农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2020年第6期

• 毛竹与阔叶林凋落物添加对土壤细菌群落的影响

  王越, 罗雪媛, 李永春, 陈志豪, 姚泽秀, 方韬, 张宝刚

  凋落物分解是植物入侵影响生态系统的关键途径之一,但目前关于森林凋落物分解过程中土壤细菌群落结构的变化及其影响因子的研究较少。为探究毛竹(Phyllostachys edulis)、常绿阔叶及竹阔混交林凋落物对土壤细菌群落的影响,本研究采用末端限制性片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)以及实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)技术,结合室内培养分析凋落物添加前后土壤养分及细菌群落变化。结果表明,3种凋落物添加均显著提高土壤pH、有机质、速效钾和碱解氮含量(P<0.05);3种凋落物均能促进细菌增殖,细菌丰度提升幅度与毛竹凋落物添加量呈正比,与阔叶凋落物添加量则呈反比,仅2%混交林凋落物能显著增加细菌数量(P<0.05);添加凋落物后土壤细菌群落组分发生改变。土壤pH、有机质、速效钾显著影响细菌群落结构变异;有机质、全氮、全钾、速效钾与细菌丰度呈正相关(P<0.05)。本研究结果表明,凋落物添加能够提高土壤养分、促进细菌增殖,但促进细菌增殖的幅度因凋落物类型而异。本研究为理解毛竹入侵阔叶林过程中不同类型凋落物分解对土壤细菌群落的影响机制提供了参考依据。

• 转TaTLP1基因小麦的获得及抗叶锈性分析

  梁芳, 崔钟池, 王海燕, 刘大群

  类甜蛋白(thaumatin-like protein, TLP)是一类具有抗真菌功能的病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, PRPs),在植物病理学研究中受到越来越广泛的关注。本研究将前期获得的小麦(Triticum aestivum) TaTLP1基因定向插入到玉米(Zea mays)泛素(ubiquitin, Ubi)启动子驱动的表达载体pLGY-02中,利用农杆菌(Agrobacterium)介导的遗传转化将pLGY-TaTLP1重组体转化至小麦感叶锈病农家品种'JW'中,侵染幼胚140个,获得31个再生株系,再生率为22.1%。对转TaTLP1基因小麦的T1~T4代植株进行PCR验证,初步筛选出了稳定遗传表达的转基因阳性植株;qRT-PCR分析明确了TaTLP1基因在转基因阳性小麦中超量表达;对连续4代小麦接种叶锈菌(Puccinia triticina)的抗性鉴定则表明,TaTLP1基因的过表达提高了转基因植株对小麦叶锈病的抗性;纯合后代生理生化含量的测定进一步证实了转TaTLP1基因小麦中的脯氨酸、β-1,3-葡聚糖酶、过氧化氢以及过氧化物酶同样参与了小麦防御叶锈病的反应。本研究结果表明,TaTLP1基因在防御小麦叶锈病方面发挥重要作用,为深入研究TaTLP1基因的功能和小麦—叶锈菌相互作用的分子机理提供了理论依据。

• 基于VIGS基因沉默体系的换锦花LsMYBs基因功能研究

  周洋丽, 侯朔, 郑正权, 高燕会, 童再康

  换锦花(Lycoris sprengeri)是石蒜属(Lycoris)多年生球根类非模式植物,花色多为红蓝复色花,观赏价值极高,利用基因工程技术探讨换锦花花色形成机制对换锦花新品种选育具有重要的指导意义。本研究采用无缝克隆技术构建换锦花LsMYBs病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)载体,利用真空渗透法侵染换锦花花苞,并对侵染后换锦花花瓣花色苷含量和花色形成相关基因的表达进行检测,建立换锦花VIGS技术体系并初步分析LsMYBs的基因功能。研究结果表明LsMYBs沉默后换锦花花瓣LsMYBs基因的表达明显下降,而花瓣尖端的蓝色加深,花色苷含量明显增加;VIGS载体的插入片段为400 bp时诱导基因沉默后LsMYBs的表达量相对稳定,是未沉默的LsMYBs基因表达量的1/2,而插入cDNA全长片段基因沉默后LsMYBs表达不稳定。LsMYB4基因沉默后花色苷形成过程中结构基因(早期形成基因(early biosynthesis gene, EBG)和晚期形成基因(late biosynthesis gene, LBG))查尔酮合成酶基因(chalcone synthase, LsCHS)、查尔酮异构酶基因(chalcone isomerase, LsCHI)、黄烷酮3-羟化酶基因(flavanone 3-hydroxylase, LsF3H)、类黄酮-3'-羟化酶基因(flavonoid 3'-hydroxylase, LsF3'H)、二氢黄酮醇-4-还原酶基因(dihydroflavonol-4-reductase, LsDFR)、花青素合酶基因(anthocyanidin synthaes, LsANS)、类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因(flavonoid 3-o-glycosyltransferase, LsUFGT)的表达量明显上升,但变化程度不同;而LsMYB5沉默后仅LBGs基因(LsANS, LsDFR3和LsUFGT)表达量明显上升,其他基因表达变化不明显,说明LsMYB4和LsMYB5在换锦花花色形成的过程中可能起着负调控的作用,但调控的靶基因对象不完全相同。本研究结果对进一步解析LsMYBs转录因子对换锦花花色苷形成的调控机制提供了重要的信息。

• 天祝白牦牛ACACA基因组织表达及脂肪组织甲基化模式分析

  石学红, 石斌刚, 左志, 赵世杰, 何兆华, 张雪萍, 赵志东, 王继卿, 周智德, 胡江

  乙酰辅酶A羧化酶α (acetyl-CoA carboxylases alpha, ACACA)是脂肪酸从头合成的关键限速酶,在脂肪酸生物合成中起重要调控作用。本研究以0.5和4.5岁天祝白牦牛(Bos grunniens)为研究对象,采用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和重亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing PCR, BSP)方法,检测牦牛ACACA基因在心脏、肝脏、皮下脂肪等13个组织中的表达量,以及PⅠ启动子区CpG岛在皮下脂肪组织中的甲基化水平,研究该基因组织表达规律及皮下脂肪组织中的表观遗传机制。结果表明,ACACA基因在牦牛上的表达量存在组织和年龄差异,0.5岁牦牛肝脏、脑、背最长肌和肾脏中高度表达且肝脏中表达量显著高于其他组织(P<0.05),4.5岁牦牛皮下脂肪和肝脏中表达量极显著高于其他组织(P<0.01);0.5岁牦牛肾脏中表达量极显著高于4.5岁牦牛(P<0.01),而在皮下脂肪、肝脏和睾丸中表达量显著或极显著低于4.5岁牦牛(P<0.05或P<0.01)。皮下脂肪组织中,ACACA基因PⅠ启动子第1 CpG岛区(g.-795 bp~-193 bp)高度去甲基化且存在年龄差异,且BSP-1引物扩增区平均甲基化水平0.5岁牦牛极显著高于4.5岁牦牛(P<0.01);0.5岁牦牛BSP-1引物扩增区CpG11、CpG31、CpG35、CpG37位点及BSP-2引物扩增区CpG5'、CpG13'、CpG15'、CpG27'、CpG28'位点甲基化水平显著或极显著高于4.5岁牦牛(P<0.05或P<0.01);PⅠ启动子第1 CpG岛区甲基化水平与该基因在皮下脂肪组织中的表达量呈负相关。本研究揭示了不同年龄段牦牛ACACA基因组织表达和PⅠ启动子甲基化差异,为牦牛分子遗传研究提供理论基础。

• 牦牛EPF基因克隆及其在配种后血液中的含量分析

  马进彪, 樊江峰, 余四九, 崔燕, 韩小红, 马悦, 何翃闳, 李秦, 赵生贤, 张兴云, 曹艳桃, 包梅

  早孕因子(early pregnancy factor, EPF)是最早从妊娠期哺乳动物血清中分离中的一种生物活性蛋白,可通过调控妊娠诱导的免疫抑制反应阻止母体对胎儿的排斥作用。为了分析牦牛(Bos grunniens)EPF基因生物学特性及其在妊娠后血液中的变化规律,了解EPF与妊娠的相关性, 本研究从牦牛卵巢组织中提取RNA并反转录为cDNA模板,RT-PCR扩增EPF基因并测序;利用生物信息学相关软件对牦牛EPF蛋白的理化性质以及结构预测分析。采集69头牦牛人工授精(artificial insemination, AI) 20~40 d后牦牛血液样品,运用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay , ELISA)测定EPF水平。本研究克隆获得了牦牛EPF基因完整的编码序列(coding sequence, CDS)区序列(GenBank No. MK992914),其开放阅读框长度为207 bp,编码69个氨基酸残基的可溶性非跨膜蛋白。ELISA结果显示,牦牛配种后20~40 d血液中EPF含量与妊娠状态密切相关。妊娠组从20 d开始,血液中EPF含量逐渐升高,28 d达到最高值,之后略有下降;未孕组配种后20~40 d期间,血液中EPF含量变化不明显,一直处于一个较低的水平,且极显著低于妊娠组(P<0.01)。结果表明,血液EPF可作为妊娠检测候选因子,用于牦牛的早期妊娠诊断,可以将牦牛的妊娠诊断时间提前到配种后20 d。本研究为牦牛早期妊娠诊断相关产品的研发以及技术体系的建立提供了基础资料。

• 大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染对BEECs细胞凋亡相关因子表达的影响

  朱辰飞, 潘阳阳, 何翃闳, 赵凌, 王伟, 王彦雄, 崔燕, 余四九

  奶牛(Bos taurus)子宫内膜炎会对奶牛繁育能力造成显著影响,制约奶牛业发展。产后细菌感染是引起子宫内膜炎发生的首要病因,临床上分离出的主要致病菌为大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。本研究通过两步酶消化法体外培养奶牛子宫内膜上皮细胞(bovine endometrial epithelial cells, BEECs),以相应感染复数(multiple of infection, MOI)的不同浓度大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染BEECs,利用TUNEL试剂盒检测感染引发的细胞凋亡;在大肠杆菌或金黄色葡萄球菌感染细胞12 h后,利用qRT-PCR检测BEECs中细胞凋亡相关基因Bax、Caspase-3和Bcl-2的mRNA水平。免疫细胞化学鉴定显示,子宫内膜上皮细胞的标志蛋白(波蛋白和角蛋白18)染色阳性;大肠杆菌或金黄色葡萄球菌感染组中,细菌浓度为107 CFU/mL时细胞凋亡率最高;大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染使Bax和Caspase-3表达增加(分别在106和107 CFU/mL时表达量最高),同时,Bcl-2表达降低(在107 CFU/mL时表达量最低)。本研究结果表明,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌可诱发子宫内膜上皮细胞凋亡,可为奶牛子宫内膜炎相关机制研究提供参考依据。

• 藏绵羊TPI1基因的克隆及其在雄性生殖器官中的表达

  张宏豫, 李讨讨, 马友记, 王霞, 尹德恩, 赵兴绪, 李东红

  睾丸支持细胞可通过糖酵解途径为生精细胞的发育提供能量底物。磷酸丙糖异构酶1(triosephosphate isomerase 1, TPI1)是糖酵解代谢过程中的关键酶。为了探究TPI1基因在雄性藏绵羊(Ovis aries)生殖器官发育中的生物学功能,本研究首先克隆TPI1基因cDNA序列,并用实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR, qRT-PCR)、Western blot和免疫组织化学染色法检测TPI1基因在藏绵羊睾丸和附睾不同发育阶段的表达和分布模式。结果发现,藏绵羊TPI1基因CDS区长度为861 bp (GenBank No. MN847717),可编码286个氨基酸,与其他哺乳动物具有较高的同源性;TPI1基因及其蛋白在不同发育阶段睾丸和附睾中均有表达,但主要在1岁龄和3岁龄表达;TPI1蛋白主要分布于所有发育阶段的睾丸支持细胞和性成熟后(1岁龄和3岁龄)附睾中的精子尾部,在睾丸内的间质细胞、生精细胞以及附睾内的假复层柱状纤毛上皮也有较弱的阳性信号。上述结果表明,TPI1基因可能参与调节睾丸支持细胞和精子鞭毛的糖代谢途径以及附睾假复层柱状纤毛上皮的分泌功能,从而促进精子的形成和成熟。本研究可为进一步探究TPI1基因在绵羊及其他哺乳动物精子发生过程中的调控机制提供基础资料。

• 鸡Rab5a与恒定链的结合特性及其在真核细胞的共定位研究

  谭红黎, 桂亚萍, 李梅珍, 黄鑫, 秦文娟, 查丽莎, 陈芳芳

  Rab5a是胞内转运蛋白,而恒定链(invariant chain, Ii)则是协助主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC) Ⅱ分子装配成熟以及递呈抗原肽的免疫分子。长期以来,Ii的胞内途径机制并不清楚。本研究旨在探明鸡(Gallus gallus) Rab5a的结构特征及参与Ii在胞内转运中的作用。首先,用自行设计的引物克隆鸡Rab5a基因(GenBank No. XM_015281490),构建含鸡cIi、cIi突变体(IiD81-87aa和IiD91-99aa)的重组表达载体;其次,应用软件比对鸡和小鼠(Mus musculus) Rab5a蛋白质结构。最后,分别将Rab5a和cIi转染小鼠树突状细胞系DC2.4细胞,应用免疫荧光技术和激光共聚焦显微镜观察鸡Rab5a与cIi和cIiD81-87aa和cIiD91-99aa在真核细胞内的定位与共定位。应用GST pull-down和Western blot检测鸡Rab5a和Ii蛋白分子间的相互作用。结果表明,克隆获得的鸡Rab5a基因与预期大小一致,为648 bp。分子结构分析表明,鸡与小鼠的Rab5a高度相似,同源性高达95.4%。同源建模分析结果显示,鸡与小鼠Rab5a均含有5个α螺旋和6个β折叠区,表明哺乳类和禽类Rab5a是同源的。激光共聚焦显微镜观察表明,鸡Rab5a和Ii均定位于细胞的早期内吞体,而突变体IiD81-87aa和IiD91-99aa却不能定位于早期内吞体。GST pull-down和Western blot结果显示鸡Rab5a能够结合Ii分子。综上所述,鸡Rab5a与Ii在早期内吞体的共定位和互相结合提示,Rab5a参与Ii在细胞内的转运。本结果为进一步研究其机理提供了新依据。

• 基于Cytb基因全序列4个鸡品种遗传多态性和起源

  唐修君, 贾晓旭, 樊艳凤, 葛庆联, 唐梦君, 陈大伟, 张小燕, 陆俊贤, 高玉时

  动物线粒体细胞色素b (cytochrome b, Cytb)基因是重要的功能蛋白编码基因,其进化速率中等,一个较小的片断就包含了丰富的遗传进化信息,被认为是研究动物从种内到种间乃至科间的遗传多态性和系统进化的理想分子标记。为探明我国江西省部分地方鸡(Gallus domesticus)品种线粒体Cytb基因遗传多态性特点,本研究以江西省4个地方鸡品种为研究对象,利用DNA测序技术测定Cytb基因全长序列,进行遗传多态性分析。结果表明,4个品种Cytb序列全长均为1 143 bp,共有12个突变位点和9种单倍型,其中单倍型Hap4为4个品种共有。4个品种平均核苷酸差异(average number of nucleotide differences, K)为1.971,平均单倍型多样度(haplotype diversity, Hd)为0.724,平均核苷酸多样度(nucleotide diversity, Pi)为0.001 72;安义瓦灰鸡K和Pi均最大,分别为3.105和0.002 72;白耳黄鸡Hd最大,为0.752;丝羽乌骨鸡的K值、Pi值和Hd值均最低。4个鸡品种在形成过程中系统发育关系和起源分析显示,丝羽乌骨鸡可能起源于原鸡滇南亚种(Gallus gallus spadiceus);东乡绿壳蛋鸡、安义瓦灰鸡和白耳黄鸡可能起源于原鸡滇南亚种(Gallus gallus spadiceus)和原鸡印度亚种(Gallus gallus murghi)。本研究结果为鸡品种遗传资源保护和开发利用提供了理论依据。

• 尼罗罗非鱼TRIF基因克隆及功能初步分析

  刘洁, 高风英, 陈刚, 卢迈新, 曹建萌, 刘志刚, 王淼, 韩雪晴

  β干扰素诱导型含TIR结构域的接头分子(TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β, TRIF)介导Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)信号传导途径中的下游信号传导,在宿主固有免疫应答中具有重要作用。为探究TRIF是否参与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)抗病免疫反应,本研究通过反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)和分段扩增获得TRIF基因的cDNA (GenBank No. MT199561),并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR, qRT-PCR)技术检测该基因在健康个体及无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染、脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)和聚肌胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid, Poly I:C)刺激后的组织表达;进一步构建重组真核表达载体,分析TRIF在人 (Homo sapiens)胚肾293T细胞的定位及对核因子κ B (nuclear factor-κ B, NF-κB)的激活作用。结果显示,尼罗罗非鱼TRIF cDNA全长3 135 bp,其ORF为1 653 bp,编码550个氨基酸。其蛋白质分子包含保守的Toll/IL-1受体(Toll/interleukin-1 receptor, TIR)结构域。系统进化树中,尼罗罗非鱼TRIF与其他鱼类成簇后再与斑马鱼(Danio rerio)和哺乳动物聚成一支。组织表达分析表明,TRIF在尼罗罗非鱼11个组织/器官中均有表达,在肌肉和血液中表达量最高。人工感染无乳链球菌可引起TRIF基因在脾脏和肾脏中的上调表达,均在感染后1 d达到最大值;LPS刺激后,TRIF在肝脏和脾脏中的表达呈上调趋势,在肠和肾脏中呈下调趋势;Poly I:C刺激后,TRIF在肠和肝脏中上调表达,在肾脏中下调表达。亚细胞定位和双荧光素酶报告分析显示,TRIF在293T细胞中定位于细胞质,可增强NF-κB活性。上述结果表明,TRIF基因在尼罗罗非鱼的免疫应答中可能具有重要作用,本研究可为进一步探讨硬骨鱼类TRIF基因在免疫进化中的功能提供参考依据。

• 碱胁迫对瓦氏雅罗鱼AKP基因表达及生理应答的影响

  米博瀚, 赵雪飞, 高珊, 常玉梅, 孙博, 罗亮, 张立民, 梁利群

  碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)可催化多种与磷有关的水解反应,是生物体免疫功能和健康状况的参考指标。瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)是一类对环境(尤其是高碳酸盐水质)具有超强耐受力的鱼类。为明确高碱环境下的各项生理反应和健康状况,本研究对瓦氏雅罗鱼的2种地理种群—达里诺尔湖瓦氏雅罗鱼(简称碱水雅罗鱼)和松花江瓦氏雅罗鱼(简称淡水雅罗鱼)进行30和50 mmol/L NaHCO3的碱胁迫实验,通过酶标仪对血清中的AKP活性进行测定。在30 mmol/L碳酸盐碱度环境下,淡水雅罗鱼血清中AKP活性显著高于碱水雅罗鱼(P<0.05)。同时,参考近缘物种鲤(Cyprinus carpio)的AKP基因序列,克隆瓦氏雅罗鱼AKP基因,并对实验鱼的鳃、肝、肾、肌肉和脑5种组织中的AKP基因进行荧光定量PCR测定分析。结果表明,瓦氏雅罗鱼AKP基因ORF序列全长为876 bp (GenBank No. MN473375),编码291个氨基酸。AKP基因在两种雅罗鱼5种组织间的表达变化趋势不同,碱水雅罗鱼AKP基因在肝中随碱度升高上调表达,淡水雅罗鱼AKP基因在肾中随碱度升高上调表达,且在多个组织中不同碱度下的基因表达存在显著差异(P<0.05)。综上所述,AKP基因可能参与瓦氏雅罗鱼的耐碱应答。本研究可为深入探讨AKP参与瓦氏雅罗鱼耐碱机制提供基础资料。

• 基于专利数据的植物基因编辑技术发展动态与竞争态势分析

  邹婉侬, 宋敏

  基因编辑是对生物体基因组特定的目标基因进行修饰的一种新型基因工程技术,目前已成为作物育种、生物农业和医药等新兴领域研究的热点。本文通过对全球植物基因编辑技术领域相关专利数据挖掘与分析,在梳理基因编辑技术的发展路径的基础上,重点从主要专利布局区域、权利人角度,以及主要的研发和产业化领域,分析发展动态与竞争态势。分析发现,我国植物基因编辑技术专利缺乏全球专利部署,专利整体质量和经济价值相对偏低,最终成果仍停留在模式作物创制,缺乏以知识产权协作为纽带的产业化机制。最后提出了加强编辑系统等原始创新、强化知识产权全球和全产业链布局、促进知识产权协作弥补短板等对策建议。

• 长链非编码RNA在畜禽肠道疾病中的研究进展

  高小莉, 黄晓宇, 杨巧丽, 张生伟, 滚双宝

  长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类重要的功能性非编码RNA,既能调节细胞的增殖、分化和代谢等生理过程,也参与调控机体的各种病理过程。在集约化养殖业的快速发展中,畜禽肠道疾病的发病率和死亡率越来越高,严重影响了畜禽的健康和养殖效益。近年来,通过转录组测序技术已经鉴定出许多与肠道炎症及疾病相关的lncRNA,而且人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)模式生物的研究表明,多个lncRNA在肠道疾病中异常表达,它们不仅参与调控紧密连接蛋白的表达和分布,而且参与调节肠道炎症分子的产生及信号通路的活化。本文概述了lncRNA对肠道屏障及免疫稳态的调控作用,并总结了其在畜禽肠道疾病中的最新研究进展,为畜禽抵抗肠道疾病的后续研究及抗性品种的培育提供参考。

• 转基因大豆MON89788纯品粉末标准物质的研制及定值

  李俊, 李夏莹, 李亮, 宋贵文, 沈平, 张丽, 翟杉杉, 柳方方, 吴刚, 张秀杰, 武玉花

  转基因检测标准物质是获得准确、可靠、可比检测结果的物质保证,检测实验室通过使用标准物质保证转基因检测结果的量值溯源。以籽粒为原材料研制纯品粉末标准物质,工艺相对简单,量值可靠,是转基因检测标准物质的一种重要类型,广泛用于转基因产品的定量检测。本研究以转基因大豆(Glycine max) MON89788纯合种子为原材料,通过原材料鉴定、研磨、粒度测定、含水量测定、均匀性初检等步骤,制备出大豆MON89788纯品基体标准物质,规格为每瓶1 g。本批标准物质粉末中小于200 μm的颗粒占80%以上,粉末含水量为(4.53±0.03)%,低于规定的10%。标准物质均匀性良好,最小取样量为100 mg;可在常温下运输1个月,长期稳定性达到6个月。本批标准物质的特性量值转基因DNA与总DNA的拷贝数比值(copy/copy)由9家实验室采用数字PCR联合测定,量值为1.00,扩展不确定度为0.07。本批标准物质可用于转基因大豆MON89788的定性和定量检测,以及MON89788特异性检测方法的评价和实验室质量控制。

• 红豆杉TcERF基因qRT-PCR体系构建与优化

  蒋路园, 王旭, 张恺恺, 陈段芬, 邱德有, 杨艳芳

  红豆杉(Taxus sp.)能够产生天然抗癌药物紫杉醇(taxol),但含量极低,开发与利用之间存在严重矛盾。乙烯响应因子(APETALA2/ethylene-responsive factor, AP2/ERF)对红豆杉中紫杉醇的生物合成起到重要调控作用。研究组前期获得了1个红豆杉ERF转录因子基因(命名为TcERF),为了更好地研究该基因的功能,本研究以曼地亚红豆杉(Taxus×media)愈伤组织为实验材料,采用正交实验L9(34)方法,根据TcERF基因序列设计、组合出3对引物,从qRT-PCR反应体系、cDNA模板用量和引物用量等方面进行优化,分别筛选出该基因在5 µL小反应体系及10、20 µL常用体系下的最佳组合。结果表明,在本研究优化后的5 µL体系下,TcERF和看家基因：3,5-表异构酶-4-还原酶(3,5-epimerase-4-reductase, TBC41)基因的扩增效率分别为90%和94%;在优化后的10 µL下,TcERF和TBC41的扩增效率分别为94%和95%;在优化后的20 µL下,TcERF和TBC41的扩增效率分别为102%和93%,以上各扩增体系回归系数R2均大于0.980。以茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)处理24 h的红豆杉愈伤组织为材料,利用优化前和优化后的10 µL体系检测并比较TcERF基因的表达,发现两个体系下该基因表达水平存在显著性差异,充分表明建立并优化qRT-PCR实验体系的必要性和重要性。本研究建立的3个qRT-PCR反应体系均可以保证红豆杉TcERF基因和看家基因具有接近100%的扩增效率,为后续该基因转录水平的表达检测以及功能研究提供了实验条件和技术支撑。

• 巴马小型猪组织qRT-PCR内参基因的筛选

  陈楚杰, 裴杨莉, 刘璐璐, 杨亚岚, 张垒霞, 李华, 李奎

  qRT-PCR是检测细胞、组织基因表达的重要方法之一。而选择合适的内参基因是准确计算目标基因表达水平并进行基因功能研究的关键。本研究使用qRT-PCR技术检测了9个候选基因：拓扑异构酶-2β基因(topoisomerase (DNA)Ⅱβ, Top2b)、β-肌动蛋白基因(β-actin, Actb)、核糖体蛋白S18基因(ribosomal protein S18, Rps18)、肽基脯氨酰异构酶A基因(peptidylprolyl isomerase A, Ppia)、18S核糖体RNA基因(18S ribosomal RNA, 18S)、TATA盒结合蛋白基因(TATA-box binding protein, Tbp)、羟甲基胆素合成酶基因(hydroxymethylbilane synthase, Hmbs)、核糖体蛋白L4基因(ribosomal protein L4, Rpl4)和β-2-微球蛋白基因(β-2-microglobulin, B2m),在15日龄巴马小型猪(Sus scrofa)的心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮下脂肪7个组织上的表达情况,并通过geNorm、NormFinder和BestKeeper程序对结果进行分析。基因表达稳定性结果表明,Rps18、Rpl4、Ppia和Tbp在所有组织中稳定性最高。而单个组织内只需使用两个内参基因即可标准化目标基因的表达,且不同组织的最优内参基因组合不同。本结果为选择巴马小型猪内参基因提供参考,进而为巴马小型猪的肉质、产仔数、发育、繁殖和疾病等相关基因的功能研究提供理论基础。

• 橡胶树褐根病病菌LAMP快速检测方法的建立及应用

  董文敏, 贺春萍, 吴伟怀, 梁艳琼, 谢立, 李锐, 黄兴, 郑金龙, 习金根, 陆英, 易克贤

  有害层孔菌(Phellinus noxius)引起的橡胶树(Hevea brasiliensis)褐根病是严重危害天然橡胶的一种根部病害。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术由于特异性强、灵敏度高、反应迅速、成本低等优势,已在植保等诸多领域得到广泛应用。为了建立一种能够快速、高效、准确地检测橡胶树褐根病菌的技术,本研究以SYBR GreenⅠ为指示剂,建立了橡胶树褐根病菌有害层孔菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。根据橡胶树褐根病菌特异的核糖体转录间隔区序列设计了4条引物(2条内引物FIP/BIP, 2条外引物F3/B3)进行LAMP扩增。对LAMP反应条件和体系进行优化,并进行特异性和灵敏度验证,最后进行田间疑似褐根病样本验证。研究确定了最佳反应体系(25 μL中模板100 ng/μL, 外引物F3/B3各0.2 μmol/L, 内引物FIP/BIP各1.2 μmol/L, dNTPs 1.4 mmol/L, Mg2+ 6 mmol/L, 甜菜碱0.8 mol/L, Bst DNA polymerase 8 U/μL)和反应条件(最佳反应温度63 ℃, 反应时间1 h)。特异性验证结果显示,橡胶树褐根病病菌LAMP产物均呈阳性(绿色),而其他病原菌组织LAMP产物均为阴性(橙色)。灵敏度检测结果显示,该体系的DNA最低检测限为1 pg/μL,比常规PCR灵敏度高1 000倍。20株田间疑似褐根样本应用LAMP体系检测,其病原检出率为85%,而常规PCR检出率为70%或75%。本研究建立的LAMP检测体系能有效用于橡胶褐根病疑似样本的快速检测,对及时科学的防控该病害具有重要意义。

• 鉴别猪流行性腹泻病毒变异与经典毒株的单克隆抗体的制备与鉴定

  王亚文, 赵雪, 李潭清, 米建华, 苗云艳, 孙立丹, 张义明, 宋勤叶

  猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的猪流行性腹泻是危害养猪(Sus scrofa)生产的具有高度接触传染性的重要肠道传染病,血清学检测技术是临床调查PEDV感染状态及该病毒相关研究的重要手段,然而目前尚无鉴别PEDV变异毒株与经典毒株的血清学检测技术。单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)是血清学检测或诊断技术研究的重要实验材料,为了制备鉴别PEDV变异毒株与经典毒株的单克隆抗体,应用DNAMAN和DNAStar7.1软件比较分析了PEDV变异毒株与经典毒株的纤突(spike, S)蛋白核苷酸序列与氨基酸序列,筛选并合成了变异毒株与经典毒株S蛋白氨基酸序列之间的差异序列55IGENQGVNSTWYCAGRHPTAS75。将该多肽偶联钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin, KLH)后免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),利用细胞融合技术,经过3次克隆筛选和间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测,获得了1株分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞(命名为3#),其分泌的抗体(命名为McAb 3#)类型为IgG2bκ。通过ELISA和Western blot证明,该单克隆抗体可与PEDV S蛋白特异性结合,与PEDV N蛋白不发生反应。间接免疫荧光实验(indirect immunofluorescence assay, IFA)结果显示,Vero-81细胞内的PEDV变异毒株能够与McAb 3#特异性结合。获得的杂交瘤细胞株诱生的小鼠腹水ELISA抗体效价达1∶106。进一步以McAb 3#为检测抗体,通过IFA检测PEDV变异毒株HBQY2016与经典弱毒株CV777分别感染的Vero-81细胞,结果只在PEDV变异毒株感染的Vero-81细胞浆内出现绿色荧光信号,表明McAb 3#能够鉴别PEDV变异毒株和经典毒株。上述实验结果表明,制备的单克隆抗体能够与PEDV变异毒株的S蛋白特异性结合,并可以鉴别PEDV变异毒株与经典毒株。该单克隆抗体的制备为PEDV的感染免疫以及PEDV变异毒株与经典毒株抗原或抗体鉴别检测方法的研究提供了重要材料基础。

• 一步法qRT-PCR检测蓝舌病病毒25、26和27血清型的建立

  李卓然, 宋子昂, 李占鸿, 杨振兴, 杨恒, 廖德芳

  蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,自2008年以来世界范围相继发现了BTV-25、-26和-27型3种新血清型BTV,我国也面临新血清型BTV侵入的威胁。本研究根据BTV-25、-26和-27型毒株的基因组节段2 (genomic segment 2, Seg-2)序列,合成长度约500 bp的待检靶基因DNA序列,体外转录为单链RNA (single strand RNA, ssRNA)作为参考核酸,设计血清型特异性扩增引物与TaqMan探针,建立BTV-25、-26和-27血清型特异性一步法qRT-PCR。结果表明：成功获取了BTV-25、-26和-27型参考核酸,建立的BTV-25、-26和-27型一步法qRT-PCR检测方法灵敏度高,对BTV-25、-26和-27型ssRNA检测灵敏度分别为4.43×101、5.61×101和4.88×101拷贝/μL;重复性好,组内和组间变异系数在0.48%至1.79%之间;特异性强,与BTV其他血清型毒株、流行性出血病病毒、阿卡斑病毒和非洲马瘟灭活疫苗毒株之间无交叉反应。采集自南方地区的120份BTV核酸阳性血液样本中,未检测到BTV-25、-26和-27型病毒核酸。本研究为我国开展BTV-25、-26和-27型的监测提供了有效的技术手段。