农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2020年第3期

• SLAF-seq BSA定位水稻黄叶转绿基因grc2的效果研究

  谭炎宁, 余东, 盛夏冰, 康伟伟, 李哲理, 段美娟, 袁定阳

  将传统分群分析法(bulk segregant analysis, BSA)与全基因组特异性位点扩增片段测序手段(specific-locus amplified fragment sequencing, SLAF-seq)深度整合的SLAF-seq BSA技术为快速定位质量性状基因提供了可能。然而,对这一技术的定位准确性程度却少有报道。本研究以水稻(Oryza sativa)黄化转绿基因grc2 (green-revertible chlorina, grc2)为对象,分析了SLAF-seq BSA定位结果与传统图位定位结果的差异。首先,通过简化基因组测序获得了在'grc2'突变体和正常叶色水稻'Y58S'之间表现出单核苷酸多态性的5 302个SLAF标记;然后,利用Y58S/grc2的F2群体中的100个野生型单株和100个突变型单株构建了两个极端混池,再通过自动化计算各SLAF标记在极端混池中的父母本基因型频率,筛选到了符合在0.01水平满足父本('grc2')、母本('Y58S')基因型在野生型混池中为33∶66且在突变型混池中为99∶1的关联标记共13个,这些标记集中分布在Chr06前臂的0.98~1.21 Mb与1.57~1.99 Mb两个相邻区域。经连锁分析发现,第1区域的关联标记AM1、AM6与grc2基因的遗传距离仅为0.625和0 cM;将关联标记比对至日本晴参考基因组后,发现第1关联区域恰好覆盖了grc2基因的传统定位区间,表明SLAF-seq BSA的定位结果具有参考价值。本研究结果为支撑SLAF-seq BSA能快速关联质量性状基因提供了证据。

• 玉米ZmPP2C3基因的表达及互作蛋白分析

  王国瑞, 袁珍, 张鹏钰, 仇晓, 刘志学, 王同朝, 卫丽

  蛋白磷酸酶2C基因(protein phosphates 2C, PP2C)对植物生长发育和抵御逆境胁迫等方面具有重要的调控作用。本研究从前期玉米(Zea mays)干旱-复水转录组分析结果中筛选出一个编码PP2C蛋白的基因ZmPP2C3 (GenBank No. NM_001155565.2),序列分析显示ZmPP2C3基因的开放阅读框为1 227 bp,编码408个氨基酸,编码的蛋白分子量为43.28 kD,等电点为5.92;系统进化树分析显示该基因编码的蛋白序列与玉米中的PP2C蛋白AIB05995.1、AIG52088.1相似性最高,均为99.75%;亚细胞定位显示ZmPP2C3基因编码的蛋白位于细胞核中;qRT-PCR分析表明ZmPP2C3基因在玉米幼苗的根中表达量最高;在干旱、盐、高温及脱落酸(abscisic acid, ABA)处理下该基因均呈现出正向调控;酵母双杂结果显示ZmPP2C3蛋白与GRMZM2G180625、GRMZM2G038126、GRMZM2G155242、GRMZM2G110408、GRMZM2G069651存在相互作用。本研究为进一步分析ZmPP2C3的生物学功能提供了重要的理论依据。

• 异源表达AtCKX2基因对番茄果实发育的影响

  刘雪霞, 李虎, 董映华, 吴寒, 甘立军

  番茄(Solanum lycopersicum)是世界上广泛种植的蔬菜之一,是研究呼吸跃变型果实的模式植物。各种植物激素参与调控番茄果实的生长发育过程。细胞分裂素能够促进果实的细胞分裂,使果实增大、增加果实重量、延缓果实衰老、提高果实产量等。为了研究内源细胞分裂素对番茄果实的影响,本实验构建了番茄果实特异性启动子Tfm7驱动拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞分裂素氧化酶2基因(cytokinin oxidase, AtCKX2)的表达载体,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化的方法获得转基因植株。利用启动子Tfm7和目的基因AtCKX2的特异性引物,对转基因植株进行验证,PCR结果表明启动子Tfm7和目的基因AtCKX2已经转进番茄植株内。qRT-PCR结果显示：AtCKX2基因在番茄植株的叶片内不表达,在授粉后的花中表达。AtCKX2基因在授粉花后5 d的果实中表达量最高,随着果实的发育,AtCKX2基因的表达量逐渐下降,在果实发育后期表达量最低。对番茄果实进行研究发现,转基因番茄果实中内源细胞分裂素玉米素(zeatin, ZT)、异戊烯基腺嘌呤(isopentenyladenine, iP)的含量降低,单果重量和纵横径减小,而且果实中的可溶性糖和可溶性蛋白的含量降低,可滴定酸的含量上升。这些结果表明内源细胞分裂素能够影响番茄果实的生长发育,本研究为细胞分裂素在果实发育中的作用提供了新思路和依据。

• 外施苹果酸对紫色小白菜花青苷合成关键基因的影响

  陈露, 李家明, 周相助, 许茹, 林义章, 钟凤林

  紫色小白菜(Brassica campestris ssp. chinensis var. comunis)叶片正面为紫色、背面为绿色,富含花青苷,具有较高的营养价值。有机酸类物质是果蔬风味品质的重要组成因素,在花青苷的生物合成中起着信号分子作用。为此,本研究设置外施苹果酸浓度0、0.5、1.5、3、5、10 mg/L共6个处理,测定紫色小白菜叶片色泽参数及花青苷含量,克隆BcMYB2 (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog 2)、BcMYB12和BcMYB111基因,进行生物信息学分析,并通过qRT-PCR技术分析不同浓度外施苹果酸对BcMYB2、BcMYB12和BcMYB111在紫色小白菜叶片中表达的影响。结果表明,随外施苹果酸浓度的增加,叶片紫色程度由浅到深再到浅,花青苷含量呈现先上升、后下降的趋势。通过RT-PCR技术克隆BcMYB2、BcMYB12和BcMYB111基因,得到ORF长度分别为758、1 102和963 bp,编码248、365和321个氨基酸,且3个基因编码的氨基酸序列均具有R2和R3保守结构域,属于R2R3-MYB基因家族,与白菜(Brassica rapa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)亲缘关系较近;3个基因的编码蛋白均预测显示不稳定亲水性,无信号肽和跨膜区。qRT-PCR结果表明,BcMYB2和BcMYB12在紫色小白菜叶片中的相对表达量在外施苹果酸处理12 d最高,且随外施苹果酸浓度的增加呈先上升、后下降的趋势;BcMYB111相对表达量在整个处理期均较低,且各处理间无显著性差异。本研究结果说明,适宜浓度的外施苹果酸能够促进BcMYB2和BcMYB12在紫色小白菜叶片中的表达并提高花青苷含量,从而提升紫色小白菜营养品质。本研究可为进一步探讨苹果酸对于紫色小白菜呈色性能的影响提供基础资料。

• 甜瓜苗期耐冷性的多世代联合遗传分析

  徐小军, 梁长志, 刘海英, 张桂兰, 刘珂珂, 杨路明, 胡建斌

  耐冷性是植物对低温环境适应能力的重要体现,甜瓜(Cucumis melo)作为低温敏感植物,其耐冷性遗传方式尚不明确。为探明控制甜瓜苗期耐冷性的遗传模型及基因作用方式,本研究以耐冷、冷敏甜瓜自交系构建了6世代遗传群体,采用主基因+多基因混合遗传模型研究春秋两季甜瓜苗期耐冷性的遗传规律。结果显示,甜瓜苗期耐冷性呈现明显的数量性状特征,趋向显性遗传,其遗传模型符合2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因模型。主基因的效应以显性效应为主,同时也具有较强的互作效应,且易受环境因素的影响。B1∶2、B2∶2和F2∶3世代在春季的主基因遗传率分别为73.22%、92.36%和95.57%,秋季的主基因遗传率分别为49.58%、84.15%和83.18%,多基因遗传率较低且仅在B1∶2世代中检测到。主基因在F2及其自交后代、B2与冷敏亲本回交后代中的早期选择效率较高,B1世代可加强多基因的选择。本研究为甜瓜苗期耐冷性遗传改良提供了参考依据。

• 燕山葡萄MAPK基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

  朱自果, 张庆田, 李秀杰, 韩真, 李桂荣, 李勃

  促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)级联途径在植物的生长发育和应答逆境的信号传导中起着重要作用,但有关MAPK家族成员在中国野生葡萄(Vitis sp.)中的作用研究较少。本研究从中国野生燕山葡萄(Vitis yeshanesis)中获得2条MAPK新基因VyMAPK2和VyMAPK3(GenBank No. MK942078; MK942077),对其进行生物信息学及亚细胞定位分析,并进行生长调节剂及干旱、高盐和低温等逆境处理下的表达分析。VyMAPK2和VyMAPK3蛋白序列中包含MAPK家族所特有的11个保守蛋白激酶亚结构域、TEY基序、活化环(activition-loop)、停靠区域(common docking domains)、磷酸化环(P-loop)和催化位点(C-loop)等结构域,分别归属于MAPK家族的B和A亚家族。亚细胞定位分析表明,VyMAPK2蛋白主要分布在细胞核,VyMAPK3蛋白也主要分布在细胞核,但在细胞质中也有分布基因表达分析显示,VyMAPK2表达量在根中最高,VyMAPK3表达量在叶中最高;生长调节剂处理下,生长素、赤霉素、细胞分裂素、乙烯、脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯均能够显著诱导VyMAPK3基因的表达(P<0.05),而VyMAPK2的表达变化不明显;在逆境下,干旱、高盐和低温均能够显著诱导VyMAPK3基因的表达(P<0.05),而VyMAPK基因仅受干旱的诱导。以上结果表明, VyMAPK3基因在燕山葡萄生长发育和抵御外界逆境胁迫方面起着重要的作用,此研究有助于了解中国野生葡萄的抗逆机制,为葡萄抗逆育种提供基因资源。

• 美国红枫叶片转录组分析

  郭聪, 王莹, 谈峰, 陈燕, 李玉娟

  美国红枫(Acer rubrum)叶色鲜红美丽,在园林植物中被广泛的应用,同时也常用作防护林树种和风景林树种。为了了解美国红枫转色期叶片中差异表达基因及分子调控途径,本研究对美国红枫转色期叶片进行RNA-Seq测序和分析,共获得unigenes 78 571条,总长度为71 788 869 bp,平均长度913.68 bp。通过与蛋白数据库的比对,48 387条unigenes可获得注释信息。基因本体(Gene Ontology, GO)分析发现注释到的基因涉及53个功能组,其中代谢过程(生物学过程)、细胞(细胞组分)以及催化活性(分子功能)的富集程度较高。KEGG分析发现差异表达基因主要对核糖体代谢等生物学过程进行调节。在叶片转色期间,共筛选出7个与花青素相关的转录因子,主要经丙烷类生物合成、花青素生物合成、类黄酮生物合成等机制介导美国红枫叶色调控。同时发现这7个转录因子在红叶或者花叶中表达量较高,进一步提示其在美国红枫叶片转色期可能发挥重要的作用。本研究结果为探究美国红枫叶色变化的分子机制研究提供了参考。

• 三穗鸭ITPR1基因SNPs鉴定及其与蛋壳品质性状的关联性

  李杰章, 谭光辉, 吴磊, 覃媛钰, 张依裕

  1,4,5-三磷酸肌醇受体1 (inositol 1,4,5-trisphosphate receptor 1, ITPR1)是细胞内Ca2+释放通道蛋白,通过调控蛋壳腺钙离子的转运和释放而影响家禽的蛋壳矿化和蛋壳品质。本研究采用PCR产物直接测序法和序列比对技术对186只三穗鸭(Anas platyrhyncha domestica) ITPR1基因的遗传变异位点进行鉴定,分析SNP变异位点与蛋壳品质相关性。结果表明,在三穗鸭ITPR1基因功能结构域及部分内含子中共检测到14个SNPs突变位点,分别在第8内含子检测到g.46455T>C、g.46459C>A、g.46564A>G、g.46581A>T和g.46649T>G共5个突变位点,第15内含子检测到g.55537A>G、g.55610T>C、g.55620G>T、g.55664A>G、g.55680C>T和g.55709T>G共6个突变位点,第30内含子检测到g.72601T>G和g.72843A>G共2个突变位点,第42外显子检测出1个同义突变位点g.124036C>T;14个突变位点均产生3种基因型,且均为中度多态位点;卡方适应性检验结果显示,14个突变位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05);连锁不平衡分析显示,g.46455T>C、g.46459C>A、g.46564A>G、g.46581A>T和g.46649T>G各位点两两之间存在强连锁不平衡,g.46581A>T、g.55537A>G、g.55620G>T、g.55664A>G、g.55680C>T和g.55709T>G各位点两两之间存在强连锁不平衡,g.72601T>G与g.72843A>G位点间存在强连锁不平衡;14个SNP位点共发现13种单倍型,H2 (CAGTGACTGTGGGC)和H11 (TCAATGCGAC)分别为优势单倍型和劣势单倍型,频率分别为0.131和0.060;关联性分析表明,除g.72843A>G位点外,其余13个SNPs与三穗鸭蛋壳厚度显著关联(P<0.05);g.46581A>T位点与蛋形指数显著关联(P<0.05);除g.55610T>C、g.55664A>G、g.72601T>G和g.72843A>G位点外,其余10个位点与蛋重均显著关联(P<0.05);g.46459C>A、g.55664A>G和g.124036C>T位点与蛋壳重显著关联(P<0.05);除g.124036C>T位点外,其余13个位点均与蛋壳强度显著关联(P<0.05)。综上所述,三穗鸭ITPR1基因主要功能结构域的DNA序列较保守,而内含子遗传变异丰富,且发现的14个SNPs至少与2个蛋壳品质指标显著关联,表明ITPR1基因的遗传变异可能影响鸭的蛋壳品质,可作为鸭蛋壳品质选择的遗传标记。

• 长顺绿壳蛋鸡OCX-32基因SNPs鉴定及其与蛋壳品质的关联性

  吴磊, 李杰章, 谭光辉, 覃媛钰, 张依裕, 罗华伦

  蛋壳基质蛋白卵黄蛋白原-32基因(ovocalyxin-32, OCX-32)是影响蛋壳矿化的一种特异性基质蛋白。为了探讨蛋壳基质蛋白OCX-32基因变异对鸡蛋壳品质的遗传效应,本研究以长顺绿壳蛋鸡(Gallus gallus)为素材,测定其蛋壳品质,采用PCR产物纯化直接测序法对OCX-32基因进行SNPs筛查,分析其对蛋壳品质的影响。结果表明,在长顺绿壳蛋鸡OCX-32基因中检测到3个中度多态的SNPs位点,分别位于内含子1的g.22592362 C>T突变、外显子6的g.22599114 C>T错义突变(苏氨酸变为甲硫氨酸)和g.22599127 G>A同义突变,均产生3种基因型;g.22599114 C>T和g.22599127 G>A突变位点的基因型分布均偏离了Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。3个SNPs突变位点不存在强连锁不平衡,共发现4种单倍型和10种双倍型。生物信息学分析发现,g.22599114 C>T和g.22599127 G>A突变可引起mRNA自由能和蛋白结构的变化,CG组合的自由能为-338.90 kcal/mol,CA为-339.00 kcal/mol,TA为-338.40 kcal/mol;蛋白序列中的苏氨酸变为甲硫氨酸后,α螺旋由39.27%变为40.00%,自由卷曲由41.09%变为40.36%。关联性分析结果显示,3个SNPs位点分别对长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的影响未达到显著水平(P>0.05);双倍型H3H4个体的蛋形指数显著高于双倍型H2H3 (P<0.05);双倍型H4H4个体的蛋壳强度显著高于其他9种单倍型(P<0.05),蛋壳厚度显著高于H2H4和H1H1 (P<0.05);双倍型H1H2的蛋壳重显著高于双倍型H1H1和H2H4 (P<0.05),综合各双倍型各指标之间的差异,双倍型H4H4是影响蛋壳强度和蛋壳厚度的关键双倍型。研究结果揭示OCX-32基因变异能影响长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质,所检测到的3个SNPs位点可能作为鸡蛋壳品质选择的遗传标记,为深入研究长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质提供数据参考和理论支持。

• 利用重组腺病毒过表达PPARγ对牛肌肉细胞脂质沉积的影响

  滑留帅, 王璟, 徐照学, 王二耀, 陈宏

  动物肌内脂肪沉积是一个复杂的生物学过程,涉及肌肉细胞分化、脂肪细胞分化及甘油三酯代谢等多个方面。过氧化物酶体增殖物活化受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)基因在动物的脂肪细胞分化过程中具有核心调控作用,但是PPARγ基因的表达水平与肌内脂肪含量之间的关系尚不明确。本研究旨在包装牛(Bos taurus) PPARγ基因腺病毒(Adenovirus),并分析过表达PPARγ对肌肉细胞脂质沉积的影响。将PPARγ亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV后,构建载体pAdTrack-CMV-PPARγ。将线性化的pAdTrack-CMV-PPARγ载体和腺病毒骨架载体pAdEasy-1共转化至重组细菌大肠杆菌(Escherichia coli) BJ5183细胞中,在细菌中同源重组后,成功构建腺病毒骨架载体pAdEasy-1-PPARγ。将线性化的pAdEasy-1-PPARγ转入人(Homo sapiens) 293A细胞中包装并扩增PPARγ腺病毒。用PPARγ腺病毒感染牛肌肉细胞后,用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测脂质沉积相关基因的表达变化。结果表明,成功构建了PPARγ腺病毒载体,包装了PPARγ腺病毒并进行2次扩增后,获得的PPARγ腺病毒滴度为2×1011 空斑形成单位(plaque forming unit, PFU)/mL。使用该PPARγ腺病毒感染牛肌肉细胞,获得了90%以上的感染效率。在牛肌肉细胞中过表达PPARγ后,脂质沉积正向调控基因脂肪酸结合蛋白4 (fat acid binding proteins 4, FABP4)、葡萄糖转运蛋白4 (glucose transporter 4, Glut4)和脂肪特异性磷脂酶A2 (adipose-specific phospholipase A2, AdPLA2)的表达水平分别上升至1.89、1.51和1.56倍(P≤0.05)。而脂质沉积负调控基因GATA结合蛋白2 (GATA binding protein 2, GATA2)、激素敏感脂酶(hormone-sensitive lipase, HSL)、核受体亚家族2F组成员2 (nuclear receptor subfamily 2, group F, member 2, Nr2f2)的表达水平分别下降至0.45、0.57和0.25倍(P≤0.05)。同时,PPARγ辅激活因子1α (PPARγ coactivator-1 α, PGC1a)的表达水平上调至141.41倍(P≤0.01),而生肌因子5 (myogenic factor 5, Myf5)的表达变化不显著。本研究成功包装了PPARγ腺病毒,为进一步研究该基因的功能提供了工具,同时证明在牛肌肉细胞中过表达PPARγ有促进肌肉细胞内脂质沉积的趋势。

• 小尾寒羊和苏尼特羊从短光照到长光照过程中促黄体素和催乳素的变化特征

  夏青, 张金龙, 狄冉, 贺小云, 张效生, 王翔宇, 胡文萍, 刘秋月, 储明星

  大部分绵羊(Ovis aries)是季节性发情动物,发情行为受下丘脑-垂体-性腺轴相关激素调控。本研究探究在不同光照条件下常年发情的小尾寒羊母羊和季节性发情的苏尼特羊母羊中促黄体素(luteinizing hormone, LH)和催乳素(prolactin, PRL)的分泌变化规律,将去卵巢的小尾寒羊和苏尼特羊饲养在光控羊舍中,短光照下饲养42 d后转至长光照饲养42 d,在不同光照条件下采集绵羊颈静脉血,采用放射免疫法测定两品种绵羊血液中LH和PRL在不同光照时间点的浓度。结果表明,苏尼特羊PRL浓度在短光照下较低,在长光照下较高;小尾寒羊PRL浓度在不同光照条件下变化趋于稳定;且在短光照第7 d和短光照第21 d时小尾寒羊PRL浓度显著高于苏尼特羊(P<0.05),而从长光照第28 d开始小尾寒羊PRL浓度显著低于苏尼特羊(P<0.05)。小尾寒羊LH浓度在不同光照条件下基本稳定,在短光照第21天苏尼特羊LH浓度显著低于小尾寒羊(P<0.05)。研究结果表明,长短光照条件下PRL的浓度变化是导致季节性发情绵羊发情状态改变的重要因素,长光照下苏尼特羊体内PRL浓度较高,高浓度的PRL可能减弱苏尼特羊垂体中LH对促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)的应答,进而抑制卵泡成熟及排卵,最终促使苏尼特母羊进入休情状态。本研究为进一步探索绵羊季节性发情机制提供激素方面理论依据。

• 江口萝卜猪UCP3基因变异及其表达量与肉质性状关联性分析

  张继, 吴雪, 邱淦远, 刘鹏程, 杨茂林, 刘若余

  解耦联蛋白3 (uncoupling protein 3, UCP3)作为重要调控蛋白,主要参与机体能量代谢调节,在脂质代谢,脂肪酸氧化和脂肪沉积中起着重要作用,对氧化磷酸化反应途径是否产生ATP起决定性作用。为研究UCP3基因与猪肉质性状之间的关系,本研究测定了165头江口萝卜猪(Sus scrofa) 11项肉质性能指标,利用混合DNA池扩增UCP3基因全部外显子,测序筛选SNPs位点,用单个样本DNA扩增SNPs位点对应外显子并测序,以验证位点和分型,分析各位点不同基因型江口萝卜猪肉质性能差异。采用qRT-PCR检测了UCP3基因在背最长肌中的表达量,进行基因型、肉质性能以及基因表达量的相关性研究。研究结果发现了6个SNPs位点,g.3127A>G、g.3205T>C、g.10439C>T、g.10441C>A、g.10466G>A、g.10479A>G/T。群体遗传参数分析发现除g.10479A>G/T位点外的其他位点杂合度高,说明群体内等位基因分布比较均匀;有效等位基因数高,表明群体内变异程度大;多态信息含量均大于0.25,为中度多态,表明位点可以提供一定的遗传信息。χ2检验显示6个位点均极显著偏离Hardy-Weinberg平衡。连锁不平衡分析发现,g.3127A>G和g.3205T>C位点、g.10439C>T和g.10466G>A位点为完全连锁不平衡,g.10439C>T、g.10441C>A、g.10466G>A、g.10479A>G/T之间为强连锁不平衡。SNPs位点与肉质的关联性分析发现g.10479A>G/T位点TT型和GG型个体大理石纹评分显著高于AA型和AG型个体,剪切力则反之;基因型与背最长肌中UCP3基因表达量的关联性分析发现,g.10439C>T、g.10441C>A、g.10466G>A以及g.10479A>G/T 4个位点上均为突变型个体表达量极显著高于另外两种基因型;UCP3基因在背最长肌中的表达量与两项肉质指标存在极显著相关性,其中与剪切力负相关,与肌内脂肪含量正相关。本研究结果表明,g.10439C>T、g.10441C>A、g.10466G>A以及g.10479A>G/T位点为影响江口萝卜猪肉质性能的重要SNPs位点,且UCP3基因表达量提高有利于肌内脂肪的沉积,此研究结果为筛选有助于江口萝卜猪肌内脂肪沉积的分子标记提供了参考依据。

• CTRP6基因缺失对小鼠健康的影响

  吉苗, 毋文静, 郑诚, 徐珂, 黄鑫, 彭永佳, 滕懿群, 张瑾, 东方阳

  补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6 (complement-C1q/tumor necrosis factor-related protein 6, CTRP6)能够差异调控猪(Sus scrofa)肌内脂肪与皮下脂肪的代谢,在优质瘦肉猪育种中具有潜在的应用价值,但CTRP6基因缺失对动物健康的影响尚不明确。本研究构建了CTRP6基因敲除(knock-out, KO)小鼠(Mus musculus),通过对其产子数、体重、采食量及压力环境下的行为学分析,结合组织切片、生理指标和基因表达数据,明确了CTRP6基因缺失对其健康的影响。结果表明,KO小鼠平均每窝产子数为5.4±0.3,存活率为(92.1±3.2)%,野生型(WT)小鼠平均产子数为5.7±0.7,存活率为(93.1±4.5)%,两种基因型无显著差异;体重分析发现,在相同饲养条件下,KO小鼠8周龄的体重为(25.08±0.34) g,显著低于同龄WT小鼠((28.34±1.06) g)(P<0.05),并且KO小鼠的白色脂肪质量显著低于WT小鼠(P<0.05),但二者的日均采食量无显著差别。在悬尾实验和强迫游泳实验中,KO小鼠不动时间均长于WT小鼠,推断其在压力环境下更容易放弃挣扎;旷场实验中,KO小鼠水平运动次数低于WT小鼠,推断KO小鼠对新环境的探索欲低;糖水实验中两种基因型小鼠的糖水消耗量无显著差别;水迷宫实验中,前5 d的定位航行实验证明KO小鼠与WT小鼠的学习能力无明显差别,但在第6天的空间搜索实验中,KO小鼠在1 min内穿越原平台次数显著低于WT小鼠,推断其记忆能力有所降低。进一步通过大脑切片和脑组织中炎症相关基因分析发现,KO小鼠炎症水平高于WT小鼠;对海马区记忆相关基因表达水平分析发现,KO小鼠FBJ鼠骨肉瘤癌基因(FBJ osteosarcoma oncogene, c-fos)的表达水平显著低于WT小鼠(P<0.05)。综上,CTRP6基因缺失对小鼠的产子数和采食量无显著影响,但降低了小鼠的体重和脂肪积累,并对小鼠的抗压力、探索欲以及记忆力均有负面影响。本研究为深入揭示CTRP6基因功能提供了理论依据。

• 大弹涂鱼肝型GP基因的克隆及其在氨氮胁迫下的响应

  郭婷婷, 孟繁星, 黎明, 王日昕

  随着集约化水产养殖的迅速发展,氨氮在养殖水体中的积累会影响鱼类糖原代谢,严重的甚至造成鱼体死亡。为了研究氨氮胁迫对大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)糖原动员能力的影响及肝型糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase, GP)基因序列特征,本研究以大弹涂鱼为研究对象,对照组生活在10‰海水中,实验组进行为期72 h的氨氮胁迫(10‰海水+8 mmol/L氯化铵)。对大弹涂鱼血糖、糖原含量、糖原合成酶、肝型GP序列和酶活及氨氮胁迫对基因表达的影响进行了研究,结果显示,实验组大弹涂鱼血糖水平比对照组显著升高(P<0.05),肝糖原含量比对照组显著下降(P<0.05),肌糖原、鳃糖原含量无显著变化,表明大弹涂鱼在氨氮胁迫下,主要动员肝糖原而非肌糖原或鳃糖原,以维持体内葡萄糖稳态。基因表达及酶活性分析显示,实验组大弹涂鱼的肝型GP活性及表达量显著升高(P<0.05),肝糖原合成酶活性及表达量无显著变化。表明氨氮胁迫下,肝糖原的分解代谢增加,肝糖原合成代谢无显著变化。本研究克隆了大弹涂鱼的肝型GP基因(登录号为：XM_020932431.1, XM_020935772.1)。GP基因的ORF长为2 544 bp,编码847个氨基酸,AT含量为44.54%,蛋白质的理论等电点为5.94,分子量为97 kD,含有1个磷酸化酶吡哆醛磷酸酯附着位点(EA-[SC]-Gx-[GS]-xMKx(2)-[LM]-N)、8个N-糖基化位点和11个蛋白激酶磷酸化位点,其中一种是环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)和环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)依赖性蛋白激酶磷酸化位点。大弹涂鱼肝型GP基因与人类(Homo sapiens)的同源序列相似性为80.36%,与其他鱼类的同源序列相似性为81.11%~86.89%,表明大弹涂鱼肝型GP基因具有高度序列保守性。分子进化研究在大弹涂鱼GP基因中检测到3个正选择位点(686G, 715N, 807G),表明大弹涂鱼GP基因出现了独特的适应性进化。本研究为进一步研究大弹涂鱼肝型GP等糖原代谢基因在氨氮胁迫下的响应机制提供了依据。

• 小麦抗赤霉病遗传育种研究进展

  牛皓, 姜玉梅, 牛吉山

  小麦(Triticum aestivum)是重要的粮食作物,其高产、稳产对我国的粮食安全至关重要。小麦赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是危害严重的籽粒病害,严重威胁着我国小麦的安全生产和食品安全。本文从小麦赤霉病危害、抗赤霉病种质筛选鉴定、抗病类型、抗病性遗传、抗病基因定位、抗病分子机制、抗病育种、转基因等方面研究进展进行了综述,并提出了未来小麦抗赤霉病育种突破,需要深入研究病原致病机制和寄主抗病机制,以期为开拓建立在高度阻止或完全阻止病菌入侵的抗病机制上的抗病育种新途径提供理论依据。

• 基于双重微滴数字PCR对转基因玉米Bt11品系定量检测

  梁美丹, 宋安华, 张明明, 雷燕, 黄志深, 肖剑

  转基因玉米(Zea mays) Bt11是具有抗虫、耐除草剂的转基因玉米品系,目前缺乏对其进行准确定量的检测方法。微滴数字PCR (droplet digital PCR, ddPCR)是近年来新兴的第三代PCR技术,在转基因产品定量领域具有极大的应用前景。为探索微滴数字PCR在转基因植物成分检测中的应用,解决现行转基因食品标准存在的问题,完善我国转基因食品检测监管体系,本研究基于双重微滴数字PCR平台建立转基因玉米Bt11品系及内源基因定量检测方法。选择玉米内源基因Zein及Bt11品系特异性基因Cry1A(b)作为定量靶标序列,从稳定性、特异性、定量线性范围、定量检测低限及准确性分析等方面综合评价双重微滴数字PCR定量检测转基因玉米Bt11品系的方法。实验结果表明,所建立的方法能够实现转基因玉米Bt11品系特异性序列和内源基因的特异性扩增,该方法稳定性好,单位体系内源和外源基因拷贝数在DNA浓度为0.05~10 ng/μL时呈现良好的线性,相关系数R2为0.999;内源和外源基因的定量低限(limit of quantitation, LOQ)分别为11.14和3.96个拷贝,定量准确度试验结果显示相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)在5.68%~10.31%之间,满足小于25%的要求。本研究建立的转基因玉米Bt11品系双重微滴数字PCR定量检测方法特异性强、稳定性好、准确度高、定量范围广,可用于食品中转基因玉米品系成分的定量检测。

• 尼罗罗非鱼p38MAPK多克隆抗体的制备及鉴定

  胡平各, 邹芝英, 祝璟琳, 喻杰, 肖炜, 李大宇, 杨弘, 马银花, 陈炳霖

  p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)在生物自身免疫调节过程中起着重要的作用。为探讨p38MAPK在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫应答中的作用机制,本研究全基因合成p38MAPK部分编码序列,构建了重组质粒pET-28a-p38MAPK,并成功在大肠杆菌(Escherichia coli)中诱导表达;诱导表达的蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后,免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)制备了尼罗罗非鱼p38MAPK多克隆抗体,并用多克隆抗体检测尼罗罗非鱼不同组织中p38MAPK蛋白表达情况。研究结果显示,诱导表达的重组蛋白约为23 kD,主要以包涵体的形式存在,酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和Western blot分析表明,所制备抗体效价达到1∶256 000,且能特异性识别p38MAPK蛋白。组织表达分析表明,p38MAPK在尼罗罗非鱼各组织中广泛分布,在卵巢,脑和肌肉中表达最强,头肾和血液次之,皮肤和鳃表达较弱,肝、脾、肠和心脏表达最弱。本研究为深入了解尼罗罗非鱼抗病免疫提供了基础资料。

• 基于mtCOI基因的三种短体线虫多重PCR检测

  秦鑫, 王亚东, 李红梅, 于家荣, 王暄

  短体线虫(Pratylenchus spp.)是严重破坏世界农业生产的一类植物寄生线虫,建立针对该类线虫的快速检测方法,对根腐线虫病的综合防控至关重要。本研究基于线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(mitochondrial cytochrome oxidaseⅠ, mtCOI)基因序列,分别设计了咖啡短体线虫(P. coffeae)、落选短体线虫(P. neglectus)和斯克里布纳短体线虫(P. scribneri)的特异性上游引物Pc-m193-F、Pn-m280-F和Ps-m66-F以及三者通用的下游引物Pcns-m-R,扩增产物预期大小分别为225、137和351 bp,检测灵敏度分别为1/1 000、1/10 000和1/100单条成虫;经过不同引物配比及退火温度等反应条件优化,当引物Pc-m193-F、Pn-m280-F、Ps-m66-F、Pcns-m-R浓度分别为0.4、0.4、0.8、1.2 µmol/L,退火温度为54 ℃时,上述引物组合在1个PCR反应体系中能够同时检测出3种靶标线虫。运用该多重PCR体系对18个短体线虫样品进行检测,结果与已知鉴定结果相一致。本研究建立的多重PCR体系可快速检测咖啡短体线虫、落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫单一或复合侵染样品,可为我国小麦(Triticum aestivum)根腐线虫病的诊断与综合治理提供技术支持。