农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2020年第10期

• 香鱼白细胞介素-1受体相关激酶3 (IRAK-3)的序列特征及对鳗弧菌感染的免疫相关性分析

  李尚阳, 周燕, 柴方超, 周前进, 陈炯

  白细胞介素-1受体相关激酶3 (interleukin-1 receptor-associated kinase-3, IRAK-3)是IRAK蛋白家族的成员,在多种感染性及非感染性疾病中,可通过抑制促炎因子的产生而调节免疫自稳和免疫耐受。IRAK-3在鱼类感染与免疫应答进程中的研究鲜有报道。本研究从香鱼(Plecoglossus altivelis)单核/巨噬细胞转录组中获得了香鱼的IRAK-3基因(PaIRAK-3),分析发现其开放阅读框为1 722 bp,预测编码573个氨基酸,理论分子量为63.2 kD,拥有IRAK家族特有的N末端死亡结构域(N-terminal death domain)、富含脯氨酸/丝氨酸/苏氨酸结构域(proline/serine/threonine-rich domain, ProST domain)、苏氨酸丝氨酸激酶结构域(kinase and/or pseudokinase domain)和C末端结构域(C-terminal domain)。系统进化树的结果显示,IRAK-3在鱼类中相对保守,PaIRAK-3与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和银大麻哈鱼(Oncorhynchus kisutch)的IRAK-3同源性最高,分别为63.1%和63.0%。qRT-PCR分析结果表明,PaIRAK-3主要在肾脏、鳃、脾脏、肝脏及肠组织中表达;鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后,香鱼肾脏、脾脏及肝脏中的PaIRAK-3的mRNA水平明显上调,均在感染8 h达到最大值;鳃组织中PaIRAK-3仅在8 h呈现明显上调。同时,本研究在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 Rosetta中表达了重组蛋白PaIRAK-3 (recombinant PaIRAK-3, rPaIRAK-3),利用纯化的rPaIRAK-3免疫小鼠(Mus musculus),制备了多克隆抗体。利用该抗体进行的Western blot分析结果表明,鳗弧菌感染后,肝脏和脾脏组织中PaIRAK-3的表达量明显上调,在12 h达到最大值。综上,本研究从mRNA水平和蛋白质水平上解析了PaIRAK-3与香鱼的鳗弧菌感染紧密相关,为深入探讨PaIRAK-3在抗菌免疫中的具体分子机制提供了参考依据。

• siRNA沉默ACSL1基因对秦川肉牛脂肪细胞中不饱和脂肪酸合成的影响

  田宏山, 苏晓彤, 赵志东, 韩向敏, 昝林森, 胡江, 罗玉柱, 王继卿, 白彦斌

  长链脂酰辅酶A合成酶1 (long-chain acyl-CoA synthetase 1, ACSL1)是酰基激活酶家族成员之一,对脂肪酸的激活、转运、降解及合成具有重要作用。本研究以秦川肉牛(Bos taurus)脂肪细胞为研究对象,采用qRT-PCR和小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)介导的技术研究ACSL1基因对不饱和脂肪酸合成的作用机制。本研究通过检测ACSL1基因及不饱和脂肪酸合成相关基因脂肪酸合成酶基因(fatty acid synthase, FASN)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1基因(stearoyl-CoA desaturease 1, SCD1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARγ)、脂肪酸去饱和酶1基因(fatty acid desaturase 1, FADS1)和脂肪酸结合蛋白3基因(fatty acid binding protein 3, FABP3)在牛脂肪细胞分化过程中的时序表达,发现ACSL1、FADS1、SCD1、FASN、PPARγ在牛脂肪细胞分化第4天表达水平最高,且呈现先上升后下降的趋势,而FABP3在牛脂肪细胞分化过程中无明显变化;利用siRNA介导的干扰技术,在牛脂肪细胞中转染si-ACSL1时,ACSL1基因的mRNA表达量下调70%以上(P<0.01),同时蛋白表达量也显著下调;沉默ACSL1基因下调了FABP3和PPARγ的表达,上调了FADS1和FASN的表达,而SCD1表达呈现先上升后下降的趋势;沉默ACSL1基因显著降低了C18∶0的比例(P<0.05),导致细胞中饱和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)的含量减少;同时显著降低了C16∶1、C18∶1、C18∶2、花生四烯酸(arachidonic acid, AA)及二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)的比例(P<0.01),导致细胞中单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid, MUFA)及多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)的含量减少;此外,Bodipy染色表明沉默ACSL1基因可减少脂肪细胞中脂滴的形成。因此,ACSL1基因对牛脂肪细胞中不饱和脂肪酸合成相关基因表达、脂肪酸组成以及脂滴形成具有重要调控作用。本研究结果为进一步阐明牛脂肪细胞中不饱和脂肪酸形成的分子机制提供理论依据。

• 小麦TaWRKY46介导转基因烟草耐盐性的功能分析

  蒋明月, 苏晓帅, 张宝华, 李小娟, 肖凯

  WRKY转录因子在植物抵御盐胁迫中发挥重要功能。实验室前期发现小麦(Triticum aestivum)TaWRKY46基因(GenBank No. EF368365)对盐胁迫产生明显应答,并构建了烟草(Nicotiana tabacum)过表达转基因系(overexpression lines, OE)。本研究对TaWRKY46蛋白的亚细胞定位特征分析表明其定位于核内。为研究TaWRKY46的功能,应用蛭石培养和Murashige & Skoog (MS)营养液水培法,对野生型(wild type, WT)和OE烟草植株表型进行了分析。盐胁迫下,OE1和OE5较WT呈现明显的生长优势,叶面积显著大于WT,植株鲜重及可溶性糖和可溶性蛋白含量显著高于WT。对植株叶片细胞保护酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性测定表明,NaCl处理下,过表达植株中上述酶的活性均显著高于WT;利用逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)技术分析上述保护酶基因在根系中的表达量发现,盐胁迫下OE1和OE5中部分保护酶基因的表达量也较WT高。进一步采用四唑氮蓝(nitroblue tetrazolium,NBT)和二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)对超氧阴离子自由基(superoxide radical, O2-·)和过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)进行组织定位发现,盐处理后,过表达株系OE5的O2-·和H2O2含量均较WT低。脱落酸(abscisic acid, ABA)受体基因(pyrabactin resistance-like ABA, PYL) NtPYL8以及蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族2 (sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 2, SnRK2)基因在根中的表达分析表明,盐胁迫下NtPYL8和部分SnRK2基因的表达量在OE中高于WT。叶片的气孔特征观察发现,OE5叶片的气孔开度在盐处理前比WT大,但盐处理后叶片气孔闭合速度快于WT。应用酵母双杂交技术还发现TaWRKY46与胁迫相关蛋白(stress associated protein, SAP) TaSAP1-1可能存在互作关系。结果表明,TaWRKY46通过增强渗透调节和保护酶系统、与ABA信号途径交叉以及蛋白质互作等途径在介导植株耐盐性中发挥重要作用。本研究丰富了对小麦WRKY家族成员耐盐功能的认识,为作物抗逆的遗传改良提供了理论依据。

• 桃PIN蛋白基因家族鉴定及其在不同树型桃中的表达分析

  谭彬, 杨丽萍, 陈立川, 冯玫侨, 连晓东, 魏鹏程, 程钧, 王小贝, 冯建灿

  生长素外向转运体PIN (PIN-FORMED)蛋白是一种典型的跨膜运输蛋白,通过参与植物体内生长素的极性运输进而在植物的生长发育过程中发挥重要作用。为弄清PIN蛋白在桃(Prunus persica)基因组中的分布、结构及进化,研究家族成员在不同树型桃中的表达特性,利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)已知的8个PIN蛋白和Mem_trans (PF03547)保守域从桃全基因组中进行桃PIN蛋白基因家族成员鉴定,并利用TBtools v0.6733、GSDS 2.0、MEME 4.9、Protparam V12.1、MEGA 7.0、PlantCARE等生物信息学软件对鉴定到的PpPIN蛋白基因家族成员进行染色体定位、基因结构、蛋白质理化性质、motif基序、系统进化和启动子顺式作用元件分析;基于转录组测序结果和qRT-PCR对PpPINs基因在不同树型桃中的表达特性进行分析。本研究鉴定出15个PpPIN蛋白基因家族成员;15个PpPIN基因不均匀分布在桃6条染色体上,除PpPIN3和PpPIN5外,其余的PpPIN基因均含有内含子,内含子数量在1~10;桃PIN蛋白家族成员全部为亲水蛋白,编码的氨基酸数目在357~678,等电点介于4.97~9.40;与苹果(Malus×domestica)、拟南芥、水稻(Oryza sativa)、毛果杨(Populus trichocarpa)、马铃薯(Solanum tuberosum)、玉米(Zea mays)和大豆(Glycine max)的聚类分析结果将8个物种的PIN蛋白分为3类(经典型, 非经典型1和非经典型2);根据进化分析结果将15个PpPIN分为3类,分别含有6个、2个和7个PIN蛋白;其中经典型和非经典型1的8个PpPIN蛋白的保守基序数量均为10个,且10个motif的排列顺序相同,而非经典型2的7个PpPIN蛋白的保守基序数量8~11不等,且保守基序排列方式也不尽相同。15个PpPIN基因启动子顺式作用元件分析结果表明PpPIN蛋白基因家族成员受到光、温、干旱胁迫等环境条件及脱落酸、赤霉素等多种激素的影响。15个PpPIN基因在不同树型桃中差异表达,PpPIN12在'粉花寿星桃'(矮化型)茎尖中的表达量显著高于'秋蜜红' (普通型),而在'洒红龙柱'(柱型)中的表达量显著低于'大久保' (普通型);PpPIN2基因在'大久保' (普通型)的分枝连接处韧皮部上的表达量显著高于'洒红龙柱' (柱型),而PpPIN13基因在'大久保' (普通型)的分枝连接处韧皮部上的表达量显著低于'洒红龙柱' (柱型)。PpPIN12、PpPIN2和PpPIN13 3个基因可能在调控桃树株高和分枝角度形成过程中发挥重要作用。

• 甜瓜WRKY基因家族鉴定及其响应低温胁迫的表达分析

  张高原, 魏兵强

  WRKY转录因子在植物响应低温胁迫中发挥着重要的调控作用,但是甜瓜(Cucumis melo) WRKY基因家族的全基因组鉴定及其在低温胁迫下的表达模式分析报道较少。本研究对甜瓜WRKY基因家族进行全基因组鉴定和生物信息学分析,并利用qRT-PCR技术检测WRKY基因在低温胁迫下的表达。结果显示,甜瓜基因组中共鉴定出59个CmWRKYs,非均匀地分布在各条染色体;系统进化树分析发现,甜瓜WRKY成员被分成3大类群(Ⅰ~Ⅲ),第Ⅱ类群又被分成5个亚群(Ⅱa~e);共线性分析发现,甜瓜和拟南芥(Arabidopsis thaliana) WRKY基因家族之间存在28个共线基因对,CmWRKYs基因之间存在10个片段复制基因对;启动子分析发现,CmWRKYs启动子有多种与激素和逆境响应等相关的顺式调控元件;基因本体(Gene Ontology, GO)注释分析发现,CmWRKYs广泛参与生物过程、细胞成分和分子功能等生理过程;低温胁迫表达分析发现,11个CmWRKYs受低温胁迫显著上调表达。本研究结果可为后续CmWRKYs基因克隆和耐低温功能分析提供参考依据。

• 毛竹PP2C基因家族鉴定与表达分析

  胡秋涛, 侯丹, 赵钟毓, 魏涵天, 林新春

  PP2C (2C type protein phosphatase)是一类广泛存在于生物体中、具有重要调控作用的蛋白磷酸酶,在植物抵抗逆境胁迫及激素响应等过程中具有重要作用,而在毛竹(Phyllostachys edulis)中的研究尚未充分开展。本研究以毛竹为材料,利用生物信息学方法,从毛竹全基因组中鉴定出125个具有完整PP2C保守结构域的基因,这些基因编码蛋白长度为110~1 086 aa,分子量为12.07~121.02 kD;系统进化分析表明,125个毛竹PP2C基因共可分为9个亚家族,其中4个基因(PH02Gene36278.t1, PH02Gene48541.t1, PH02Gene37946.t1, PH02Gene29918.t1)未被分入任何亚家族,而是单独形成分枝;基于转录组数据的组织特异性分析显示,121个PP2C基因在毛竹不同组织及不同发育阶段中都有不同程度的表达,多数PP2C基因在毛竹笋的不同发育阶段呈现较高的表达,也有部分PP2C基因在根与叶片等部位具有较高的表达;qRT-PCR结果显示,毛竹经过脱落酸处理后有9个PP2C基因上调表达、1个下调表达;在盐和茉莉酸甲酯处理后,各有6个基因上调表达、5个下调表达,说明PP2C基因在参与毛竹非生物胁迫及不同激素调控通路时可能发挥不同的作用。本研究可为毛竹PP2C基因家族功能的进一步研究提供参考依据。

• 蓖麻3个PIP基因的克隆与冷胁迫下的表达分析

  刘栩铭, 李敏, 张曼, 霍红雁, 何智彪, 张继星, 王晓宇

  植物水通道蛋白参与水分快速跨膜运输、调节植物体内的养分转运、种子萌发、侧根生长等多种生理过程。本研究以蓖麻(Ricinus communis)自交系'通蓖5号'叶片为材料,设计特异性引物,采用RT-PCR技术成功克隆3个水通道蛋白基因的开放阅读框(ORFs),分别命名为蓖麻质膜内源蛋白基因1;3 (Ricinus communis plasma membrane intrinsic proteins genes 1;3, RcPIP1;3)(GenBank No. MT068547)、RcPIP2;1 (GenBank No. MT068546)和RcPIP2;2 (GenBank No. MT068545)。生物信息学分析表明3个基因均包含4个外显子和3个内含子,编码蛋白含有6个跨膜螺旋和主要内源蛋白(major intrinsic proteins, MIPs)超家族特有的2个NPA (Asn-Pro-Ala)基序。多重序列比对表明RcPIP1;3与杨树(Populus tremula) PtPIP1;3的相似性高达92.36%;RcPIP2;1、RcPIP2;2分别与PtPIP2;1、PtPIP2;2的相似性高达87.80%、89.58%。进化树分析结果表明,RcPIP1;3属于PIP1类亚家族蛋白成员,RcPIP2;1与RcPIP2;2均为PIP2类亚家族蛋白成员。启动子区序列分析表明,3个基因具有响应激素诱导与环境胁迫的顺式作用元件,暗示其具有调节生长发育、适应环境胁迫的潜在功能。qRT-PCR分析发现RcPIP1;3、RcPIP2;2受冷胁迫上调表达,RcPIPP2;1受冷胁迫下调表达,表明3个基因在响应冷胁迫下可能存在拮抗调控模式。本研究为探索RcPIPs介导的冷适应性调控过程提供了重要依据。

• '凤丹白'牡丹PoMYB1转录激活及表达特性分析

  刘鹏, 李伟, 许壮壮, 刘庆华, 王奎玲, 郝青

  授粉受精是影响植物结实的关键生殖过程,MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)转录因子是参与调控此过程的重要转录因子家族之一。本研究以油用牡丹'凤丹白' (Paeonia ostii 'Feng Dan Bai')为实验材料,从已构建的雌蕊转录组数据库中获得与MYB基因同源性高的Unigene序列,通过cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术分离得到完整编码序列,命名为PoMYB1 (GenBank No. MT360920)。该基因ORF长864 bp,编码287个氨基酸;蛋白分子式为C1434H2235N415O441S12,相对分子量为32.73 kD,等电点为7.01,脂肪系数68.99,不稳定系数48.18,属于不稳定蛋白。蛋白序列分析表明PoMYB1由高度保守且不完全重复的R2R3-MYB结构域构成,PoMYB1包含3个保守元件;系统进化分析表明PoMYB1与卵叶牡丹(P. qiui) PqMYB同源性最高,其次是杨梅(Morella rubra) MrMYB1,均属于S6亚组R2R3-MYB类型转录因子。利用qRT-PCR技术分析PoMYB1的表达特性,结果表明PoMYB1在萼片中的表达量最高,其次为叶片、花瓣,提示其在花和叶片发育过程中发挥着作用;其在授粉后24 h的雌蕊表达增量最大,授粉后48 h表达量达到最大值,推测其可能在双受精过程中发挥重要作用。构建包含PoMYB1 ORF区等3个不同缺失片段的酵母(Saccharomyces cerevisiae)重组载体,利用酵母单杂交技术验证PoMYB1的转录激活活性,结果表明,PoMYB1属于转录激活子,且转录调控域在C端。本研究为牡丹双受精过程的探究提供了理论依据,并为进一步研究牡丹PoMYB1转录调控机制提供了基础资料。

• NGB和HIF-1α在牦牛间脑相关组织中的表达与定位

  米晓钰, 杜晓华, 董建英, James Blackar MAWOLO, 李乔, 温永强, 刘霞, 马睿

  间脑(diencephalon)是脊椎动物中枢神经系统中极为重要的部分,由胚胎发育早期的前脑泡演化而来,主要调节动物机体水平衡、体温、睡眠、觉醒、摄食等活动,在畜体适应高寒低氧环境过程中发挥着重要作用。为探讨牦牛(Bos grunniens)间脑相关组织在适应高寒低氧环境过程中脑红蛋白(neuroglobin, NGB)和缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)的表达及相互作用关系,本研究利用qRT-PCR、Western blot及免疫组织化学技术,对NGB和HIF-1α的表达与定位进行了研究。结果显示,牦牛间脑中,NGB和HIF-1α mRNA的表达量在垂体、松果体中均为最高(P<0.05);NGB蛋白在垂体、下丘中的表达量最高,HIF-1α蛋白则在垂体表达量最高(P<0.05);NGB和HIF-1α阳性产物主要分布于神经元胞质,且分布趋势相似,HIF-1α蛋白免疫阳性反应强度整体高于NGB蛋白;在丘脑、上丘、下丘中NGB和HIF-1α蛋白主要表达于多形细胞胞质;垂体中主要表达于嗜酸细胞胞质;松果体中主要表达于松果体细胞胞质;视神经中主要表达于视神经细胞和神经胶质细胞胞质,阴性对照均无表达。上述研究结果提示,牦牛间脑中垂体可能对缺氧具有较强的易感性;NGB和HIF-1α之间可能存在协同作用,以提高牦牛间脑对低氧的适应能力。本研究为进一步研究牦牛脑组织低氧适应性机制提供有价值的理论依据,也为深入探究哺乳动物脑组织NGB和HIF-1α可能发挥的生理功能提供可参考的数据支持。

• 东海1号大黄鱼SCD-1a和SCD-1b基因克隆及其对低温胁迫的应答

  李明云, 苗亮, 陈莹莹, 李翀, 张立宁

  大黄鱼(Larimichthys crocea)是暖温性鱼类,冬季低温可引起养殖大黄鱼大量死亡,有必要开展大黄鱼应对低温胁迫的研究。为明确大黄鱼硬脂酰辅酶A去饱和酶1基因(stearoyl coenzyme A desaturase 1, SCD-1)序列特征及其对低温胁迫应激的响应,本研究运用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术从东海1号大黄鱼中克隆获得SCD-1a和SCD-1b的cDNA序列全长,并通过qRT-PCR分析二者在慢性和急性低温胁迫下的表达变化。SCD-1a cDNA (GenBank No. MT325796)全长3 095 bp,开放阅读框1 014 bp,编码337个氨基酸;SCD-1b cDNA (GenBank No. MT325797)全长2 636 bp,开放阅读框1 008 bp,编码335个氨基酸。序列比对显示,大黄鱼SCD-1a和SCD-1b基因编码的氨基酸序列相似性为72.2%,都含有3个保守的组氨酸富含区域;二者预测的蛋白质三级结构高度相似,均有4个跨膜螺旋。系统进化分析显示,鱼类SCD聚为2个大簇,大黄鱼SCD-1a和SCD-1b分别位于两簇中,表明二者为不同亚型。正常生长温度(18 ℃)下,SCD-1a和SCD-1b都在大黄鱼肝脏中高表达,在其他组织中弱表达。慢性低温胁迫(以0.5 ℃/12 h的速度降温、维持12 h后继续降温的方法由12 ℃缓慢降至6 ℃)条件下,鳃、皮肤、肌肉、肠和脑中SCD-1a表达量显著升高,肝中SCD-1a表达量显著降低,皮肤、肌肉、肠、脑和心脏中SCD-1b表达量显著升高;急性低温胁迫(将鱼由12 ℃池直接捞入8 ℃池)条件下,所有组织中SCD-1b均出现表达显著升高,SCD-1a在皮肤以外的组织均表达显著升高。本研究结果对于了解大黄鱼应对和适应低温胁迫的机制具有一定的参考意义。

• 捻转血矛线虫ABC转运蛋白的基因克隆、原核表达及纯化

  赵学亮, 王姝懿, 孙柯, 呼和巴特尔, 王文龙, 刘春霞

  捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是绵羊(Ovis aries)、山羊(Capra hircus)等反刍动物重要的寄生虫之一,可造成养殖业的巨大经济损失。基于转录组研究,本课题组前期从捻转血矛线虫耐药虫株中鉴定获得耐药基因—ABC (ATP-binding cassette)转运蛋白基因(GenBank No. MT478136)。本研究拟分析ABC转运蛋白基因的生物信息学特征,建立ABC转运蛋白的可溶性诱导表达及纯化体系,为进一步探究ABC转运蛋白参与的耐药机制提供参考依据。首先利用在线软件对ABC进行蛋白质结构分析及抗原表位预测,结果显示,ABC分子式为C928H1502N270O265S7,属于不含跨膜区和信号肽的亲水性蛋白质,二级结构主要以延伸链为主;ABC转运蛋白的抗原性较高,含有较多的抗原表位。利用反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)扩增ABC转运蛋白基因,经酶切连接构建重组质粒pET30a(+)-ABC,转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21后进行诱导表达条件的优化,以0.6 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)于37 ℃诱导7 h可重组表达1 mg/mL ABC转运蛋白。本研究成功诱导表达并纯化了捻转血矛线虫重组ABC转运蛋白,可为深入开展其潜在耐药机制及免疫原性研究工作提供基础资料。

• 秀珍菇不同生长阶段在低温刺激后的转录组及差异基因表达分析

  王伟科, 陆娜, 闫静, 宋吉玲, 袁卫东, 周祖法

  秀珍菇(Pleurotus pulmonarius)属于变温结实菇种,低温刺激可诱导其子实体形成。为了探究秀珍菇结实的分子机制,本实验采用Illumina测序技术,对发菌完好的秀珍菇菌包的菌丝体常温培养阶段、低温诱导阶段、低温诱导后恢复至常温阶段、原基形成阶段4个不同生长发育阶段进行了全转录组测序,构建了4个样本的cDNA文库,并检测文库质量;利用Trinity软件拼接得到的转录组作为参考序列将4个样本的clean reads与之进行比对(mapping);最后对获得的有效序列进行功能注释及相关生物信息学分析。在4个不同生长阶段分别得到41 544 496、45 722 382、46 642 306和49 980 456个高质量测序标签。将所有高质量测序标签与参考序列进行比对定位,可以唯一定位到参考序列上的高质量标签数分别占总数的83.22%、82.85%、83.10%和82.59%。基因差异表达分析显示,与常温状态下相比,低温处理后秀珍菇菌丝体中上调表达基因个数为1 216个,下调表达基因的个数为1 046个;同时,与低温诱导后恢复至常温相比,原基形成阶段秀珍菇上调表达基因个数为1 331个,下调表达基因的个数为1 784个。经过Blast-Nr比对发现,经过低温诱导后,秀珍菇表达量上升的基因主要与烷基转移、天冬氨酸内肽酶活性、氧化还原、细胞壁形成和跨膜运输等相关;原基形成过程中,秀珍菇表达量上升的基因主要与转录调节、核糖体合成、甲基化和离子通道相关。GO (Go Ontology)富集分析表明,在常温处理与低温诱导后两个阶段与催化活性、单一生物体代谢过程和氧化还原酶活性等相关的GO 条目(term)中差异表达基因富集明显;在低温诱导后恢复至常温与原基形成两个阶段,催化活性、单组织过程及单组织代谢过程等GO term中差异表达基因富集明显。KEGG 通路(pathway)功能富集分析表明,TCA循环、内质网蛋白加工2条代谢通路中差异基因富集明显。通过对常温与低温诱导处理的菌丝体、低温诱导后恢复至常温的菌丝体与原基2对不同生长发育阶段转录组的比较研究,分别筛选出差异表达的基因2 262个和3 115个。qRT-PCR分析表明,所选基因在不同阶段的表达变化与转录组测序结果一致。本研究为进一步挖掘秀珍菇原基形成和子实体生长的关键基因奠定基础,也为应用基因工程培育优质、高产的秀珍菇新品种提供指导。

• 不同启动子及锚定蛋白对酿酒酵母表面展示β-葡萄糖苷酶活性的影响

  周红, 张阳, 宋育阳, 李莹, 杜青, 张会宁, 刘延琳

  β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, BGL)常作为限速酶在生物能源以及食品领域起着重要作用,本研究通过酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表面展示系统中的启动子和锚定蛋白的筛选来提高BGL的酶活。从高拷贝质粒pYES2/CT/α-factor出发,GFP作为报告蛋白,来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的BGL作为目标蛋白,构建3种锚定蛋白(α-凝集素蛋白(mating agglutinin protein, Sag1p), 抑制指数缺陷蛋白(suppression of exponential defect protein, Sed1p)和细胞壁蛋白2 (cell wall protein 2, Cwp2p))表面展示GFP的重组酵母和两种启动子(抑制指数缺陷蛋白的启动子(promoter of suppression of exponential defect protein, SED1)和3-磷酸甘油脱氢酶的启动子(promoter of glycerol 3-phosphate dehydrogenase, GPD)和GPD))与3种锚定蛋白(Sag1p, Sed1p和Cwp2p)组合配对表面展示BGL的重组酵母,探究不同启动子和锚定蛋白对酿酒酵母表面展示BGL活性的影响。利用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白发现成功搭建酿酒酵母表面展示平台;成功构建了6株由两种启动子SED1和GPD以及3种锚定蛋白Sag1p、Sed1p和Cwp2p组合搭配的表面展示BGL的重组酵母。结果表明,在6株重组酵母中,GPD启动子比SED1启动子的效果更好;对两种启动子而言,在3种锚定蛋白(Sag1p, Sed1p, Cwp2p)中,Sag1p展示的酶活最高;GPD启动子与Sag1p锚定蛋白组合表面展示BGL的重组酵母PBy-GBSa的酶活最高,最高酶活为(18.29±1.05) U/g。结果表明不同启动子及锚定蛋白对酿酒酵母表面展示BGL有重要影响。本研究为以后酿酒酵母更加高效稳定地表面展示BGL提供理论指导,为实现BGL全细胞催化剂工业化应用提供理论基础。

• 南非2型口蹄疫病毒VP1基因的原核可溶性表达及免疫原性分析

  李国秀, 欧云文, 丁耀忠, 李茜, 代军飞, 刘磊, 张杰

  南非2型口蹄疫(Foot-and-mouth disease serotypes Southern African territories 2, SAT2-FMD)是由南非2型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus serotypes Southern African territories 2, SAT2-FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。当前全球贸易和人员往来频繁,SAT2-FMD传入中国的风险极高,这将严重威胁我国养殖业持续健康发展。为原核可溶性表达SAT2-FMDV (GenBank No. JX014256) VP1基因,探索VP1融合蛋白的免疫原性,本研究以序列优化的pUC57-His-SUMO-SAT2-VP1重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得993 bp目的序列,扩增产物克隆入pET32a (+)原核表达载体,构建pET32a-HisSUMO-VP1重组质粒,转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),诱导表达,亲和层析纯化。将纯化后HisSUMO-VP1融合蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,免疫Balb/C小鼠(Mus musculus),并对免疫小鼠血清抗体、脾淋巴细胞增殖和细胞因子水平进行测定。研究结果表明,HisSUMO-VP1融合蛋白实现原核可溶性表达,大小约为63 kD,且具有较好的反应原性;免疫小鼠实验结果发现,HisSUMO-VP1融合蛋白组的小鼠免疫血清抗体水平极显著高于HisSUMO蛋白组和PBS组(P<0.001),且抗体水平呈上升趋势;HisSUMO-VP1融合蛋白组小鼠脾脏淋巴细胞发生显著地增殖反应(P<0.001),细胞因子IFN-γ和IL-2水平显著高于PBS组(P<0.05)。本研究成功实现SAT2-FMDV-VP1基因的原核可溶性表达,表达的HisSUMO-VP1融合蛋白具有良好的免疫原性,为SAT2-FMDV疫苗及检测方法的研发提供数据支持。

• 小鼠和绵羊BMP15和GDF9突变在卵泡发育中作用及其对排卵数的影响

  王翔宇, 狄冉, 刘秋月, 胡文萍, 马琳, 储明星

  哺乳动物的卵泡发生、发育、成熟直到排卵过程,是一个由卵母细胞和包裹在其周围的颗粒细胞之间精确互作的复杂生理学过程。在这个过程中,卵母细胞分泌的骨形态发生蛋白15 (bone morphogenetic protein 15, BMP15)与生长分化因子9 (growth differentiation factor 9, GDF9)通过旁分泌调控颗粒细胞生长、分化,促进卵泡的早期发育,参与排卵卵泡的选择,最终影响排卵数。BMP15和GDF9突变可以引起卵巢表型效应的改变,而在不同物种中表现有所差异。BMP15和GDF9基因相关突变可以造成小鼠(Mus musculus) 繁殖力降低或不育,而在绵羊(Ovis aries)中,这些突变杂合子可以引起BMP信号传导减弱从而增加绵羊排卵数,纯合子则会抑制卵泡生长,使绵羊不育。本文通过对BMP15和GDF9敲除和过表达小鼠模型和BMP15和GDF9相关自然突变绵羊中卵巢功能及排卵数的变化,综述BMP通路中,BMP15和GDF9及其二聚体通过其活性的动态平衡调控卵泡发育,决定卵泡命运和排卵的重要功能。这些研究结果可为解析绵羊排卵调控通路和高繁殖力绵羊新品种培育开辟新视角。

• 羊肉品质评价指标及重要候选基因研究进展

  刘星, 孔园园, 张雪莹, 李发弟, 李万宏, 乐祥鹏

  随着人们生活水平的提高,对优质羊肉的需求量也越来越大。肉质评价指标主要有滴水损失、肉色、大理石纹、系水力、肌内脂肪含量、肌肉脂肪酸组成、酸碱度等,这些指标直接或间接地影响着人们的消费倾向。由于目前对肉质测定方法大多集中在屠宰后进行,因此常规的育种方法很难以低成本的方式快速有效地提高羊肉品质。目前育种学家开始关注利用分子生物学的方法找出与羊肉品质相关的候选基因和分子标记,为精确、快速改善肉品质开辟了一条新的道路。本文对羊肉品质评价的指标,以及与部分指标相关的重要候选基因等进行综述,以期为今后羊肉品质的遗传改良和育种工作有所帮助。

• 基于单克隆抗体的番茄黑环病毒血清学检测技术

  刘莉, 何宛芹, 于翠, 吴建祥

  番茄黑环病毒(Tomato black ring virus, TBRV)是严重危害多种草本及木本植物的口岸检疫性有害生物,加强口岸检验检疫是防止其入侵我国的关键。本研究以制备的抗TBRV特异性单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb)建立TBRV的血清学检测技术,旨在为该病毒的检测和口岸检验检疫提供技术支持。以提纯的TBRV粒子为免疫抗原,利用杂交瘤细胞技术制备4株能分泌抗TBRV单抗的杂交瘤细胞(10A8, 21A8, 21B8和8D3)及其单抗腹水。4株单抗腹水的间接酶联免疫吸附试验(indirect enzyme-linked immunosorbent assay, indirect-ELISA)效价达到10-7。Western blot分析单抗特异性表明,4株单抗均与感染植物中的TBRV外壳蛋白亚基发生特异性免疫反应,而不与健康植物组织发生反应。利用制备的单抗建立检测TBRV的斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)和组织印迹酶联免疫吸附试验(Tissue print-ELISA) 2种血清学方法。建立的Dot-ELISA和Tissue print-ELISA均能特异性检测感病植物中的TBRV,而与感染烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus, TRSV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus, ToMV)和番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)的植物和健康植物均呈阴性反应。以4株单抗建立的Dot-ELISA血清学方法检测TBRV病叶粗提液的灵敏度分别为1∶10 240、1∶10 240、1∶5 120和1∶5 120。上述实验结果表明,基于制备的4株单抗所建立的Dot-ELISA和Tissue print-ELISA血清学方法对于TBRV检测具有高度特异性和灵敏性,可以准确、有效地用于口岸TBRV检验检疫和田间植物TBRV的检测诊断。