农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2024年第4期

• 阿魏酸合成相关基因ZlALDH2C4克隆及其在菰茎部膨大发育中的响应

  柳菁溪, 夏淑倩, 戚晓清, 钱致远, 马莹然, 汤近天, 夏文强, 张雅芬, 叶子弘, 崔海峰

  阿魏酸是由松柏醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase family 2 member C4, ALDH2C4)催化产生的木质素单体合成的重要代谢成分,参与植物细胞响应病原真菌侵染的防卫,在植物细胞次生壁形成及木质化分化中具有重要调控作用。本研究从菰(Zizania latifolia)植株中克隆获得松柏醛脱氢酶相关基因ZlALDH2C4 (GenBank No. OQ552555),cDNA序列全长1 527 bp,具有1个PLN02766的松柏醛脱氢酶结构域,系统进化树分析表明,ZlALDH2C4与粳稻(Oryza sativa ssp. japonica)同源蛋白OsALDH2C4遗传距离较近。荧光定量PCR分析表明,茎部ZlALDH2C4表达受菰黑粉菌(Ustilago esculenta)侵染诱导显著上调,并在菰植株木质化程度高的组织部位表达量较高。基于正常茭白植株膨大肉质茎不同节位细胞的亚显微观察及茎部膨大发育期间ZlALDH2C4的时空表达分析发现,茎部ZlALDH2C4表达量与其木质化程度基本呈正相关,木质化程度较低的膨大起始及膨大发育初期茎部ZlALDH2C4表达量较低,膨大发育后期茎部细胞木质化程度增强伴随着ZlALDH2C4表达显著升高(P<0.05);在膨大肉质茎的不同节位中,细胞次生壁较厚的下部节位中ZlALDH2C4表达显著高于细胞次生壁较薄的上部节位(P<0.05)。上述结果表明,ZlALDH2C4与菰植株茎部细胞次生壁形成调节密切相关,能够响应菰黑粉菌侵染诱导,并参与菰植株茎部细胞木质化分化调控。本研究为菰黑粉菌侵染诱导菰植株茎部膨大发育的调控机制研究提供理论参考。

• 转录组分析调控桃采后冷害和硬度的候选主效基因

  张志刚, 陈玉峰, 王长江, 徐晋, 姜延伟, 郑亚琴, 刘振宁, 陈守兵, 刘一华, 徐蒙

  冷敏性果实采后低温贮藏容易造成果实冷害,程序性降温(low-temperature conditioning, LTC)处理在减缓桃(Prunus persica)等冷敏性果实冷害中具有显著效果,但是贮藏前期果实会发生轻微软化。本研究通过加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)发现了与冷害和硬度表型高度相关的基因模块。分别对模块基因进行主效转录因子鉴定和调控网络构建,发现桃WRKY转录因子PpWRKY43和生长素响应因子(auxin response factor, ARF) PpARF1可能通过调控冷调节蛋白(cold-regulated protein, COR) PpCOR413-2和脂氧合酶 (lipoxygenase 5, LOX5) PpLOX5参与果实采后冷害调控,NAC转录因子PpNAC5可能通过调控桃果胶裂解酶2 (P. persica pectate lyase 2, PpePL2)参与桃果实采后软化。本研究结果为桃果实采后保鲜减损研究提供基础资料。

• 葡萄扩展蛋白家族全基因组分析及VvEXPA27功能研究

  张建鹏, 尚霄丽

  果粒大小是决定葡萄(Vitis vinifera)外观品质与产量的重要因素之一,细胞膨大对于决定葡萄果实最终大小至关重要。扩展蛋白(expansin, EXP)是细胞壁松弛蛋白,通过破坏细胞壁中纤维素微纤维和相关基质多糖之间的非共价键促进细胞膨大。本研究以'黑比诺PN40024'基因组为参考,基于Pfam数据库采用HMMER对葡萄扩展蛋白家族成员进行全基因组鉴定,剔除冗余序列后,共筛到31个成员。通过生物信息学分析筛选到两个候选基因VvEXPA06和VvEXPA27。RT-qPCR结果显示,VvEXPA06仅在花后20 d上调表达,VvEXPA27在花后20和48 d均上调表达。将VvEXPA27进行拟南芥(Arabidopsis thaliana)异源表达,并对其转基因植株进行功能验证。结果表明,与对照组相比,过表达VvEXPA27的T3代纯合转基因拟南芥的第3片叶的细胞面积、果荚长度和莲座叶直径均明显增加,表明VvEXPA27在细胞膨大过程中起到积极的作用。本研究为解析葡萄果实细胞膨大的分子机制提供理论参考,为其分子育种提供基因资源。

• 乌蒙宽叶杜鹃耐寒相关基因MYBS3和RCI2B的克隆及表达分析

  彭万明, 谭弋, 张晓丽, 罗亮, 李新艺, 黄海泉, 黄美娟

  乌蒙宽叶杜鹃(Rhododendron sphaeroblastum var. wumengense)是高海拔耐寒植物,基于课题组前期从其转录组中筛选,发现MYBS3和稀有冷诱导2 (rare cold inducible 2, RCI2)基因在增强植物耐冷胁迫中作用显著。本研究克隆出2个乌蒙宽叶杜鹃中调控耐寒的关键转录因子基因,分别命名为RsMYBS3 (GenBank No. OR178946)和RsRCI2B (GenBank No. OR178945),其cDNA全长分别为795和165 bp,分别编码氨基酸数量为264和54 aa。生物信息学分析表明,RsMYBS3为亲水性不稳定蛋白,具有SANT超家族典型的SANT保守结构域;RsRCI2B为疏水性稳定蛋白,具有RCI2基因家族典型的PMP3高度保守结构域。基因同源性比对结果显示,RsMYBS3和RsRCI2B蛋白均与红马银花(Rhododendron vialii)中的MYBS3和RCI2B蛋白同源性较高,分别为93.73%和94.44%;系统进化分析发现,RsMYBS3和RsRCI2B均与红马银花RvMYBS3和RvRCI2B聚为一支,推测四者为直系同源关系。qPCR分析表明,低温胁迫下,2个基因在乌蒙宽叶杜鹃中均有显著表达,但在不同胁迫温度和时间下表达模式不同,其中RsMYBS3基因在-6 ℃处理1 d时表达量最高,随着胁迫时间延长,4 d时表达逐渐下调,7 d表达又逐渐上升;在-12 ℃处理1~4 d时表达量逐渐上升并达到峰值,7 d时表达逐渐下调;而RsRCI2B基因在-6 ℃处理1~7 d时表达均逐渐上升,在-12 ℃处理下除1 d时表达略有下调外,随着胁迫时间延长,4~7 d时表达量逐渐上升并达到峰值。上述结果推测,RsMYBS3和RsRCI2B基因可能参与了乌蒙宽叶杜鹃的耐寒响应生理过程。本研究为后续进一步探讨其耐寒分子机制提供了基础数据和理论依据。

• 牦牛妊娠早、中期胎盘组织中STAB1的表达、分布及功能分析

  魏倩倩, 张全伟, 张博皓, 白旭, 赵兴绪, 张勇

  哺乳动物胎盘发育对子宫内环境调节及妊娠维持至关重要。胎盘发育不良或异常可引发多种妊娠疾病。稳定素蛋白-1 (stabilin-1, STAB1)参与调节动物多个器官发育,但在牦牛(Bos grunniens)胎盘中的作用及调节机制尚不完全清楚。本研究旨在探究牦牛妊娠早、中期胎盘组织中STAB1分布、表达规律及其潜在功能。采集牦牛妊娠早、中期胎盘组织,通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色、免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色、免疫荧光(immunofluorescence, IF)染色、qRT-PCR和Western blot研究牦牛妊娠早、中期胎盘组织中STAB1表达特点及分布规律;利用数据非依赖性模式(data-independent acquisition, DIA)蛋白质组学数据,预测分析牦牛胎盘中STAB1互作蛋白及潜在生物学功能。结果表明,STAB1蛋白主要定位于牦牛胎盘滋养层巨细胞和单核滋养层细胞胞质;与妊娠早期胎盘相比,牦牛妊娠中期胎盘组织中STAB1基因及蛋白表达显著下调(P<0.05);生物信息学分析显示,STAB1可能通过细胞黏附、钙离子结合和质膜组成等途径调控牦牛妊娠早、中期胎盘动态发育。综上,STAB1通过调节牦牛胎盘滋养层细胞的功能参与妊娠早、中期胎盘发育和妊娠维持。本研究为STAB1在牦牛胎盘发育中的功能及机制提供参考。

• 猪SCD1和SCD5双基因敲除细胞系的构建及其对脂肪沉积的影响

  方钱海, 郭帅, 任红艳, 白文哲, 高斯, 刘雯雯, 陈洪波, 张立苹

  脂肪沉积及脂肪酸组成对猪肉品质具有决定性影响,硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase, SCD)对脂肪酸组成及代谢具有重要的调控作用。目前SCD1和SCD5是包括人类(Homo sapiens)在内的多种脊椎动物中仅有的两种SCD亚型,为明确SCD1和SCD5对猪(Sus scrofa)脂肪酸种类与组成的影响及其作用机制,本研究利用单single guide RNA (sgRNA)和双sgRNA相结合介导的CRISPR/Cas9技术对SCD1及SCD5基因进行定点敲除,筛选获得纯合缺失单克隆细胞系,对其进行脂肪酸含量的检测分析,并检测双基因缺失对脂肪沉积和脂质代谢的影响。结果显示,SCD1及SCD5双基因编辑效率超过70%;SCD1及SCD5双基因缺失降低了其介导的限速反应产物棕榈油酸(C16∶1)和油酸(C18∶1)的相对含量;同时,细胞中多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)的含量显著提高。SCD1和SCD5的缺失还影响了芥酸(C22∶1n9)、二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid, DPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)、二十碳五稀酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和亚油酸(C18∶2n6)等脂肪酸的含量;SCD1和SCD5整体缺失后甘油三酯的含量显著降低,影响了脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)、酰基辅酶A合成酶3 (acyl-CoA synthetase long-chain family member 3, ACSL3)等与脂肪酸和脂质代谢相关蛋白的表达。结果表明,SCD对脂肪酸的组成及代谢和脂肪沉积具有重要的调控作用。本研究为猪肉品质改良及肥胖疾病研究提供了细胞模型和参考。

• 全基因组eQTL揭示猪11号染色体肉质性状新候选位点

  郑韵頔, 冉雪琴, 牛熙, 黄世会, 李升, 王嘉福

  全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)挖掘了大量猪肉肉质性状关联的遗传变异,但是多数变异的调控机制未知。遗传变异主要通过调控基因表达水平影响复杂性状,通过定位表达数量性状位点(expression quantitative trait locus, eQTL)鉴定基因表达水平相关的遗传变异,有助于阐释变异位点与性状之间的关联。为筛选肉质性状候选基因与位点,本研究以F2代的19个杂交香猪(Sus scrofa)(大白猪♂×从江香猪♀)个体为试验材料,使用全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)和背最长肌组织的RNA-seq数据进行全基因组eQTL分析,在11号染色体上共检测到1 332个cis-eQTLs (PFDR<0.01)和18 078个trans-eQTLs (PFDR<1E-12)。对cis-eQTL关联中的eSNP (eQTL-associated SNP)位点进行注释筛选,使用PCR-限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)和Sanger测序鉴定了1个位于肉质性状候选eGene (eQTL-associated gene)—线粒体中间肽酶基因(mitochondrial intermediate peptidase, MIPEP) 5'UTR的eSNP位点rs319855910 c.-46C>G,与MIPEP基因表达水平显著相关(PFDR=8.81E-03)。RNA-seq统计分析发现,rs319855910不同基因型显著影响MIPEP基因表达(P<0.05)。当rs319855910基因型由野生型(CC)突变为纯合突变型(GG)时,MIPEP基因的表达水平显著下调(P<0.05)。进一步分析发现,rs319855910位于转录因子结合序列区域,导致MIPEP基因5'UTR序列结合的转录因子种类和数量发生改变。上述结果表明,rs319855910是一个新的猪肉肉质性状候选位点,能够通过转录因子的结合而调节MIPEP基因表达,从而影响猪的肉质性状。本研究为猪种选育和遗传改良提供基础资料。

• DLD和NDUFA9及其巴豆酰化促进仔猪原代皮下白脂棕色化

  刘月霞, 刘尊海, 梁君桐, 陈齐, 陈欣豪, 左云非, 孙超

  二氢硫辛酸脱氢酶(dihydrolipoyl dehydrogenase, Dld)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)脱氢酶[泛醌] 1 α亚复合体亚基9 (NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9, Ndufa9)基因均与能量代谢和线粒体功能相关,提示Dld和Ndufa9与白脂棕色化可能存在内在联系。本研究以仔猪原代皮下白色脂肪细胞为研究对象,诱导其分化为成熟脂肪细胞。分别使用Dld与Ndufa9干扰片段和过表达载体处理成熟脂肪细胞后,利用实时定量PCR (real-time quantitative PCR, qPCR)和Western blot检测脂质代谢相关基因表达水平,结果显示,过表达Dld与Ndufa9后,脂合成相关基因脂肪酸结合蛋白4 (fatty acid binding protein 4, Fabp4)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, Fasn)显著降低(P<0.05),脂解相关基因脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase, Atgl)和激素敏感脂肪酶(hormone sensitivelipase, Hsl)、白脂棕色化相关基因过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha, Pgc-1α)和含PR结构域的锌指蛋白16 (PR domain containing 16, Prdm16)、产热相关基因解耦蛋白2 (uncoupling protein 2, Ucp2)、骨形态发生蛋白4 (bone morphogenetic proteins 4, Bmp4)、Bmp7和诱导细胞死亡的DNA片段化因子α样效应因子A (cell death-inducing DNA fragmentation factor α-like effector A, Cidea)均显著上调(P<0.05),表明Dld与Ndufa9均促进仔猪皮下白色脂肪细胞发生棕色化。使用伏立诺他(vorinostat, SAHA)和巴豆酸钠(NaCr)处理成熟脂肪细胞。发现DLD和NDUFA9巴豆酰化同样促进仔猪皮下白色脂肪细胞棕色化。通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)检测发现DLD和NDUFA9结合。以上结果提示,DLD和NDUFA9及其巴豆酰化修饰促进仔猪原代皮下白脂棕色化,也表明Dld和Ndufa9是调控猪脂质代谢的关键因子。本研究为进一步探究猪肉品质改良提供理论依据。

• 香苏杂交猪ARHGAP24基因SNP检测及生长性状关联分析

  蒋传美, 阮涌, 李吉凤, 肖美美, 许家利, 黄家锦, 许厚强

  RhoGTP酶激活蛋白24 (Rho GTPase activating protein 24, ARHGAP24)基因与肌动蛋白重塑、细胞极性控制和细胞迁移密切相关,本研究旨在探究ARHGAP24基因多态性与香苏杂交猪(Sus scrofa)生长性状的关系,以便为后期继续研究香苏杂交猪分子选育工作提供理论参考。本研究采集164头相同饲养条件下的香苏杂交猪血液DNA,通过PCR扩增、测序,确定ARHGAP24基因SNP位点。利用SPSS 25.0软件中的一般线性模型对ARHGAP24基因SNP位点与香苏杂交猪生长性状进行关联分析。结果显示,在香苏杂交猪9个外显子中共检测出5个SNP位点,分别位于外显子1和外显子8。g.735024 A>G非同义突变导致mRNA上第455位缬氨酸变为天冬氨酸,对mRNA结构影响不明显,但导致蛋白质二级结构中α-螺旋以及无规则卷曲所占百分比上升,β-转角和延伸链降低;g.735242 A>C位点非同义突变后导致第528位缬氨酸变为丝氨酸,从而导致mRNA结构产生明显变化,而对蛋白质的二级结构影响则不明显,只是使各结构所占比例发生了轻微的波动。关联结果分析显示,g.735313 C>T位点对胸围有极显著影响(P<0.01),对腹围有显著影响(P<0.05)。对5个SNPs位点进行连锁不平衡分析,共检测到5种单倍型,15种双倍型。香苏杂交猪ARHGAP24基因中g.735313 C>T位点与香苏杂交猪胸围和腹围均存在显著关联,呈中度多态且处于Hardy-Weinberg平衡状态,可作为后期香苏杂交猪遗传标记分子育种候选位点。

• 菰黑粉菌UePkc1克隆及其在菌丝生长与被侵染菰中的表达分析

  戚晓清, 周雅萍, 柳菁溪, 郑宇捷, 尚袁媛, 汤近天, 夏文强, 张雅芬, 叶子弘, 崔海峰

  菰黑粉菌(Ustilago esculenta)侵染菰(Zizania latifolia)植株后能够诱导其茎部膨大发育形成可食用肉质茎,菰黑粉菌菌丝生长及其对环境因子的响应对菰植株茎部膨大发育具有重要调控作用。蛋白激酶C1 (protein kinase C1, Pkc1)是真菌调控细胞极性生长和应答刺激反馈的重要调节因子。本研究克隆获得菰黑粉菌UePkc1基因(GenBank No. OQ572333),cDNA全长3 573 bp,可编码1 190个氨基酸,具有PKC蛋白的STKc_PKC保守结构域;分别采用3种细胞壁干扰剂(刚果红, 荧光增白剂和十二烷基硫酸钠)及2个温度(15 ℃及35 ℃)处理体外培养的菰黑粉菌,显微观察发现,细胞壁干扰剂及高温处理均导致菰黑粉菌担孢子细胞肿胀缩短,而低温处理的菰黑粉菌担孢子细胞较为细长;细胞壁干扰剂处理后菰黑粉菌融合菌丝长度缩短,而2个温度处理组均未见融合菌丝生成。qPCR分析表明,细胞壁干扰剂处理48 h菰黑粉菌中UePkc1表达显著升高(P<0.05),低温处理72 h 菰黑粉菌UePkc1表达显著升高(P<0.05),而高温处理后菰黑粉菌UePkc1表达显著下调(P<0.05)。上述结果初步表明UePkc1基因参与菰黑粉菌细胞壁完整性维持并响应环境温度的调节作用。此外,不同膨大表型植株茎部的菰黑粉菌UePkc1表达存在显著差异,UePkc1在灰茭膨大发育为10 cm时表达量最高,而在正常茭白膨大发育初期时UePkc1表达最高,结合正常茭白与灰茭植株2种膨大表型茎部发育期间菰黑粉菌的生长分布变化,初步阐明菰植株茎部的菰黑粉菌菌丝生长受UePkc1表达调控,其表达可能与植株茎部膨大相关的菌丝量增长呈正相关。本研究为深入研究菰黑粉菌侵染诱导菰植株茎部膨大发育的互作机制提供技术参考及理论依据。

• 贝莱斯芽胞杆菌YFB3-1对辣椒疫霉的抑菌效果及其抑菌物质

  穆晓清, 鲁耀雄, 戴良英, 黄国林, 陈薇, 张榉邺, 韦晨曦

  辣椒疫病是由疫霉菌(Phytophthora capsic)侵染造成辣椒(Capsicum annuum)毁灭性损失的土传病害,严重威胁我国辣椒产业的可持续发展。为了获得安全高效、有效预防辣椒疫病的生防制剂,本研究选取从蚯蚓(Eisenia foetida)肠道细菌中分离鉴定的一株贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis) YFB3-1为生防菌株,以辣椒疫霉菌为靶标菌,通过平板对峙法比较不同种类的芽胞杆菌对辣椒疫霉菌的抑菌效果,及YFB3-1对辣椒不同土传病原真菌的抑菌效果,并分析其主要的抑菌次级代谢物和生防机制。抑菌试验表明,贝莱斯芽胞杆菌YFB3-1对辣椒疫霉菌的抑制效果最好,抑菌率达85.21%,比枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) GCK5-1对辣椒疫霉菌的抑菌率提高了19.8%,对辣椒不同土传病原真菌的抑菌效果较好,具有广谱抗辣椒土传病原真菌的特性。显微镜镜检表明,贝莱斯芽胞杆菌YFB3-1能够导致疫霉菌菌丝生长异常,多分枝或分枝杂乱,菌丝细胞不同程度地扭曲和膨大,甚至细胞壁破裂;液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS)靶向代谢组测定结果显示,贝莱斯芽胞杆菌YFB3-1发酵液中的主要脂肽类化合物为表面活性素(surfactin)和丰原素(fengycin),在发酵3 d达最高含量,分别为1.19×10-3和1.14×10-3 mg/mL。本研究为辣椒疫病的绿色防控提供了优异的生防菌株,为进一步挖掘利用贝莱斯芽胞杆菌的次级代谢物质提供了参考依据。

• 牦牛致病性大肠杆菌生物被膜形成能力及影响因素分析

  高翔, 黎会苹, 郎啸, 贺子文, 王婧虹, 王霞, 宁建刚

  生物被膜广泛存在于自然环境中,作为细菌重要的抗应激机制之一,具有较强的耐药性、致病性及免疫逃逸的功能。为建立牦牛(Bos grunniens)致病性大肠杆菌(Yak pathogenic Escherichia coli, YPEC)生物被膜形成模式菌株,探讨各种外界因子对YPEC生物被膜形成的影响,本研究以YPEC天祝-1、天祝-2、天祝-3、青海-2、青海-3和青海-4分离株为研究对象,通过微孔板定量法鉴定YPEC生物被膜的形成能力,以筛选出生物被膜强菌株作为优势菌株,进而分析生物被膜形成的影响因素。结果表明,YPEC不同分离株形成生物被膜的能力不同,天祝-1株、天祝-2株和天祝-3株均为强生物被膜形成者,青海-3株和青海-4株均为中等生物被膜形成者,青海-2株为弱生物被膜形成者,其中天祝-3株形成生物被膜的能力最强(P<0.05)。当培养时间24 h、温度37 ℃、pH 7.5、起始菌液浓度1.3×109 CFU/mL、10%菌液比例条件下天祝-3株生物被膜形成量最佳;LB培养基中添加20 μg/mL DNA和2%蔗糖均有助于促进生物被膜的形成,而添加不同浓度的NaCl、葡萄糖和乳糖均对生物被膜的形成有抑制作用。本研究为从生物被膜角度开展YPEC防控提供数据支撑和理论依据。

• 细胞泛凋亡的分子组成及作用机制

  王怡茹, 王远, 曹玲霞, 杨洁, 王书敏

  细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)在生物体生长发育以及免疫调节中起重要作用,是先天免疫系统的一道防线。细胞泛凋亡(PANoptosis)作为新的PCD途径,由多蛋白复合物细胞泛凋亡体(PANoptosome)调控,可以同时调控凋亡、坏死性凋亡、焦亡3种细胞程序性死亡的关键模式,从而防御多种病原体的入侵。因此,研究细胞泛凋亡的作用机制,对加深细胞死亡方式的理解、提示炎症以及疾病的发生具有重要意义。本文综述了泛凋亡的概念、作用机制、泛凋亡体的分子组成及组装方式,并提出泛凋亡体的形成是细胞发生泛凋亡的标志。本文为炎症性疾病的治疗提供新思路。

• IL-33/ST2信号通路影响干细胞功能的研究进展

  徐文杰, 华进联

  白细胞介素-33 (interleucin 33, IL-33)是一种兼有促炎与抑炎功能的细胞因子,通过其特异性受体—肿瘤抑制因子2 (suppressor of tumorigenicity 2, ST2)实现信号传导。IL-33/ST2信号通路的激活根据细胞类型的差异,调控NF-κb、TNFα、Wnt等信号通路,进而引发炎症反应以及影响干细胞的干性与分化能力。本文综述了IL-33/ST2信号通路的基本结构与组成,并且概括与之相关的干细胞功能研究的最新进展。本文通过作用机理的阐明为干细胞治疗炎症性疾病与免疫性疾病提供新思路。

• 功能化铁蛋白纳米颗粒疫苗的研究进展

  张荣, 魏彦明, 茹毅

  在众多的纳米载体中,蛋白质纳米颗粒由于其生物相容性及设计的灵活性,是疫苗纳米载体生物技术中的研究热点。与分离的蛋白质亚基相比,蛋白质纳米颗粒疫苗更容易被抗原提呈的树突状细胞吸收。铁蛋白是一种普遍存在的铁储存和解毒蛋白,可以保护细胞免受铁诱导的氧化损伤,化学和热稳定性良好,具有可逆的组装、拆卸及展示抗原的能力。铁蛋白不仅是实用的纳米反应器和纳米载体,也是有效的疫苗开发平台。本文综述了铁蛋白的结构和功能特性、自组装、新的生物工程策略、铁蛋白纳米颗粒的生产、纯化和功能化,并讨论了铁蛋白在疫苗开发领域的应用进展及前景。本文为纳米生物技术在疫苗研制中的应用提供理论支持。

• 双谐振压电细胞术在水稻品种耐盐性评估中的应用

  杨厚鹏, 周铁安, 潘炜松, 肖应辉

  水稻(Oryza sativa)品种选育和抗逆(耐盐性)检测通常以受试植株为对象,不仅费力、耗时和具有破坏性,而且结果易受环境因素影响,极大限制了选育的效率和可靠性。本研究旨在以水稻活细胞为表征对象,建立基于双谐振压电细胞术(double resonator piezoelectric cytometry, DRPC)和细胞力学测试的水稻品种耐盐性评估新方法。首先选取已知强耐盐性的'海稻86'和盐敏感的'日本晴'水稻品种,制备其粘附细胞培养体系,进而采用DRPC测定细胞所产生的表面应力(cell-generated surface stress, ΔS)与细胞粘弹性指数(cell viscoelastic index, CVI)对不同浓度NaCl胁迫作用的响应及变化规律。结果表明,'日本晴'水稻细胞在20和40 mmol/L NaCl条件下,其ΔS先降后升,在60~120 mmol/L NaCl条件下单调下降;同时,细胞在20和40 mmol/L NaCl条件下先变软再变硬,在60~120 mmol/L NaCl条件下单调变软,在40 mmol/L NaCl条件下达到抵御盐胁迫的极限。'海稻86'细胞在20 mmol/L NaCl条件下,其ΔS先降后升,在40和60 mmol/L NaCl条件下先升后降,在80和100 mmol/L NaCl条件下呈现上下波动,在120 mmol/L NaCl条件下骤升;同时,细胞在20、80和100 mmol/L NaCl条件下变硬,在40、60和120 mmol/L NaCl条件下先变硬后变软,在100 mmol/L NaCl条件下达到抵御盐胁迫的极限。综合比较2个品种的细胞在不同浓度NaCl胁迫下所产生的表面应力和细胞粘弹性指数变化规律,可以确定'海稻86'的耐盐性高于'日本晴',这与大田植株水平报道的'海稻86'耐盐性高于'日本晴'的结果一致。因此,本研究不仅证实了双谐振压电细胞术用于水稻品种耐盐性评估的准确性和可靠性,也为广泛应用这一新方法高效评估作物抗逆性提供了重要参考依据,对作物非生物胁迫抗性育种具有重要的意义。

• 杜鹃兰qRT-PCR内参基因的筛选及稳定性评价

  张玉琎, 吉军, 肖鑫, 张静怡, 王利琴, 高燕燕, 田宇航, 张明生

  杜鹃兰(Cremastra appendiculata)为兰科珍稀药用植物,因其具有较高的药用价值而获得广泛关注。由于存在严重的繁殖障碍,加之人类的掠夺式采挖,导致其资源濒临枯竭,利用现代生物分子技术解决杜鹃兰物种繁殖困难的问题是资源保护的有效途径之一。本研究以杜鹃兰不同器官(根, 茎和叶)和不同萌发阶段的种子(共生萌发和非共生萌发种子)为材料,采用qRT-PCR技术检测肌动蛋白(β-actin, ACT)、翻译延伸因子(translation elongation factor 1 beta, ef-1β)、亲环蛋白(cyclophilin, CYP)、核糖体蛋白(ribosomal protein, RPL)、核糖体蛋白S8 (ribosomal protein S8, RPS)、泛素C (ubiquitin C, UBC)、微管蛋白(α-tubulin, TUB)共计7个常用管家基因的表达情况,并结合geNorm、NormFinder和BestKeeper软件对候选基因的稳定性进行综合评价,根据分析结果筛选适于杜鹃兰qRT-PCR的内参基因;并通过目的基因赤霉素氧化酶基因(GA 3-beta dioxygenase, GA3ox)和凝集素蛋白编码基因10 (lectin protein coding gene 10, Lectin10)对内参基因的稳定性进行验证。研究发现,在杜鹃兰不同处理条件和不同组织下均可引入双内参基因进行实验;在不同器官中,RPL和ef-1β的表达相对一致,稳定性较好,适合作为内参基因;在不同萌发阶段的共生萌发种子中,UBC和TUB表达最为稳定,而不同萌发阶段的非共生萌发种子中最稳定的内参基因为RPL和ef-1β。分别选择相对稳定的UBC和TUB作为内参基因时,目的基因GA3ox和Lectin10在不同萌发阶段的共生杜鹃兰种子中相对表达变化趋势基本一致,而稳定性较差的ACT并没有对目的基因的表达分析进行有效校正,其数据出现明显偏差。本研究为不同研究条件下杜鹃兰相关基因的表达分析提供了校正和标准化基因,有效提高了后续研究的准确性和可靠性。

• 三七根腐病菌茄腐镰刀菌的实时荧光LAMP快速检测方法的建立与应用

  车晓莉, 梁婷婷, 曲媛, 刘迪秋

  根腐病是我国三七(Panax notoginseng)种植区高发的一种严重病害,茄腐镰刀菌(Fusarium solani)是引起三七根腐病的重要病原菌。本研究建立了一套对三七根腐病菌茄腐镰刀菌进行现场快速检测的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)体系。首先通过PCR反应筛选D-氨基酸氧化酶基因(D-amino acid oxidase gene, DAO)为特异性检测茄腐镰刀菌的基因位点,并对该基因设计LAMP反应的特异性引物组并优化其反应条件,其中65 ℃为最佳反应温度,MgSO4的最佳浓度为6 mmol/L;dNTPs的最佳浓度为0.6 mmol/L;有环引物存在的情况下,扩增效率更高。分析了LAMP法检测茄腐镰刀菌的灵敏度,模板浓度可低至0.009 pg/μL。最后结合DNA免提法以及钙黄绿素显色法建立了三七根腐病菌茄腐镰刀菌的LAMP现场快速检测技术。本研究为三七种植以及种子种苗交易过程中的根腐致病菌茄腐镰刀菌的快速检测提供技术支撑。

• 基于PDS基因家族的海马齿VIGS体系的构建

  马伟, 王熙豪, 张雪妍

  海马齿(Sesuvium portulacastrum)是一种肉质盐生植物,对高盐胁迫具有极强的耐受性,病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)是鉴定植物基因功能的重要研究手段,为在耐盐植物海马齿中建立高效的VIGS体系,验证植物耐受逆境胁迫基因的功能,本研究以三亚海马齿为材料,选取八氢番茄脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)基因作为标记基因。根据转录组数据通过本地Blast等生物信息学手段鉴定得到5个海马齿PDS家族成员,利用PCR获得5个成员的公共序列(长度为431 bp)构建SpTRV2-PDS沉默表达载体,经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101转化后通过注射对植株进行侵染,对其表型进行观察,并测定其类胡萝卜素含量变化和PDS基因表达量。结果显示,经注射侵染后,海马齿植株出现生长缓慢及叶片逐渐发黄的症状,7 d后叶片出现白化现象,并可持续存在该表型;与对照组相比,实验组中类胡萝卜素含量和PDS的相对表达量降低,说明成功构建了海马齿的VIGS体系,表明VIGS体系能够有效沉默海马齿中PDS基因。本研究为鉴定海马齿耐盐基因功能提供了技术手段。

• 重组酶聚合酶扩增技术检测南美白对虾急性肝胰腺坏死病

  金东升, 漏懿荣, 王瑶华, 段丽君, 李其昂, 陈琛, 闫茂仓, 陈炯, 周前进

  急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是一种新近出现的对虾(Penaeidae)细菌性疾病,给世界范围内的对虾养殖业造成了巨大的经济损失。AHPND主要由携带毒力基因pirA和pirB的弧菌(Vibrio spp.)引起。本研究以pirA和pirB为检测靶标,分别设计和筛选特异性引物和探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)方法。RPA反应在39 ℃下进行,反应时间设定为20 min。结果显示,针对pirA和pirB基因分别筛选到1套引物/探针组合。应用该引物/探针组合对RPA方法进行系列测试,发现引物/探针组合均能够特异性检出目标毒力基因,对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus),以及虾肝肠孢虫(Enterocytozoon hepatopenaei)等13种微生物的基因组DNA未出现扩增。灵敏度实验结果发现,使用pirA的引物/探针组合最低能够稳定检测出0.01 fg/μL的重组质粒pirAB-pMD19,而使用pirB的引物/探针组合最低能够稳定检测出0.1 fg/μL的重组质粒pirAB-pMD19。经优化,检测pirA和pirB的RPA反应的最优引物浓度为0.4 µmol/L,探针浓度为0.16 µmol/L。使用优化的引物/探针组合对可疑南美白对虾(Penaeus vannamei)组织样品利用RPA方法进行检测,结果显示,利用建立的RPA方法能够准确地从对虾组织样品中检测到pirA和pirB,综合检测结果与世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health, WOAH)推荐的PCR方法结果一致。综上,本研究分别针对pirA和pirB建立的PRA方法能够快速、准确地检出ANPND病原,而且操作简便、耗时短,有望成为AHPND病害日常监测和快速检测的重要补充。

• 鸭源鸡杆菌tolC无痕敲除株的构建及生物学特性分析

  马立静, 史姿聪, 王新卫, 陈陆, 彭泽宇, 李栋梁, 杨霞

  TolC家族蛋白是一种广泛存在于革兰氏阴性菌中的外膜通道蛋白,介导多种底物胞外转运过程,在细菌的生物学功能中发挥着重要作用。解析鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis) TolC蛋白在该菌致病过程中发挥的功能,对于该病防控具有重要意义。本研究以临床分离株Yu-PDS-RZ-1-SLG (野生型)为研究对象,采用自然转化法构建tolC无痕敲除株ΔtolC,初步研究其生物学特性。结果显示,与野生型比较,ΔtolC的菌落及溶血环变小,对数生长期滞后2 h,整体生长速度减慢;生物被膜形成能力显著减弱(P<0.001);对高温、氧化应激及渗透压力的拮抗能力均降低(P<0.01);在浮游态及被膜态对部分抗菌药物的敏感性升高：浮游状态下ΔtolC对SDS、磷霉素和多西环素的敏感性分别增强至32、8和4倍,被膜态下ΔtolC对SDS、磷霉素和多西环素的敏感性分别增强至16、8和8倍,对硫酸新霉素和卡那霉素的敏感性没有变化;对人(Homo sapiens)宫颈癌细胞系(Hela)的黏附能力减弱。tolC无痕敲除株的构建及生物学特性分析为TolC蛋白在鸭源鸡杆菌中的生物学功能、致病机理及耐药机制等研究提供了基础资料。