农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2019年第8期

• 一株异养硝化巨大芽胞杆菌的分离鉴定及其脱氮性能研究

  李忠徽, 王淼, 衣萌萌, 王瑞宁, 陈文伟, 卢迈新

  生物法脱氮处理养殖废水是目前最经济有效的方法之一。硝化菌在生物法脱氮过程中起着重要作用。为筛选具有高效脱氮能力的异养硝化细菌,本研究通过富集培养及平板分离纯化,从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)循环水养殖车间用水中筛选出1株异养硝化细菌P5-2。通过对其进行形态观察、生理生化反应鉴定及16S rRNA基因序列分析,确定该菌株为巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)。革兰氏染色结果表明该菌株为革兰氏阳性菌;胞外酶性能测定表明该菌株可以有效利用淀粉及酪蛋白;生长特性研究结果表明,当培养温度为30 ℃、盐度为10‰、pH为7时菌株生长最快,最先进入指数生长期及稳定期。硝化特性实验结果显示,碳源、碳氮比、溶氧量等环境因素均可以影响菌株对氨氮的去除效果;当以柠檬酸钠为碳源、碳氮比为15、pH为7、转速为180 r/min时菌株去除氨氮的效果最佳,24 h的氨氮去除率达99.07%。本研究筛选获得1株高效异养硝化细菌P5-2,并进行了硝化性能研究,为其在处理养殖废水的实际应用提供了基础资料。

• 梨钾通道基因PbAKT1的克隆及其表达分析

  杨晗, 李岩, 申长卫, 金雨濛, 石晓倩, 谢昶琰, 梅新兰, 徐阳春, 董彩霞

  AKT1 (Arabidopsis potassium transport 1)是重要的钾通道蛋白基因,参与植物钾吸收和转运过程。为了探究梨(Pyrus betulifolia) PbAKT1基因对钾的响应及表达模式,本研究采用不同浓度K+处理杜梨幼苗,对PbAKT1基因进行克隆并对其所编码的蛋白进行组织特异性分析。结果表明,克隆获得的PbAKT1基因(GenBank No. MN150549) cDNA全长2 646 bp,编码881个氨基酸,有Shaker家族典型的S1~S6的跨膜结构和1个loop环;氨基酸序列的同源关系分析表明,梨PbAKT1基因与苹果(Malus domestica) MdAKT1基因的亲缘关系最近;亚细胞定位发现,该基因主要定位于细胞膜上,为亲水性稳定蛋白;PbAKT1基因在梨苗根、茎、叶片中都有表达,不存在组织特异性;缺钾条件下,该基因有明显响应。综上所述,梨PbAKT1的表达受到缺钾胁迫的诱导,可能参与梨树K+吸收和转运过程。本研究结果为进一步揭示梨树耐低钾分子机制提供基础了资料。

• 甘蔗SsCBL4基因的克隆及表达特性分析

  凌秋平, 吴嘉云, 杨湛端, 周文灵, 黄莹, 李奇伟, 曾巧英

  类钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcineurin B-like, CBL)作为一种特殊的钙感受器在植物逆境胁迫响应过程中发挥重要作用。甘蔗(Saccharum spp.)是我国最主要的糖料作物和能源作物。根据甘蔗前期转录组测序结果,采用反转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)从低钾胁迫甘蔗根系中克隆得到CBL基因,命名为SsCBL4 (GenBank No. KY674 987.1)。该基因包含1个长度为636 bp的开放阅读框,可编码211个氨基酸。SsCBL4蛋白的相对分子量为23.97 903 kD,等电点为4.88,含有2个保守结构域,均与Ca2+结合相关。同时,SsCBL4具有CBL家族典型的EF-hand (elongation factor hand)结构域,并且含有N-豆蔻酰化结构域和与CBL互作激酶蛋白(CBL-interacting protein kinase, CIPK)互作的FPSF位点。同源性分析结果显示,SsCBL4与高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)和小麦(Triticum aestivum)等作物的CBL4序列有较高一致性。qPCR检测结果显示,在低氮、低磷、低钾、干旱和盐胁迫下SsCBL4基因的表达均有发生改变。其中,低钾、干旱和盐胁迫条件下,该基因表达均为上调。低氮和低磷胁迫条件下,SsCBL4的表达量表现上下波动的变化趋势,在96 h表达量均达到最高点,随后显著下降;低钾处理8~48 h,SsCBL4基因相对表达量随着时间的延长逐渐下降;干旱胁迫8、24和96 h,该基因的相对表达量相对较高,96 h表达量达到最高,约为对照的20.5倍;盐胁迫24~96 h,表达量随着胁迫时间的延长相对表达量逐渐升高,96 h该基因表达量达到最高,约为对照的9.1倍。这些结果说明SsCBL4基因可能在不同逆境胁迫中发挥重要作用,该研究为深入研究SsCBL4抗逆功能和相关分子机制提供参考。

• 烯效唑对低温胁迫下薏苡幼苗光合特性及相关转录因子基因表达的影响

  黄玉兰, 岳才军, 韩毅强, 王景伟, 王丽艳, 贾桂燕, 孙丽芳

  薏苡(Coix lachryma-jobi)作为药食兼用的作物,具有非常高的营养和药用价值,但其基因资源缺乏。烯效唑(uniconazole, S3307)是三唑类植物生长延缓剂,可抑制内源赤霉素的生物合成,从而影响植物生长和抗逆作用。为了获得和挖掘薏苡的基因数据和功能,探究S3307对薏苡幼苗低温胁迫的缓解作用,本研究以'薏辽5号'为实验材料,采用Li-6400XTR光合仪以及转录组测序技术,探讨S3307对低温胁迫下薏苡幼苗光合特性及转录因子基因表达的影响。结果表明,5 mg/L S3307能够显著增加低温胁迫下的薏苡叶片叶绿素含量,蒸腾速率、气孔导度和净光合速率分别提高138.1%、59.59%和50.15%。通过筛选分析及Swiss-Prot数据库注释,获得WRKY类转录因子差异表达基因4个、碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)类差异表达基因6个、碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)类差异表达基因9个和AP2/ERF (APETALA2/ethylene-responsive factor)类差异表达基因6个。利用qRT-PCR技术对10个差异表达基因进行表达分析,变化趋势与转录组测序结果一致。本研究结果有助于深入揭示S3307对低温胁迫下薏苡光合特性和转录因子表达特性的作用机理,可为进一步开展响应低温胁迫的转录因子功能研究提供参考依据。

• 锌指核酸酶介导的陆川猪Fat1基因打靶载体构建及体外转基因研究

  黄幸, 严爱芬, 邓廷贤, 欧阳宏佳, 刘连, 冯娟, 朱向星, 聂庆华, 唐冬生, 张细权

  秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) Fat1基因翻译产物是ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,哺乳动物因为缺少这个基因,不能将ω-6多不饱和脂肪酸转化为ω-3多不饱和脂肪酸,因此只能通过饮食获得ω-3多不饱和脂肪酸,以保证ω-6/ω-3的平衡,满足机体的健康所需。为获得整合了Fat1基因且能稳定表达的转基因猪(Sus scrofa),本实验采用锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)介导的多位点打靶技术从细胞水平上开展了转基因技术的研究。首先构建了陆川猪Fat1基因打靶载体pCAGGS-DS2-eGFP-Fat1-DS1,并设计和构建了两个靶向陆川猪rDNA基因中内转录间隔区1 (internal transcribed spacer-1, ITS-1)序列的锌指核酸酶真核表达载体pcDNA3.1-NLS-ZFN-R和pcDNA3.1-NLS-ZFN-L。然后从猪的肾脏中成功分离出原代成纤维细胞(primary kidney fibroblast, PKF),通过脂质体共转染将Fat1基因打靶载体和锌指核酸酶载体导入细胞,转染细胞7 d后,提取细胞基因组DNA,PCR检测外源基因整合情况,结果表明Fat1基因成功整合到陆川猪PKF细胞基因组中,本研究为进一步获得转基因猪提供了一定的理论依据。

• 从江香猪IGF-1和IGF-2基因的克隆、表达及生物信息学分析

  朱晓锋, 许厚强, 陈伟, 谌颖莲, 倪锴, 吴小敏, 倪萌萌, 卢贤君

  从江香猪(Sus scrofa)具有生长迟缓、个体矮小等特征,与约克夏、杜洛克、长白等猪种相比,在医疗及模式动物的资源挖掘方面有着特殊的价值。本研究通过探讨从江香猪的类胰岛素样生长因子1/2基因(insulin-like growth factors -1/2, IGF-1/2)的生物信息学特征及在从江香猪和大白猪不同组织器官中的表达差异,初步明确从江香猪生长迟缓、个体矮小的原因,为探究微型猪种生长发育分子机制以及人体动物模型的研究提供基础数据。本研究以相同饲养条件下的同龄纯种从江香猪和大白猪作为实验材料,克隆了从江香猪IGF-1 (GenBank No. NM_214256.1)和IGF-2 (GenBank No. NM_213883.2)基因CDS区,并进行结构预测和功能分析;利用qRT-PCR技术分别检测从江香猪和大白猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、脂肪和背最长肌9个不同组织器官中IGF-1和IGF-2基因的mRNA水平。结果发现,从江香猪IGF-1和IGF-2基因CDS区分别为435和577 bp,与GenBank登录的野猪(S. scrofa)的基因编码序列均一致;序列分析结果显示,IGF-1和IGF-2蛋白相对分子质量分别为14.390 44和20.312 51 kD,理论等电点分别为9.34和10.00,不稳定系数为65.58和58.64;遗传进化分析得知,与其他12个物种比较,从江香猪IGF-1和IGF-2基因与野猪的遗传距离最近;qRT-PCR结果显示,IGF-1基因在从江香猪肺、小肠和大肠中表达量最高(P<0.05),而在大白猪背最长肌中的表达量极显著高于其他组织器官(P<0.01);IGF-2基因在从江香猪肝脏和肺脏中的表达量高,显著高于其他组织器官(P<0.05),而在大白猪中背最长肌和心脏的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。本研究结果揭示了IGF-1和IGF-2基因在从江香猪和大白猪中的表达差异性,为进一步探索微型猪种的生长发育机制提供了基础数据。

• 西农萨能奶山羊TRIB3基因克隆及RNA干扰分析

  潘坛, 吕明, 罗军, 李聪

  TRIB3 (tribbles pseudokinase 3)是一类丝氨酸/苏氨酸激酶样蛋白,常作为脂质代谢的负调控因子参与胰岛素信号转导途径,调控机体的脂质代谢。本研究旨在获得西农萨能奶山羊(Capra hircus)TRIB3基因序列并阐明其结构,通过RNAi技术干扰TRIB3基因表达,初步探究其对奶山羊乳腺上皮细胞脂质代谢的影响。以西农萨能奶山羊乳腺组织为实验材料,利用RT-PCR方法对TRIB3基因进行克隆,并进行生物信息学分析,研究结果表明,奶山羊TRIB3基因完整CDS区为1 074 bp (GenBank No. MK158243),编码357个氨基酸;蛋白分子量为39.6 ku,等电点为7.8,为不稳定蛋白;TRIB3存在36个磷酸化位点,无信号肽和跨膜螺旋结构;同源性分析显示,西农萨能奶山羊与绵羊(Ovis aries)、牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus) TRIB3氨基酸序列同源性分别为99%、96%、71%,与绵羊亲缘关系最近。组织表达分析显示,TRIB3基因在奶山羊乳腺组织中显著高表达,其次是脂肪组织。将设计合成的siRNA转染乳腺上皮细胞,结果显示,干扰TRIB3基因表达可显著上调脂质代谢相关基因—过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARG)和二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase, DGAT1)的mRNA水平。上述结果提示TRIB3可能作为负调节因子参与乳腺上皮细胞的脂质代谢。本研究为后续开展TRIB3调控羊奶乳脂代谢的分子机理提供了基础资料。

• 绵羊繁殖轴相关组织RXRs基因的表达及RXRA基因多态性与季节性发情之间的关系

  李华振, 狄冉, 郭晓飞, 张金龙, 张效生, 马琳, 储明星, 刘武军

  大多数绵羊(Ovis aries)品种为现季节性发情品种,严重制约了绵羊的繁殖效率,而类视黄醇X受体(retinoid X receptors, RXRs)作为季节性发情候选基因受到广泛关注。为了探讨RXRs基因3个亚型RXRA、RXRB和RXRG在绵羊不同繁殖状态下的表达差异,本研究利用qRT-PCR检测3个基因分别在常年发情品种小尾寒羊母羊的卵泡期和黄体期以及季节性发情品种苏尼特羊母羊的长光照和短光照条件下的大脑、小脑、下丘脑、松果体、垂体、卵巢、输卵管、子宫、肾脏、肾上腺共10种组织中的相对表达情况。同时采用Sequenom MassARRAY® SNP技术检测RXRA基因2个SNPs在常年发情绵羊品种(小尾寒羊, 湖羊和策勒黑羊)与季节性发情绵羊品种(滩羊, 苏尼特羊和草原型藏羊)的多态性,并与季节性发情性状进行关联分析。结果表明,RXRA、RXRB和RXRG基因在苏尼特羊和小尾寒羊各组织中广泛表达,RXRA基因在苏尼特羊松果体中短光照下表达量显著高于长光照(P<0.05),在小尾寒羊卵泡期卵巢中的表达量极显著高于黄体期(P<0.01),在卵泡期子宫体中的表达量极显著低于黄体期(P<0.01);RXRB基因在苏尼特羊垂体中短光照下的表达量显著高于长光照(P<0.05),在小尾寒羊卵泡期卵巢中的表达量极显著高于黄体期(P<0.01);RXRG基因在苏尼特羊下丘脑、垂体和松果体中高表达,其中松果体中在短光照下的表达量极显著低于长光照(P<0.01),在小尾寒羊卵泡期子宫体中的表达量极显著低于黄体期(P<0.01)。通过MassARRAY飞行质谱技术分型发现RXRA基因2个SNP位点g.1699247 G>A和g. 1699276 G>A在小尾寒羊中分布符合哈代温伯格平衡,且2个SNP位点的基因型频率和等位基因频率在6个绵羊品种的2种不同发情模式间均存在显著差异(P<0.05)。以上结果提示,RXRs基因表达与绵羊的繁殖有关,可能参与绵羊季节性发情上游基因调控,本研究结果有助于理解RXRs基因在季节性发情及发情周期转换中的调控作用。

• 基于差异可变剪接的德保矮马垂体内体高相关基因的筛选

  潘静, 房君, 刘春霞, 曹俊伟, 邢燕平, 周欢敏, 张焱如

  可变剪接使单个基因产生多个mRNA,从而增强蛋白质的多样性,这与生物的生长发育过程密切相关。在中国丰富的马(Equus caballus)品种资源中,德保矮马和蒙古马具有明显的体高差异。本研究利用与马体尺大小密切相关的垂体组织,经RNA-seq和生物信息学分析,检测出可变剪接事件137 449个,主要以内含子保留(intron retention, IntronR)、可变的3'剪切位点(alternative 3' splice site, A3SS)、可变的5'剪切位点(alternative 5' splice site, A5SS)和外显子跳跃(exon skipping, ES)四种可变剪接类型为主。不同品种、不同生长时期马垂体的差异可变剪接基因共37种,其中,幼年德保矮马与幼年蒙古马的差异可变剪接基因23种,成年德保矮马与成年蒙古马的差异可变剪接基因1种,幼年德保矮马与成年德保矮马的差异可变剪接基因5种,幼年蒙古马与成年蒙古马的差异可变剪接基因8种。而幼年德保矮马垂体中WDR35 (WD repeat-containing protein 35 gene)基因的外显子盒(cassette exon)可变剪接和OSBPL6 (oxysterol binding protein like 6)基因的ES可变剪接则被鉴别为影响德保矮马身高矮小的重要因素。此外,在德保矮马和蒙古马幼年至成年的发育阶段的垂体中,CPEB1、TCF12、CCDC28B、KIT、FAM129A、PTPRF、EPHA5、OGDH、USP28、EMID1、ANKHD1、KIDINS220和INF2共13种发生差异可变剪接的基因也被筛选作为马矮小性状的候选基因。上述矮小相关基因为进一步靶向马体高的分子育种提供了基础资料。

• TNF-α在牦牛卵母细胞及早期体外受精胚胎中的表达

  许涛, 潘阳阳, 何翃闳, 李谷月, 陈平, 温泽星, 崔燕, 余四九

  肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α)是一种促炎性辅助性T细胞(helper T cell, Th1)因子,能参与调节哺乳动物的排卵、胚胎发育和附植等生殖过程。本研究旨在通过检测TNF-α在牦牛(Bos grunniens)卵母细胞成熟及早期体外受精(in vitro fertilization, IVF)胚胎发育过程中的表达,探讨TNF-α在卵母细胞成熟与体外受精胚胎发育过程中的作用。本研究收集牦牛卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs),在体外进行成熟培养并受精,获得体外受精胚胎,并评估植入前各时期胚胎的发育能力。采用qRT-PCR、间接免疫荧光染色、Western blot等方法从基因和蛋白水平检测TNF-α在未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞和植入前各时期胚胎中的表达与分布。结果表明：(1) 2~4细胞胚胎、5~8细胞胚胎和桑椹胚的发育率分别为(61.59±0.31)%、(53.76±0.22)%和(26.88±0.32)%,囊胚率为(16.12±0.23)%;(2) qRT-PCR结果表明,未成熟COCs、成熟COCs、桑椹胚和囊胚均可检测到TNF-α基因的表达,其相对表达水平由高到低依次为成熟COCs、未成熟COCs、囊胚和桑椹胚,2~4细胞胚胎和5~8细胞胚胎无表达;(3) Western blot结果显示,TNF-α蛋白相对表达水平由高到低依次为成熟COCs、未成熟COCs、囊胚和桑椹胚,2~4细胞胚胎和5~8细胞胚胎无表达;免疫荧光染色结果显示,TNF-α蛋白主要分布在COCs、桑椹胚和囊胚的细胞质中,在细胞核中表达较弱。本研究表明,TNF-α可能在牦牛卵母细胞的成熟、受精和胚胎发育过程中发挥作用,也可能参与囊胚的细胞凋亡和附植过程。本研究为揭示TNF-α在牦牛生殖过程中的作用机制提供了理论依据。

• 基于600K SNP芯片技术对宁海黄鸡和广西黄鸡生长及屠体性状的全基因组关联分析

  谭雨革, 曹海月, 董信阳, 毛海光, 卢磊, 姜俊保, 马有智, 尹兆正

  全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)是一种在基因组水平上进行复杂性状功能基因鉴定的分析策略,已成为发掘畜禽重要经济性状候选基因的重要手段。本研究利用高密度(600K) SNP芯片,通过一般线性模型对宁海黄鸡(Gallus gallus domesticus)和广西黄鸡两个地方品种的生长和屠体性状进行了GWAS。结果显示,这两个品种鸡3、5、8和11号染色体上的4个SNP位点(rs313150871, rs314661053, rs313314400和rs314694861)及2、5、9号染色体上的3个SNP位点(rs313989383, rs317888074和rs313384732)分别与其生长性状和屠体性状显著相关(P<0.05)。其中,在5号染色体上11.80 Mb区间的1个SNP位点(rs317888074)与半净膛重和全净膛重显著相关(P<0.05),8.98~11.80 Mb之间的1个区间与0周龄重、半净膛重和全净膛重显著相关(P<0.05)。本研究初步筛选出了与宁海黄鸡和广西黄鸡生长性状相关的4个候选基因：肾上腺髓质素(adrenomedullin, ADM)、ATP/GTP结合蛋白样4 (ATP/GTP binding protein like 4, AGBL4)、激活信号协整器1复合体亚基3 (activating signal cointegrator 1 complex subunit3, ASCC3)和Wilms肿瘤1互作蛋白(wilms tumor 1 interacting protein, WTIP)基因,以及与屠体性状相关的3个候选基因：磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶催化亚基2型α (phosphatidylinositol-4-phosphate 3-kinase catalytic subunit type 2 alpha, PIK3C2A)、丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶13 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13, MAP3K13)和LOC10174362(未表征的基因),为深入揭示性状遗传效应及标记辅助选种提供了理论依据。

• 精胺对雌鹅十二指肠多胺代谢关键基因表达及多胺含量的影响

  杜菲, 易治鑫, 于海莹, 张燕, 李慧敏, 杨莉, 王钰曾, 姜冬梅, 康波

  精胺是细胞增殖和分化的必需因子之一,不仅参与调节肠道上皮细胞增殖与凋亡、促进肠道发育,还参与调控肠道消化与吸收功能。为研究外源性精胺对四川白鹅(Anser cygnoides)雌鹅十二指肠多胺代谢的影响,按照鹅体重灌胃5和10 mg/kg精胺,应用qRT-PCR和高效液相色谱技术检测雌鹅十二指肠多胺代谢关键基因表达量及多胺含量。结果表明,5 mg/kg精胺灌胃组雌鹅十二指肠组织鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制剂(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor, AZIN) 1、鸟氨酸脱羧酶抗酶1 (ornithine decarboxylase antizyme 1, OAZ1)、精胺合成酶(spermine synthase, SPMS)、亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶(spermidine/spermine-N1-acetyltransferase, SSAT)和乙酰多胺氧化酶(acetyl-polyamine oxidase, APAO)基因表达量均显著高于对照组(P<0.05);AZIN2基因表达量显著低于对照组(P<0.05);10 mg/kg精胺灌胃组雌鹅十二指肠AZIN1、OAZ1、鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase, ODC)、亚精胺合成酶(spermidine synthase, SPDS)和SSAT的基因表达量均显著高于对照组(P<0.05)。5 mg/kg精胺灌胃组雌鹅十二指肠亚精胺(65.08 vs 41.84 mg/kg)和精胺(255.79 vs 218.84 mg/kg)含量显著高于对照组(P<0.05);10 mg/kg精胺灌胃组雌鹅十二指肠亚精胺(56.20 vs 41.84 mg/kg)含量显著高于对照组(P<0.05);而精胺(188.34 vs 218.84 mg/kg)含量显著低于对照组(P<0.05)。综上所述,外源性精胺灌胃可通过介导多胺代谢关键酶基因表达而影响雌鹅十二指肠组织中亚精胺和精胺含量,对腐胺含量无显著影响。本研究揭示了外源性精胺对雌鹅十二指肠多胺代谢关键基因表达及多胺含量的影响,为精胺调控家禽消化与吸收的相关研究提供了基础数据,并可为开发新型功能性饲料提供新途径。

• 白羽王鸽促卵泡素受体基因多态性与产蛋量关联分析

  毛月姣, 李国勤, 陈晓燕, 李高楼, 温积辉, 陶争荣, 李海英, 卢立志

  促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor, FSHR)具有介导生物大分子促卵泡激素的生理功能,对动物的繁殖性状有着重要的影响。为了分析白羽王鸽(Columba livia) FSHR基因单核苷酸多态性(SNPs)与产蛋量的相关性,本研究以白羽王鸽209羽为研究对象,采用PCR产物直接测序方法进行FSHR基因外显子6、外显子9、外显子10及相邻上下游序列SNPs的筛选,并分析基因型与产蛋量相关性。结果显示,检测的3个片段中共发现18个突变位点,并发生氨基酸的改变。其中外显子6及其上下游序列中发现3个突变位点：G67729A、A67801G、A67898G;外显子9及其上下游序列中发现5个突变位点：C76462T、T76468C、G76527T、C76616T、T76651G;外显子10中发现10个突变位点：A82714G、C82930T、A83083C、G83098T、G83158A、C83200T、A83246C、T83395C、T83740C、C83766T。其中T76468C和C83 766T具有两种基因型AA、AB,其余均具有3种基因型：AA、AB、BB。对18个位点进行了Hardy-Weinberg平衡检验,发现除C76616T位点外其余位点均处于平衡状态。多态位点与平均产蛋量关联分析显示,A67801G位点纯合子BB基因型与产蛋量相关极显著(P<0.01),C76616T位点纯合子BB基因型与产蛋量显著相关(P<0.05)。因此FSHR基因中A67801G和C76616T位点可作为白羽王鸽产蛋量性状选育的候选分子标记位点。本研究为更好的提高肉鸽群体繁殖性能、缩短育种年限,从分子水平上为标记辅助育种提供一定的理论依据。

• 纳米氢氧化镁对茶叶黑斑病原真菌活性的抑制效应研究

  陈蓉, 邱赛飞, 游雨欣, 谢勇啸, 聂丹玥, 李嘉欣, 王财成, 关雄, 潘晓鸿

  茶叶真菌病害是引起茶叶减产的重要原因之一,纳米材料作为环境友好型抗菌材料可应用于抑制茶叶真菌病害。本研究通过共沉淀法合成纳米氢氧化镁(nano-Mg(OH)2),研究其抑制茶叶黑斑病原真菌的效果。采用X-射线粉末衍(X-ray powder diffraction, XRD)表征nano-Mg(OH)2的尺寸,通过谢乐公式计算得出合成的纳米颗粒在(101)面的尺寸为14.5 nm。利用扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)对nano-Mg(OH)2的形貌进行观察,发现纳米颗粒结构呈规则的片状。对茶叶黑斑病原真菌进行分离纯化,通过形态学观测、核糖体DNA内转录间区(internal transcribed spacer, ITS)序列分析、ITS区特异性引物PCR检测和系统发育关系比较,确定分离的病原菌为芒果球座菌(Guignardia mangiferae),茶叶上此类真菌的报道较少。采用平板涂布的方法,以空白对照和阳性对照(碱性条件)为对照组,以不同浓度nano-Mg(OH)2为实验组,经培养一段时间后通过十字交叉法测量真菌生长直径并计算抑制率。结果表明,nano-Mg(OH)2能有效的抑制茶叶真菌的生长,5 mg/mL nano-Mg(OH)2在3 d时对菌丝生长抑制率可达48.78%,随着浓度增加效果更为显著,50 mg/mL nano-Mg(OH)2对菌丝生长有100%的抑制率,半最大效应浓度(half maximal effective concentration, EC50)为7.63 mg/mL。研究结果可为后续研发安全、有效的纳米制剂提供科学依据和技术支持。

• 菰黑粉菌UeCS3.1基因的克隆及功能研究

  吴敏, 张雅芬, 夏文强, 胡鹏, 陈玥, 俞晓平, 叶子弘

  菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一种典型的二态性真菌,与菰(Zizania latifolia)互作诱导其茎部膨大,形成可食用的肉质茎—茭白,成为我国传统的水生蔬菜。几丁质(chitin)是真菌细胞壁的重要组成成分,其合成过程涉及7类几丁质合成酶(chitin synthase, CS)基因,参与调控真菌的生长发育及致病性。有研究报道,第3类几丁质合成酶对部分丝状真菌的菌丝生长和致病性起着关键作用。本研究基于菰黑粉菌的全基因组序列,克隆得到了菰黑粉菌第3类几丁质合成酶基因(UeCS3.1) (GenBank No. KU302676),该基因序列全长3 054 bp,含有1个内含子。ORF编码框为2 751 bp,编码916个氨基酸。UeCS3.1具有2个催化结构域Chitin-synth-1 (pfam01644)、Chitin-synth-1N (pfam08407)和7个跨膜区,进化树分析表明UeCS3.1与玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)的Umchs1近源。表达模式分析发现,UeCS3.1在菰黑粉菌芽殖以及菌丝融合生长过程中均上调表达,而且UeCS3.1缺失突变体的菌丝融合生长能力明显减弱。以上结果表明,UeCS3.1基因可能在菌丝融合生长过程中起着关键作用。本研究初步探究了菰黑粉菌第3类几丁质合成酶基因在菌丝融合生长过程中的作用,为菰黑粉菌的致病机理研究提供基础材料。

• PPRV武威分离株N基因的原核表达及免疫原性分析

  王雯, 包世俊, 邢小勇, 胡荣斌, 丁小琴, 伏小平, 薛慧文

  小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起的一种急性传染病,严重危害世界养羊业的健康发展。2013年以来,国内多地出现小反刍兽疫疫情,给我国养羊业造成了重大经济损失。本研究根据小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株N基因核苷酸序列(GenBank No. HQ197753)设计特异性引物,扩增获得PPRV武威分离株N基因全序列(GenBank No. KY429031),在序列分析的基础上,构建该基因的原核表达载体pET-PPRV-N,并将其转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3)后诱导表达。纯化表达产物,免疫Balb/C小鼠(Mus musculus)制备多克隆抗体,进而应用ELISA、Western blot和免疫荧光检测(immunological fluorescence assay, IFA)对PPRV N蛋白的免疫原性进行分析。结果表明,PPRV武威分离株属于Ⅳ系,且其N基因全序列与国内24株PPRV分离株及2016蒙古株的同源性高达99.0 %;重组蛋白His-PPRV-N在大肠杆菌Rosetta (DE3)中成功获得表达,其相对分子质量约为57.8 kD,且主要以可溶性形式存在;ELISA、Western blot及IFA结果显示,重组蛋白小鼠多抗ELISA效价可达1∶64 000,可与PPRV疫苗株或武威分离株的N蛋白特异性结合,且制备的多抗显示出对PPRV明显的中和作用,表明了重组蛋白良好的免疫原性。本研究结果为PPRV检测方法的建立和N蛋白生物学功能的进一步研究提供了基础资料。

• 哺乳动物染色质三维结构单元的特征及其相互关系

  罗扶农, 何梦楠, 唐茜子, 李严, 李明洲, 金龙

  哺乳动物细胞核中,染色质通过折叠组装形成各种染色质三维结构单元,例如染色体疆域、染色质区室、拓扑关联结构域和染色质环等,它们在基因表达调控、细胞分化与疾病发生等过程中发挥着重要作用。早期研究表明,这些结构单元分别代表染色质不同层级的三维构象,在哺乳动物细胞核中层级分布。近年来,随着染色质构象捕获新技术的不断发展和研究的不断深入,发现这些结构单元在细胞核中并非是单纯的层级结构。本文归纳了近年来发展出的染色质构象捕获技术,详细介绍了不同染色质三维结构单元的特征及功能,并重点阐述了染色质三维结构单元间的相互关系。本文为后续研究提供有价值的参考。

• 茭白人工孕茭体系的建立及优化

  殷淯梅, 张雅芬, 曹乾超, 胡鹏, 夏文强, 崔海峰, 俞晓平, 叶子弘

  茭白是由活体营养型真菌—菰黑粉菌(Ustilago esculenta)侵染菰(Zizania latifolia)后,在菰茎部形成的可食用肉质茎,已成为我国第二大水生蔬菜。传统的茭白种植及育种途径人力、物力投入较大,田间种植的正常茭白常出现品种的退化,还容易产生灰茭和雄茭,严重影响茭白种植的收益。本研究建立并优化了菰黑粉菌人工接种体系,即在25 ℃光照12 h,22 ℃黑暗12 h的温室环境中,以薹管萌发10~20 d的野生菰幼苗茎基部用OD600值为2.0的菰黑粉菌性亲和单倍体菌株UET1和UET2混合菌液注射,孕茭率达到80%以上。进一步通过转录组数据分析筛选出与灰茭中冬孢子发育的干扰因子基因(interfered factors in teliospores development, Itd1) (GenBank No. MK164419),通过同源重组的方法对菰黑粉菌单倍体菌株UET1和UET2进行基因敲除,获得1对冬孢子发育的干扰因子基因缺失菌株UET1ΔItd1 (CGMCC No.16723)和UET2ΔItd1 (CGMCC No.16724),利用优化的人工接种技术侵染野生菰幼苗,获得了可以孕出正常茭白的植株。以上工作可以提供一种新的高效稳定的茭白育种途径,为实现茭白的人工育种提供可靠的理论及技术基础;同时对后续深入研究菰黑粉菌的二型态转换、菌丝生长或冬孢子形成提供理论基础。

• 辽宁省部分地区对鳞翅目害虫高毒力的苏云金芽胞杆菌菌株的分离与筛选

  倪鹤嘉, 程雪, 王静, 高泽平, 魏盼盼, 谭佳丽, 孙敬, 李海涛, 高继国

  鳞翅目害虫每年对农业生产造成巨大损失,化学农药的长期施用对生态环境造成严重破坏。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)以其杀虫活性高,对环境友好等优点成为应用最为广泛的微生物杀虫剂。本研究拟对辽宁省苏云金芽胞杆菌的分布和基因多样性进行研究,了解其分布特点,发掘新型Bt资源,筛选出对鳞翅目害虫有高活性的菌株。利用温度筛选法从土壤中分离得到野生Bt菌株,利用限制性片段长度多态性PCR方法(restriction fragment length polymorphism PCR, PCR-RFLP)分析其基因型,利用SDS-PAGE对其杀虫晶体蛋白进行分析,并测定分离菌株对鳞翅目5种害虫的杀虫活性。从辽宁省不同地区收集不同类型的土壤524份,共分离出66株野生Bt菌株,出菌率为12.6%。晶体形状呈现出菱形、球形、短双锥、不规则形等形状。分离株多含有cry1、cry2及cry8基因,表达约130、90和60 kD的蛋白。杀虫毒力检测表明,菌株DD229、DD214-2、YK524和YK540对鳞翅目害虫具有较高活性。辽宁省地区苏云金芽胞杆菌分布广泛、资源丰富,获得4株对鳞翅目害虫杀虫活性较高菌株,具有良好的研究和应用价值。