农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2025年第5期

• 水稻OsGASR6基因的功能研究

  王成, 刘滔

  水稻(Oryza sativa) OsGASR6 (GA-stimulated transcript-related 6)基因属于植物赤霉素酸刺激转录(gibberellic acid-stimulated transcript, GAST)基因超家族,已有研究表明,该基因家族参与调控植物细胞的生长,影响植物器官的形态和大小。本研究对OsGASR6基因的序列进行生物信息学预测与分析,发现OsGASR6基因具有典型的GAST类基因的序列特征,启动子区有多个激素响应、胁迫响应、光响应和组织特异性表达等顺式作用元件;亚细胞定位预测和融合表达载体表达定位结果显示,OsGASR6蛋白定位于细胞外空间;利用β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase, GUS)报告基因分析OsGASR6基因的启动子活性,发现OsGASR6启动子在水稻胚乳里具有较高活性,在根和茎中也有活性。对过表达和RNAi干扰OsGASR6基因表达的水稻株系进行表型鉴定与分析,结果显示,过表达OsGASR6基因会使水稻株高极显著降低(P<0.01),RNA干扰株系的种子厚度极显著增加(P<0.01)。本研究为水稻株型改良和籽粒品质分子育种提供了重要靶点。

• 基于代谢组学技术分析3种颜色绿豆的呈色物质

  张鸣慧, 王新妤, 张丁, 张振鑫, 申慧芳, 郭锋

  绿豆(Vigna radiate)种皮颜色多样是其重要的表型特征之一。黄酮类化合物是影响绿豆种皮颜色的关键物质,具有重要的药用价值,不同种皮颜色的绿豆营养价值和经济价值差异较大。本研究以'张家口黄绿豆' (ZH)、'晋绿豆8号' (JL8)和'冀黑绿0506' (JH)为材料,用非接触式分光光度计测定绿豆的表型参数,采用广泛靶向代谢组学技术,对绿豆籽粒的代谢物进行检测分析,通过K-means聚类分析筛选关键差异代谢物,并与表型参数做相关性分析,探究不同颜色绿豆的营养价值和颜色形成的分子机制。在3种绿豆中共检测到537种代谢物,218种差异代谢物,15种共有差异代谢物;'张家口黄绿豆'主要在次生代谢物,特别是黄酮类的分布积累上与'晋绿豆8号'和'冀黑绿0506'表现出明显差异。代谢组数据分析显示,氯化飞燕草素葡萄糖苷和槲皮素3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷可能是导致'冀黑绿0506'种皮呈现黑色的物质。K-means聚类和相关性分析发现,木犀草素-7-芸香糖苷、牡荆素-2''-O-葡萄糖苷、地氟酰胺和I-肌醇是绿豆种皮绿色积累的原因。本研究为在分子水平上深入揭示不同种皮颜色绿豆的呈色物质和营养物质提供基础资料。

• 菜心HSF基因家族鉴定及其在高温胁迫下的表达分析

  江定, 袁凡崇, 孙峰林, 李光光, 雷世康, 郑岩松

  热激转录因子(heat shock transcription factor, HSF)在植物调控热响应过程中发挥着重要作用。为了深入研究菜心(Brassica rapa var. parachinensis) HSF基因的功能,本研究利用生物信息学方法对菜心HSF基因家族及其分子特征进行系统鉴定和分析,并对高温胁迫下的基因表达模式进行分析。结果显示,在菜心全基因组水平上共鉴定到39个HSF家族基因,蛋白质序列长度为140~487 aa,分子质量为16.10~53.82 kD,理论等电点为4. 63~10.08,蛋白亚细胞定位预测有38个菜心HSF蛋白定位在细胞核中。菜心HSF基因家族大多数成员的基因结构相对保守,大多数基因都含有2个外显子和1个内含子,同时具有高度保守的DBD结构域、保守基序和HSF结构域。菜心39个HSFs基因在10条染色体上呈不均匀分布,其中在3号染色体上分布最多。在共线性分析中,菜心共有32个HSFs基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)存在共线性关系。菜心和拟南芥HSF基因的系统进化关系比较分析结果表明,这些HSF基因家族成员可以分为A、B、C 3类,各类群数量不等,并且存在9对直系同源基因和2对旁系同源基因。此外,在菜心HSF基因启动子区域中发现了众多与植物激素和逆境响应相关的顺式作用元件广泛分布。qRT-PCR分析表明,高温胁迫显著诱导了大部分菜心HSF基因的特异表达(P<0.05),其中37个HSF基因表现为上调表达,2个HSF基因表现为下调表达;筛选出了10个在菜心苗期叶片或根系中高度表达的HSF基因,推测这些基因在调控菜心应对热激反应过程中起到重要作用。本研究为了解菜心HSF基因家族的特征,深入分析HSF家族成员在菜心响应高温胁迫中的功能提供理论依据。

• Zl-CRK5基因克隆及其在菰茎部膨大发育中的表达分析

  郑宇捷, 周雅萍, 马莹然, 王晶, 汤近天, 夏文强, 张雅芬, 叶子弘, 崔海峰

  菰黑粉菌(Ustilago esculenta)侵染菰(Zizania latifolia)植株茎部能够诱导茎部膨大发育形成可食用的肉质茎,期间菰植株茎部生长素(auxin, IAA)极性运输相关基因表达显著下调。本研究克隆获得菰钙依赖蛋白激酶相关激酶5基因(calcium-dependent protein kinase related kinase 5, Zl-CRK5),gDNA序列全长4 224 bp,可编码453个氨基酸,具有CRK激酶家族典型的STKc_CAMK保守结构域,与短花稻(Oryza brachyantha)遗传距离较近。qPCR分析显示,Zl-CRK5在菰植株茎部与叶鞘表达显著高于须根与叶片(P<0.05),并受菰黑粉菌侵染诱导调节,其在侵染7 d后的菰植株茎部表达显著下调(P<0.05);菰起始膨大发育后,植株茎部Zl-CRK5表达显著下调(P<0.05),并在随后膨大发育进程中维持较低表达(P<0.05);IAA极性运输抑制剂萘草胺(N-1-Naphthylphthalamic acid, NPA)处理分析发现,菰植株茎部Zl-CRK5与IAA极性运输相关基因PIN1 (PIN-formed)中Zl-PIN1b及Zl-PIN1c呈协调表达,可能参与了茎部IAA极性运输调节。本研究探讨了Zl-CRK5参与IAA极性运输相关基因Zl-PIN1b及Zl-PIN1c表达调节的可能作用模式,有助于深入揭示菰黑粉菌侵染诱导菰植株茎部膨大发育的调节机制。

• 大葱SVP基因的克隆及其对温度与干旱胁迫的响应

  刘敏, 康屹锋, 张宇辰, 王永勤

  SVP (short vegetative phase)是调控植物开花的重要基因之一。本研究克隆了大葱(Allium fistulosum)的AfSVP基因(GenBank No. AfisC4G02946),其CDS长744 bp,编码247个氨基酸;生物信息学分析表明,AfSVP蛋白分子量为60.35 kD,属疏水性蛋白,在多个物种中具有保守性;将AfSVP基因转入本氏烟草(Nicotiana benthamiana)原生质体后,激光共聚焦显微镜观察表明,AfSVP定位于细胞质和细胞核中;其组织表达分析显示,AfSVP在花中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。在高、低温胁迫、干旱胁迫响应分析显示,AfSVP表达量在高温胁迫12 h达到最高(P<0.05);在低温胁迫72 h达到最高(P<0.05);在干旱胁迫在12 h达到最高(P<0.05)。本研究为大葱非生物因素诱导抽薹开花调控机制的深入研究提供参考。

• 百合光信号转导调控因子LhSPA1基因的克隆和表达分析

  黄丽, 杨捷, 吕博, 宋居荣, 陈锋, 过聪, 杨园园, 向发云, 许本波

  花青苷是百合(Lilium brownii var. viridulum)花色呈色的关键物质之一,其生物合成易受到多种环境因素的影响。SPA1 (suppressor of phyA‐105)转录因子在植物光信号转导调控过程中扮演着重要角色。为了深入理解LhSPA1基因在光诱导东方百合(Lilium oriental hybrid)花青苷调控机制中的功能,本研究以东方百合品种'红马丁'为材料,对经过不同光照处理的百合花蕾中花青苷的含量差异进行比较,并对完全显色期的花蕾花被片进行超高效液相色谱串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)检测;结合前期转录组数据,对LhSPA1基因进行克隆和生物信息学分析;利用qRT-PCR分析不同光照条件下花青苷生物合成相关基因的表达水平。结果表明,'红马丁'花被片中的主要呈色成分为矢车菊素和天竺葵素。遮光处理降低了百合花蕾中花青苷的积累。基因表达分析结果表明,遮光处理导致了花青苷生物合成相关基因的表达下调,但LhSPA1基因表达量显著高于正常光照条件(P<0.05)。LhSPA1基因(GenBank No. PQ499086)编码序列长度为2 931 bp,编码976个氨基酸。进化树分析结果表明,LhSPA1蛋白与单子叶植物玉米(Zea mays)的ZmSPA1蛋白的进化关系较近。序列分析表明,LhSPA1蛋白与其他物种的SPA1蛋白具有相似的保守结构域。亚细胞定位结果表明,LhSPA1蛋白荧光信号位于烟草(Nicotiana tabacum)细胞核中。在百合花被片中瞬时过表达LhSPA1和组成型光形态建成蛋白1 (constitutive photomorphogenic 1, COP1)基因会导致百合花色变浅。综上所述,LhSPA1基因可能在光诱导百合花青苷生物合成过程中发挥重要作用。本研究为解析光信号调控百合花青苷生物合成通路的分子机制提供了参考。

• 铁皮石斛SPL基因家族鉴定及表达分析

  郑飞雄, 许张婷, 孙乙铭, 江林琪, 俞振明, 沈晓霞

  SPL (SQUAMOSA promoter binding protein-like)是对植物生长发育和逆境应答具有关键作用的转录因子。本研究运用生物信息学方法对铁皮石斛(Dendrobium officinale)全基因组进行DoSPL基因家族鉴定,并对其染色体定位、启动子元件组成、基因结构、系统发育和亚细胞定位进行预测分析,利用qRT-PCR方法对DoSPL基因家族在不同组织和胁迫处理下的表达模式进行分析。结果显示,铁皮石斛中有16个SPL家族成员,可分为7个亚家族,均存在SBP锌指结构,多数是定位于细胞核上的亲水性蛋白;16个DoSPLs分布在10条染色体上,存在3对串联复制基因;DoSPLs启动子中存在生长发育、逆境应答等调控元件。多物种系统进化分析显示,铁皮石斛与水稻(Oryza sativa) SPL的遗传距离更近。基因表达分析显示,DoSPLs基因在不同组织呈现显著的差异化表达,在花中高表达;多数基因响应茉莉酸甲酯、低温或盐处理,表达水平显著上调或下调,特别是DoSPL12基因在上述胁迫中显著上调表达,可能在铁皮石斛逆境应答中发挥重要作用。本研究为深入探讨DoSPL基因家族功能提供了基础资料。

• 苦参查尔酮合酶(CHS)基因家族的鉴定与表达谱分析

  刘阿克, 卢俊洁, 刘林涛, 牛天增, 刘江天, 宋慧芳, 王茜

  苦参(Sophora flavescens)根部富含黄酮类次生代谢物。查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是类黄酮生物合成途径的第1个限速酶,其特性和活性直接影响次生代谢产物的合成和积累。为了解析苦参CHS基因家族的系统发育关系及其表达谱,以揭示其在苦参黄酮生物合成中的作用,本研究利用生物信息学方法鉴定了苦参21个CHS家族成员,基因重复事件是该家族扩增的主要原因,苦参CHS基因重复后经历了纯化选择作用。系统发育分析将苦参CHS基因分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组。家族成员在进化上并不保守,但是在同一分组中的成员在基因结构和基序分布上较为相似。SfCHS04启动子区域含有的响应抗逆性类元件数量最多。通过转录组分析苦参CHS基因在不同组织(根, 茎, 叶和花)中的表达发现,苦参CHS基因普遍在花中特异性表达。基于苦参豆荚发育转录组和代谢组的共表达网络分析发现,SfCHS04和SfCHS20处于网络的中心,参与调控的主要转录因子包括ERF、MYB、WRKY和NAC等家族成员,对于苦参豆荚的发育和黄酮成分的积累具有重要作用。SfCHS基因的qPCR定量结果表明,不同的SfCHS基因在根发育和不同生长年限的多个组织中表达存在显著差异。本研究阐明了苦参CHS基因的系统发育和表达谱特征,为深入理解黄酮类化合物的生物合成机制以及分子育种手段提高苦参药用价值提供了参考信息。

• 湖羊NR4A1基因3'UTR区多态性及其与早期生长性状的关联分析

  李晓彤, 于昊, 王悦, 谢婧, 茆达干

  核受体亚家族4A组成员1 (nuclear receptor subfamily 4 group A member 1, NR4A1)在绵羊(Ovis aries)多组织中广泛表达,发挥多种生物学功能,参与调控肌肉与骨骼的发育。本研究旨在研究湖羊NR4A1基因非翻译区3'端(3' untranslated regions, 3'UTR)序列特征、多态性及其与湖羊早期生长性状相关性。采用PCR、cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)和桑格测序(Sanger sequencing)等技术获得湖羊NR4A1基因3'UTR序列,利用生物信息学方法进行序列分析;用DNA池扩增测序筛选NR4A1 3'UTR区突变位点,DNA测序法进行个体分型,分析序列多态性及其与早期生长性状的相关性。结果获得556 bp的湖羊NR4A1基因3'UTR序列,在湖羊NR4A1基因3'UTR区发现g.26473 C>T和g.26656 G>A 2处突变。2个位点完全连锁,共有3种基因型,分别为CCGG、CTAG和TTAA型,其中CCGG为优势基因型(88.4%)。关联分析发现,3种基因型湖羊的初生重没有显著差异(P>0.05),CTAG型湖羊的断奶体重、初生至断奶平均日增重均显著高于CCGG型湖羊(P<0.05)。综上,湖羊NR4A1基因3'UTR序列有2个完全连锁的突变位点,共有CCGG、CTAG和TTAA 3种基因型,其中CTAG型湖羊在早期生长方面有优势,该位点有望成为湖羊分子育种的潜在分子标记。

• 湖羊GAB1基因多态性及其与体尺性状的关联分析

  张健, 王维民, 田慧彬, 赵利明, 杨晓斌, 马宗武, 孔得文, 曹佩亮, 李泓舰, 李林庭, 贾国星, 张小雪

  生长因子受体结合蛋白2 (growth factor receptor-bound protein 2, GRB2)相关结合蛋白1 (GRB2 associated binding protein 1, GAB1)是激活的受体型激酶触发的细胞内信号级联中发挥作用的衔接蛋白,对维持成骨细胞功能完整性具有重要作用。本研究旨在探讨湖羊(Ovis aries) GAB1基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与其体尺性状的关联性。选择506只系谱清晰、实验数据记录准确且体格健康的湖羊为实验对象。通过PCR扩增技术和AQP™基因分型技术对GAB1基因位点多态性进行检测,在绵羊GAB1基因的第5外显子中检测到g.14514496 T>C多态位点的CC、TC和TT 3种基因型。并利用一般线性模型与体尺性状进行关联分析,采用qPCR技术对GAB1基因在湖羊各组织的表达水平进行检测。结果显示,绵羊GAB1基因在湖羊多种组织中广泛表达,在瘤胃中的表达量最高。关联分析结果显示,该多态性位点与湖羊体高、体长和胸围等性状呈显著关联(P<0.05)。通过3种基因型个体比较发现,携带CC基因型个体的140日龄、160日龄和180日龄的体高、160和180日龄的体长以及120日龄和160日龄的胸围均显著高于TT基因型个体(P<0.05),表明GAB1 g.14514496 T>C位点可能会影响湖羊的体尺性状。因此,该位点可作为潜在的分子标记。本研究为湖羊的育种研究提供理论支持。

• 植物甾醇酯对小鼠骨骼肌发育的影响

  冯晓华, 谭伟豪, 孙丽娟, 赵伟杰, 陈履双, 谢开来, 朱树庆, 冯霞洁, 孙中华, 吴鑫, 王丽娜

  植物甾醇酯(phytosterol esters, PE)是植物甾醇与脂肪酸酯化形成的活性物质,具有抗炎和调节免疫功能等特性。为探究PE对小鼠(Mus musculus)骨骼肌发育的影响,本研究选取3周龄小鼠随机分成对照组和实验组(即0.3% PE组),通过饲养实验及其体组成、肌肉力量和运动耐力等检测,探究PE对肌肉发育的影响;通过免疫荧光和qPCR检测肌纤维面积和类型以及生肌因子的变化,最后通过ELISA和Western blot方法分析白介素含量及其受体下游信号通路的变化。结果表明,1)饲粮添加0.3% PE可显著增加小鼠平均日采食量(P<0.05),且腓肠肌指数显著上调(P<0.05),皮下脂肪指数出现下调的趋势。2)饲粮添加0.3% PE可显著提升小鼠抓握力与举重分数(P<0.05),而跑步时间和跑步距离无显著变化。3)饲粮添加0.3% PE可显著增加腓肠肌和比目鱼肌的平均肌纤维横截面积(P<0.05),显著上调了生肌因子5 (myogenic factor 5, Myf5) mRNA水平(P<0.05),且肌分化因子(myogenic differentiation, MyoD)和肌细胞生成素(myogenin)蛋白水平也有上调的趋势。4)饲粮添加0.3% PE可显著升高血清中的白介素-11 (interlukin, IL-11)水平(P<0.05),Janus激酶2 (Janus kinase 2, JAK2)磷酸化水平有升高的趋势,信号转导因子和转录激活因3 (signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)磷酸化水平显著升高(P<0.05)。综上所述,饲粮添加PE可以促进小鼠骨骼肌发育,增加肌纤维直径,提升肌肉功能,其促进骨骼肌发育的机制可能与IL-11及其下游JAK2/STAT3信号通路有关。本研究为PE在生产上促进肌肉发育提供理论依据。

• MRFs家族基因多态性与尼罗罗非鱼成鱼生长性状的关联性分析

  张士彪, 陈炳霖, 邹芝英, 肖炜, 祝璟琳, 喻杰, 李大宇, 杨弘

  肌肉重是反应鱼类生长性能的主要性状,肌源性调节因子(myogenic regulatory factors, MRFs)家族基因对肌肉的生成和发育具有重要作用。为探究MRFs家族基因多态性与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)成鱼阶段生长性状的相关性,对MRFs家族基因生肌调节因子5 (myogenic factor 5, myf5)、myf6、生肌决定因子1 (myogenic determination gene 1, myod1)、myod2、肌细胞生成素(myogenin, myog)编码区进行PCR扩增和多重序列对比,从这5个基因中共筛查到26个SNPs位点,其中myf5包含7个位点,myf6包含8个位点,myod1包含6个位点,myod2包含2个位点,myog包含3个位点。位点与生长性状之间的关联性分析结果显示,myf5的N7 (C2543T)位点与体重显著相关(P<0.05),myf6的N9 (A11440G)位点与体重、全长、体长和头长显著相关(P<0.05),其他基因上未发现与生长性状显著相关的位点。通过双倍型与生长性状的关联性分析,在myf5基因上发现了3个与体厚显著相关的双倍型(P<0.05),在myf6基因上发现了4个与生长性状显著相关的双倍型(P<0.05),在其他基因上没有发现与生长性状显著相关的双倍型。以上结果提高了分子标记的应用潜力,获得了2个可作为尼罗罗非鱼成鱼阶段辅助育种的候选标记,为尼罗罗非鱼育种和品质提升工作提供理论依据。

• 绿鳍马面鲀肝表达抗菌肽-2基因的鉴定、表达及抗菌机制初探

  扈艺凡, 魏博崛, 张艺榕, 李长红, 陈炯

  肝表达抗菌肽2 (liver-expressed antimicrobial peptide 2, LEAP-2)是一种阳离子抗菌肽,是动物先天免疫的重要组分。本研究通过转录组测序获得绿鳍马面鲀(Thamnaconus modestus) TmLEAP-2A和TmLEAP-2C的cDNA序列,序列分析显示,二者分别编码103和79个氨基酸,分子量分别为11.18和9.14 kD;TmLEAP-2A和TmLEAP-2C分别与大黄鱼(Larimichthys crocea)的LEAP-2A、LEAP-2C同源性最高,分别为72.8%和62.5%。系统进化树分析表明,TmLEAP-2A和TmLEAP-2C分别与大黄鱼LEAP-2A和LEAP-2C进化相关性最高。qPCR分析表明,TmLEAP-2A和TmLEAP-2C mRNA都主要在肝中表达,并且溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染诱导了二者在肝中的表达。TmLEAP-2A成熟肽(TmLEAP-2AP46)仅对创伤弧菌(V. vulnificus)有抑制活性,TmLEAP-2C成熟肽(TmLEAP-2CP39)对溶藻弧菌和创伤弧菌均有抑制活性。进一步研究发现,TmLEAP-2CP39对溶藻弧菌的基因组DNA有水解作用,并且溶藻弧菌与TmLEAP-2CP39孵育后,对碘化吡啶的摄取增强,活细胞比例大幅下降。扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)观察结果显示,TmLEAP-2CP39孵育后溶藻弧菌形态不完整,细胞膜表面出现皱缩,大部分菌体表面甚至有凹陷或孔洞形成;透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)观察结果显示,TmLEAP-2CP39孵育后溶藻弧菌细胞膜不仅明显皱缩,而且大部分菌体膜质发生分离,细胞膜破裂,内容物外泄。以上结果说明,TmLEAP-2A和TmLEAP-2C与溶藻弧菌感染密切相关,但仅TmLEAP-2C在体外对溶藻弧菌有抑菌活性,且可通过破坏溶藻弧菌细胞膜的完整性和水解基因组DNA (genomic DNA, gDNA),来发挥直接的抗菌作用。研究结果不仅丰富了鱼类抗菌肽知识,也为鱼类抗菌肽类药物的研发提供了理论基础。

• 小黄鱼Trypsin基因克隆及其对高温胁迫和变形假单胞菌感染的响应

  刘浩文, 刘峰, 张天乐, 李倩, 刘四芳, 朱家杰, 楼宝, 俞晓平

  夏季频发的高温以及养殖过程中变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)引起的内脏白点病已成为制约小黄鱼(Larimichthys polyactis)养殖业发展不容忽视的问题,而参与氨基酸代谢的胰蛋白酶(trypsin)可能与小黄鱼面对高温以及变形假单胞菌感染的响应过程存在关联。为探究胰蛋白酶基因在小黄鱼应对高温胁迫和变形假单胞菌感染的响应特征,本研究克隆获得小黄鱼trypsin基因Lp_try的CDS序列共744 bp,编码247个氨基酸,含有Tryp_SPc保守结构域。组织定量分析表明Lp_try基因呈现泛组织表达特性,但是其在消化系统(肠道, 肝脏)和循环系统(心脏)中呈现特异性高表达模式。分别对32 ℃高温胁迫和变形假单胞菌感染后小黄鱼肝脏中Lp_try表达特征进行分析,发现高温胁迫导致Lp_try表达量显著增加(P<0.05),但是随着高温处理时间延长,基因表达量迅速下降;在细菌感染实验中,Lp_try表达量随着病原菌感染时间的延长呈现出降低-升高-降低的动态变化趋势,说明Lp_try在小黄鱼遭受高温胁迫和病原菌侵染过程中发挥了一定的调节作用。本研究为深入解析鱼类响应高温胁迫、病原菌感染等过程中的生理调节机制奠定了重要基础。

• UeSho1调节菰黑粉菌致病力的作用研究

  张雅芬, 冯雨宸, 胡映莉, 叶子弘, 汤近天, 吴骏成, 谢舻, 胡妙丹

  菰黑粉菌(Ustilago esculenta)专性侵染菰(Zizania latifolia)植株,可诱导寄主茎部膨大形成可食用的茭白,其致病力与茭白的形成及表型分化密切相关。研究发现,合成高渗性敏感蛋白(synthetic high osmolarity- sensitive protein, Sho1)作为高渗透甘油(high osmolarity glycerol, HOG)通路上游的环境信号感受器,在真菌致病力调控中具有重要作用。为研究Sho1在菰黑粉菌致病力调控中的作用,本研究首先克隆鉴定了菰黑粉菌中的UeSho1基因(GenBank No. MW768948),其开放阅读框全长1 137 bp,含有1个126 bp的内含子,编码336个氨基酸,包含1个SH3保守结构域,在菰黑粉菌菌丝体外生长和侵染过程中均被诱导表达。进一步在菰黑粉菌中敲除UeSho1后进行体外生长和侵染实验,结果表明,UeSho1缺失不影响菰黑粉菌的单倍体形态、生长速率及体外交配过程,但是抑制了菌丝的丝状生长、减缓了菰黑粉菌侵染寄主的进程,并抑制了致病力相关的b信号途径基因的表达。此外,UeSho1缺失不影响高渗、温度、氧化等胁迫下菰黑粉菌的体外生长状态。本研究揭示了UeSho1在菰黑粉菌致病力调控中的作用,为进一步探索其在菰黑粉菌与菰植株互作诱导寄主茎部膨大中的作用提供了理论基础。

• 沙福芽胞杆菌ABC转运蛋白促进大肠杆菌的锰耐受和生物膜形成

  刘成洁, 牛熙, 黄世会, 王嘉福, 冉雪琴

  细胞中ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter proteins, ABCT)对有毒物质的耐受性起着关键作用,参与细菌生长及毒性化合物的排出。沙福芽胞杆菌(Bacillus safensis) ST7具有较强的锰氧化能力,其中ABCT基因(Gene ID: 46572106)在锰胁迫下表达显著上调,可能与沙福芽胞杆菌的锰耐受能力有关。为了解析沙福芽胞杆菌ABCT在锰胁迫过程中的作用,利用PCR、qPCR和SDS-PAGE等方法,克隆沙福芽胞杆菌ST7的ABCT基因,构建过表达载体,转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3),测定重组菌株的生长曲线、生物膜生成量、耐锰能力和锰氧化活性,研究ABCT基因异源表达对大肠杆菌的锰耐受能力和锰氧化活性的影响。结果显示,重组菌株携带完整的ABCT基因,并在BL21 (DE3)细胞中表达量显著上调(P<0.05),其生长不受影响,生物膜形成能力增强;锰胁迫下ABCT基因表达提高1.41倍,具有时间和浓度依赖性;与对照菌株相比,重组菌株锰耐受浓度和锰氧化活性提高了1.5倍以上。结果表明,沙福芽胞杆菌ABCT基因参与大肠杆菌锰转运和生物膜形成过程,该基因的过表达可以提高大肠杆菌对锰(Ⅱ)的氧化活性和耐受能力。本研究对锰氧化细菌开发和应用具有重要意义。

• 马麝出血症病毒VP60蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

  刘玉东, 邵钰, 杨永宁, 王青, 黄冬, 何肖肖, 王丽, 马海云, 赵云海, 张志雄, 邢小勇, 包世俊

  马麝病毒性出血症(Moschus chrysogaster viral hemorrhagic disease, McVHD)是马麝出血症病毒(Moschus chrysogaster hemorrhagic disease virus, McHDV)引起的一种马麝急性、高度致死性传染病,目前没有关于该病的预防及治疗措施。为了研制安全有效的McVHD疫苗,本研究通过PCR方法扩增McHDV VP60全基因,并将VP60基因插入载体pFastBac1中,然后转化到含有Bacmid质粒的DH10Bac感受态细胞,构建含VP60基因的重组杆粒rBacmid-McHDV-VP60,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-McHDV-VP60,通过Westerm blot、SDS-PAGE试验对重组杆状病毒rBac-McHDV-VP60进行目的蛋白的表达鉴定;通过透射电镜及红细胞凝集试验对VP60蛋白是否形成病毒样颗粒和血凝活性进行鉴定。结果表明,成功构建了重组杆粒rBacmid-McHDV-VP60并获得重组杆状病毒rBac-McHDV-VP60。SDS-PAGE及Western blot鉴定显示,重组杆状病毒感染Sf9细胞表达出大小约63 kD的可溶性McHDV-VP60蛋白。透射电镜观察显示,McHDV-VP60蛋白可自组装成病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),大小约为35 nm,呈球形结构,表面光滑。红细胞凝集试验显示,重组McHDV-VP60蛋白溶液对1%人(Homo sapiens)的O型红细胞的凝集价为1∶215。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统,成功构建了表达McHDV-VP60蛋白的重组杆状病毒,McHDV-VP60蛋白可自组装成VLPs,本研究为McVHD病毒样颗粒疫苗的研制提供了技术支持。

• CRISPR/Cas基因编辑技术在抗除草剂作物育种中的研究进展

  童朝云, 黄宇婷, 杨靖茹, 王智睿, 刘小双, 李娟, 魏鹏程

  创制和选育抗除草剂的优异新种质是极具成本效益和环境友好的草害控制方式。CRISPR/Cas基因编辑技术具有简单、高效、精准等特点,在作物育种领域具有巨大的应用潜力。本研究总结了CRISPR/Cas基因编辑技术在抗除草剂作物育种中的研究进展,重点介绍了作物除草剂的类型、抗性基因靶标突变位点,及CRISPR/Cas介导的精准编辑技术的发展,并详细介绍了基因编辑技术在抗除草剂作物优异新种质创制方面的应用。最后阐述CRISPR/Cas基因编辑技术所存在的问题和发展方向,为创制抗除草剂作物新种质提供理论依据和技术支撑。

• 跨界RNA干扰在植物-微生物互作中的研究进展与应用展望

  闫更轩, 田缘, 刘禹彤, 张淑梅, 田洁萍, 于德水

  RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一类在真核生物中调控基因表达的保守机制。在植物与微生物两大群体中,这一机制不仅调控生物体内的基因表达,还可跨越物种界限,介导不同生物界间的基因沉默,这种跨界、跨物种发生RNAi的现象也因此被称为跨界RNAi (cross-kingdom RNAi, ckRNAi)。跨界RNAi广泛存在于植物和真菌中,并彼此参与调控对方的生长和行为。本文综述了跨界RNAi在植物-微生物互作中的研究进展和应用场景,以期为开发基于跨界RNAi的植物病害防控技术或产品提供参考。

• 番鸭小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒三引物双重PCR鉴别检测方法的建立与评价

  王劭, 刘鸿威, 程晓霞, 朱小丽, 江丹丹, 肖世峰, 陈少莺, 陈仕龙

  番鸭小鹅瘟病毒(Muscovy duck-origin goose parvovirus, MDGPV)是经典鹅细小病毒(Classical Goose parvovirus, cGPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus, MDPV)基因重组产生的新型水禽细小病毒,是引起雏番鸭(Cairina moschata)严重下痢和渗出性肠炎的主要病原之一,导致雏番鸭免疫力下降,患病率和死亡率升高。本研究旨在建立一种能够同时鉴别检测MDGPV和MDPV的三引物双重PCR方法,并对2种病毒当前的流行情况进行鉴别与监测。根据GenBank中已发布的MDGPV和MDPV衣壳蛋白1 (viral capsid protein 1, VP1)基因的重组特征,应用Oligo 7.0软件设计并合成了3条鉴别引物,两两组合形成2套PCR反应体系进行扩增,目的片段大小分别为493 bp (MDGPV)和827 bp (MDPV),分别构建MDGPV和MDPV阳性重组质粒作为标准品,进行双重PCR扩增。结果表明,本研究成功建立了一种可以同时检测MDGPV和MDPV的双重PCR鉴别方法。该三引物双重PCR方法可重复性好,特异性与敏感性高,对MDGPV和MDPV的最低检出测限分别为99.6和96.1 copies/μL总DNA。对102份疑似水禽细小病毒感染发病的临床样品进行检测,MDGPV阳性检出率为31.37% (32/102),MDPV阳性检出率为7.84% (8/102),混合感染阳性检出率为1.96% (2/102),与GPV、MDPV通用SYBR Green Ⅰ PCR检测方法及病毒分离鉴定结果一致。综上所述,本研究所建立的MDGPV和MDPV双重PCR诊断方法特异性高,敏感性好,丰富了水禽细小病毒病的检测手段,有助于MDGPV和MDPV的临床诊断及流行病学监测。