rhlR的基因表达量均显著降低(P<0.01);10 mg/mL GLY处理后,pelA、algA、rhlI、rhlR和pslA的基因表达量均显著降低(P<0.01)。上述结果提示,GLY对铜绿假单胞菌有抗菌活性,对生物被膜的合成具有负调控作用,呈剂量依赖关系,可能通过下调相关基因表达来抑制生物被膜的形成。本研究为深入探讨GLY对铜绿假单胞菌生物被膜的影响和兔铜绿假单胞菌角膜炎治疗提供参考。

• 甘蔗遗传改良中的基因工程：适用、成就、局限和展望

  许孚, 汪洲涛, 路贵龙, 阙友雄

  甘蔗(Saccharum spp. complex)是禾本科的主要物种和重要经济作物,对世界农业经济发展和保障供应食糖发挥重要作用。一方面,甘蔗具有较好的抗、耐逆性,但其生产和生产力依然被多种生物和非生物逆境所制约。另一方面,商业栽培种在生产上一般不开花,即便开花种子基本也是败育的,加上甘蔗产品蔗糖为碳水化合物,不含蛋白成分,因此,甘蔗属于转基因安全风险等级最低(I级)的作物之一。再则,甘蔗为无性繁殖作物,优异的转基因单株可通过组织培养快速扩大群体。鉴于此,基因工程成为甘蔗弥补传统杂交育种性状缺陷和加快遗传改良进程的重要手段。本文在阐述为什么甘蔗是适合进行转基因改良物种的基础上,重点回顾抗虫性和抗病性改良成就,简要回顾其他性状及甘蔗作为生物反应器的工作,评述了影响甘蔗遗传转化效率与外源目的基因表达水平的因素,探讨基因编辑技术在甘蔗上的应用以及转基因甘蔗安全性评价与商业应用情况,最后展望该技术领域的未来,以期推动和促进基因工程在甘蔗遗传改良中的应用。

• 脱水素在植物非生物胁迫中的作用研究进展

  潘潇潇, 胡慧芳, 陈楠, 张华锋, 陈儒钢

  脱水素(dehydrin, DHN)属于胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein, LEA)Ⅱ家族成员,通常在植物受到逆境胁迫时产生并积累,以提高植物对逆境的耐受性,在植物抵抗逆境过程中发挥重要作用。本文综述了脱水素的蛋白结构特征,以及在低温、干旱、盐胁迫等非生物胁迫下的功能,以期为脱水素的深入研究提供参考依据,同时展望了利用现代生物技术将脱水素用于提高植物对逆境耐受力的应用前景。此综述归纳脱水素的功能,探讨脱水素的作用机理,解析脱水素的分子调控机制,对培育新品种及维护高产稳产和可持续发展具有重要的作用。

• 多重微滴数字PCR同时定量检测三种食源性致病菌DNA拷贝数

  张明明, 肖剑, 林秀敏, 尹玮璐, 梁美丹, 周露, 孙雪奇

  食源微生物是影响食品质量与安全的重要因素,微滴数字PCR (droplet digital PCR, ddPCR)能够对核酸进行绝对定量检测,在食源性致病菌检测中具有越来越重要的地位。为实现食源性致病菌基因组拷贝数的快速绝对定量检测,本研究从已报道的伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)检测引物和探针中,经TaqMan探针法qPCR特异性验证,筛选获得以ttrA/ttrC、FMN-binding glutamate synthase、invasion associated endopeptidase基因为靶标的引物和探针,并将伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测探针连接6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein, FAM)基团、单核细胞增生李斯特氏菌检测探针连接六氯-6-甲基荧光素(hexachloro fluorescein, HEX)基团,分别构建3种目标菌株的单重ddPCR检测体系。在此基础上,通过引物和探针浓度和退火温度的优化构建可在同一反应体系中同时、快速、绝对定量检测伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌基因组拷贝数的多重ddPCR检测体系。多重ddPCR检测体系可扩增获得8 (23)个微滴簇区域,对伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌定量检测的线性范围分别为235~0.23、284~0.18、380~0.42 copies/µL;在定量检测范围内的线性相关系数R2均大于0.999,且重复性较好,3种致病菌的多重ddPCR检测体系与单种菌的单重ddPCR定量线性范围几乎一致。本研究构建的多重ddPCR检测体系特异性强、稳定性好、定量范围广,可为食源性致病菌的无增菌绝对定量检测提供技术支持。