农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2024年第5期

• 谷子SiPHYA和SiPHYB基因对光质、光周期和非生物胁迫的响应

  杜晓芬, 沈蒙蒙, 王智兰, 韩康妮, 李颜方, 成锴, 李禹欣, 连世超, 王军

  光敏色素是一类红光/远红光受体,调控植物种子萌发、株高、开花和避荫性。为探究谷子(Setaria italica)光敏色素A (phytochromes A, PHYA)和光敏色素B (PHYB)基因对光质、光周期和非生物胁迫的响应模式,本研究采用RT-PCR克隆得到SiPHYA (Seita.9G113600)和SiPHYB (Seita.9G427800)的cDNA序列,SiPHYA编码区长度为3 396 bp,编码1 131个氨基酸;SiPHYB编码区长度为3 507 bp,编码1 169个氨基酸。利用MEGA-X软件构建多物种进化树,谷子SiPHYA和SiPHYB分别与玉米(Zea mays) ZmPHYA和ZmPHYB亲缘关系最近。通过在线网站植物转录调控图谱(plant transcriptional regulatory map, PlantRegMap, http://plantregmap.gao-lab.org/index.php)预测SiPHYA和SiPHYB启动子区结合转录因子情况,结果显示,29个家族共计109个转录因子可结合到SiPHYA启动子区,27个家族共计93个转录因子可结合到SiPHYB启动子区。最后利用qRT-PCR研究其在谷子不同组织器官及不同光质、光周期和逆境处理下的表达模式。结果表明,SiPHYA和SiPHYB在谷子的根、茎、叶和幼穗中均有表达,且都在旗叶中表达量最高;不同光质处理下,SiPHYA和SiPHYB在'衡谷12号'和'长农35号'中响应模式有所不同。其中,'衡谷12号'中SiPHYA在黑暗下表达量最高,而'长农35号'中SiPHYA在远红光下表达量最高,SiPHYB在'衡谷12号'和'长农35号'中均表现为白光下表达量最高,红光下表达量最低;长日照条件下,SiPHYA在'衡谷12号'和'长农35号'中均表现出相似的昼夜节律变化,SiPHYB在'长农35号'中表现出昼夜节律变化,但在'衡谷12号'中无昼夜节律变化;短日照条件下,SiPHYA和SiPHYB在'衡谷12号'和'长农35号'中均无昼夜节律变化;SiPHYA和SiPHYB对高盐、高热、低温和干旱均有响应,但响应模式有所不同。本研究为深入挖掘SiPHYA和SiPHYB在谷子生长发育和非生物胁迫中的功能机制提供线索,并为其在谷子分子遗传改良中的应用提供依据。

• 基于BSA-seq和植物激素联合分析筛选番茄耐热基因

  姜悦畅, 段金虎, 李毅丰, 毛秀杰, 王帅, 张宁

  高温影响番茄(Solanum lycopersicum)的生理和激素代谢,番茄耐热相关基因的定位可以为后续基因克隆和功能分析提供理论依据和技术支持。本研究以电导率为鉴定指标,通过对苗期2个番茄品系进行高温耐热鉴定,以耐热品系CH与不耐热品系DH及其F1代自交构建成的F2代分离群体为材料,对亲本CH与DH进行植物激素检测,F2代分离群体采用混合分离群分析法(bulked sergeant analysis, BSA)进行重测序,通过二者联合分析筛选出与番茄耐热相关的候选基因。结果表明,通过植物激素差异代谢物筛选及KEGG注释获得了4个与植物非生物胁迫相关的代谢通路,分别为甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径,氨基酸的生物合成途径,色氨酸代谢途径和氨酰-tRNA生物合成途径;通过BSA-seq测序,在3号染色体上获得了1个大小为6.32 Mb的候选区间,其中包括752个候选基因,结合差异代谢通路,最终在候选区域代谢通路内筛选出5个与番茄耐热相关的候选基因,分别为D-甘油酸3-激酶(D-glycerate 3-kinase, DG3K)、羟基丙酮酸还原酶(hydroxypyruvate reductase, HYDR)、脯氨酰-tRNA合成酶(prolyl -tRNA synthetase, PARS2)和磷酸核酮糖-3-差向异构酶(ribulose phosphate 3-epimerase, RPE)、醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH);通过qPCR对候选基因进行表达量分析,候选基因DG3K、PARS2和RPE在高温胁迫3 h后表达量极显著增加(P<0.01),推断这3个候选基因可能在调控番茄耐热能力上起到重要作用。本研究对分子辅助选育番茄耐热品系具有重要意义。

• 番茄β-BAM基因家族全基因组鉴定及其盐胁迫和外源植物生长调节剂下的表达分析

  李贤国, 陈兆龙, 王泽鹏, 戴麒, 余庆辉, 李宁

  β-淀粉酶(β-amylase, BAM)广泛参与植物体内各种生物学过程的调控,并响应激素与非生物胁迫等多种外界刺激。本研究通过生物信息分析,在番茄(Solanum lycopersicum)中鉴定出8个SlBAM成员,并进行了理化性质、基因结构、系统进化、共线性等分析;使用qPCR对SlBAM基因在盐胁迫和果实发育下的表达模式进行分析。结果表明,SlBAM均具有典型的Glyco_hydro_14结构域,多数SlBAM呈酸性,且都为亲水蛋白。系统发育分析显示,SlBAM可分为6个类群,相同类群具有相似的基因结构及基序分布。顺式作用元件组成表明,大部分SlBAM的表达可能与植物激素、非生物胁迫和光反应等相关。共线性分析结果显示,番茄与拟南芥BAM基因家族有一定的同源性,与马铃薯(Solanum tuberosum)亲缘关系更近。qRT-PCR分析发现,SlBAM基因主要在叶中表达,在根和茎中表达量较低。在盐胁迫下,SlBAM2、SlBAM4和SlBAM6表达上调(P<0.05),SlBAM1和SlBAM3表达下调(P<0.05)。当外源激素2, 4-油菜素内酯(2, 4-epibrassinolide, EBS)浓度为0.1 mol/L时,绿熟期番茄的所有SlBAM基因都显著上调(P<0.05)。在α-萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid, NAA)影响下,除SlBAM6外的所有SlBAM基因都表达上调,只有SlBAM6表达下调。本研究为进一步揭示番茄BAM基因家族在响应非生物胁迫及其在果实发育中的功能提供了参考依据。

• 葡萄纤维素合酶超家族基因鉴定及其表达分析

  胡玲玲, 徐涛, 杨杰, 龚丽丽, 杨语心, 杨中义, 吴月燕

  果实硬度是鲜食葡萄品质的重要指标之一,对葡萄(Vitis vinifera)的商品性和市场价值有极大影响。细胞壁的结构与成分是导致葡萄果实硬度差异的重要因素,纤维素合酶(cellulose synthase/cellulose synthase-like, CesA/Csl)超家族是编码参与合成植物细胞壁中纤维素和半纤维素的关键酶,对果实硬度有着潜在作用。然而葡萄CesA/Csl超家族尚未得到系统鉴定。为探究葡萄CesA/Csl超家族在不同硬肉和软肉葡萄品种中的表达模式,本研究运用生物信息学方法,在全基因组水平鉴定葡萄CesA/Csl超家族基因,构建了系统发育进化树,并对基因的理化性质、结构及其品种表达特性等进行了分析。结果表明,葡萄CesA/Csl家族共有67个成员,在15条染色体上不均等分布;系统发育树分析显示,葡萄CesA/Csl家族成员被分为6个亚族,在进化中较为保守;该家族成员所编码的蛋白主要分布在质膜上,其氨基酸长度为128~1 406 aa;转录组分析结果发现,硬肉和软肉葡萄的成熟期果实中存在显著差异表达的CesA/Csl家族基因,这可能是导致果实硬度差异的关键基因。此外,在同一品种的不同发育时期,VvCesA4和VvCslB5的表达存在显著差异,可能调控果实生长发育过程中的硬度变化。通过qRT-PCR与不同品质果实硬度关联性分析发现,VvCesA4负向调控果实硬度,VvCesA2和VvCesA6正向调控果实硬度。上述结果表明,CesA/Csl超家族在葡萄硬度差异中发挥不同的调控作用。本研究为深入挖掘CesA/Csl超家族调控葡萄果实硬度的机制提供理论依据。

• 桂花OfMYB12基因参与类黄酮合成的功能分析

  张慧莲, 王艺光, 钟诗蔚, 邓金萍, 方遒, 赵宏波

  MYB转录因子广泛参与植物生长发育,对植物次生代谢具有重要调控作用。本课题组前期通过转录组测序(RNA-Seq)技术筛选出与桂花(Osmanthus fragrans)类黄酮合成相关的基因OfMYB12。本研究进一步从桂花'堰虹桂' (O. fragrans 'Yanhonggui')的花芽克隆出OfMYB12基因(GenBank No. WMD01176),该基因ORF全长为1 026 bp,编码341个氨基酸;亚细胞定位结果表明该基因定位于细胞核中。多序列比对和系统发育树分析表明,OfMYB12基因属于典型的R2R3转录因子,且与拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的原花青素AtMYB56激活因子亲缘关系最近。组织特异性结果分析表明,OfMYB12基因在桂花不同组织中均表达,并且在花瓣中表达量最高;在白花矮牵牛'米歇尔'(Petunia hybrida 'Mitchell')中异源过表达OfMYB12,结果发现,转基因花瓣中的总黄酮含量显著高于对照组(P<0.05),并且在类黄酮合成通路上的相关基因(PhCHS (Petunia hybrida chalcone synthase), PhF3H (P. hybrida flavanone 3-hydroxylase), PhFLS (P. hybrida flavonol synthase))的表达量显著升高。基于以上结果,推测OfMYB12基因可能参与类黄酮次生代谢生物合成的调控。本研究结果为桂花类黄酮合成分子机制探索及桂花品质改良提供了理论依据。

• 杜鹃花属映山红、马银花与羊踯躅三亚属间杂交亲和性研究

  高佳佳, 肖政, 董彬, 赵宏波

  我国的杜鹃花属(Rhododendron)资源丰富,且栽培历史悠久,运用杂交育种技术可以极大丰富杜鹃花品种资源。杜鹃花属中映山红亚属(subgen. Tsutsusi)、马银花亚属(subgen. Azaleastrum)和羊踯躅亚属(subgen. Pentanthera)同属于被毛杜鹃进化枝,为探究三亚属植物间杂交亲和性以及杂交障碍的发生阶段,本研究以映山红亚属的映山红(R. simsii)、锦绣杜鹃(R. pulchrum)及8个栽培品种、马银花亚属的马银花(R. ovatum)、羊踯躅亚属的羊踯躅(R. molle)及2个栽培品种为研究对象,从花柱长度比、花粉萌发、花粉管生长、子房和胚胎发育等角度分析亚属间杂交亲和性。结果表明,映山红、马银花、羊踯躅三亚属间存在明显的单向不亲和现象,所有组合花粉均能在柱头大量萌发,映山红亚属×羊踯躅亚属、马银花亚属×羊踯躅亚属、马银花亚属×映山红亚属花粉管大量到达花柱基部,能坐果;反交花粉管大部分在花柱中部停止生长,少量到达花柱基部,且不能坐果。马银花亚属×羊踯躅亚属、马银花亚属×映山红亚属胚发育比映山红亚属×羊踯躅亚属慢,蒴果开裂时间晚,各杂交方向的成熟种子多数胚发育不完全。上述研究结果表明,三亚属间杂交障碍出现在花粉管生长、双受精和胚发育阶段。本研究探讨了杂交亲和性发生规律,为杜鹃花属各亚属间杂交育种提供参考。

• 红花CtWRI1基因克隆与功能分析

  李佳奇, 任滢蓥, 刘沙, 刘鸿业, 田银帅

  红花(Carthamus tinctorius)是兼具药用和油用价值的经济作物,解析红花籽油脂合成的分子机制对红花遗传育种具有重要意义。WRINKLED1 (WRI1)基因在植物油脂合成过程中发挥着重要的调控作用。为解析红花籽油脂积累的分子机制,本研究结合早期转录组数据,以'豫红花3号'为实验材料,利用同源序列法克隆获得红花CtWRI1基因的cDNA序列(GenBank No. OP785157),对其进行生物信息学及表达模式分析,并通过烟草(Nicotiana tabacum)遗传转化对其功能进行研究。结果显示,CtWRI1基因的CDS全长为1 128 bp,编码375个氨基酸。保守结构域预测显示,CtWRI1蛋白包含2个保守的AP2/ERF结构域。进化树分析结果表明,CtWRI1蛋白序列与向日葵(Helianthus annuus)和莴苣(Lactuca sativa)的亲缘关系最近。CtWRI1基因在种子发育过程中具有较高的表达,且在发育10 d的种胚中达到最高。CtWRI1基因转化烟草后,可诱导烟草脂肪酸合成基因的表达,并且转基因烟草种子油脂含量显著增加。本研究为深入研究红花籽油脂合成的分子机制提供了理论基础。

• 山羊PPP3CA基因拷贝数变异及其与生长性状的关联分析

  白洋洋, 杜书增, 李信, 朱海鲸, 屈雷, 郭振刚, 杨青, 蓝贤勇

  蛋白磷酸酶3催化亚基α (protein phosphatase 3 catalytic subunit alpha, PPP3CA)在动物生长发育过程中发挥着重要作用。本研究旨在探究PPP3CA基因在山羊(Capra hircus)不同组织中的表达、拷贝数变异及其对不同品种山羊生长性状的遗传效应。收集11只陕北白绒山羊的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、大脑、卵巢、输卵管和睾丸组织,检测PPP3CA基因在不同组织中mRNA的表达水平。在306只陕北白绒山羊和110只贵州黑马羊群体中,利用qPCR技术,检测不同品种山羊PPP3CA基因存在的拷贝数变异(copy number variation, CNV),采用单因素方差分析PPP3CA基因CNV位点与山羊生长性状之间的关联性,并利用生物信息学对CNV位点进行连锁不平衡分析及转录因子预测。结果表明,PPP3CA基因mRNA在肺中表达量最高,脾、输卵管、睾丸、心、肝、肾、肌肉和大脑等组织中表达次之。PPP3CA基因中共检测到3个CNV位点。在陕北白绒山羊群体中CNV1和CNV2位点与山羊的胸围性状显著相关(P<0.05);CNV3位点与胸宽、胸深和胸围性状均显著相关(P<0.05)。在贵州黑马羊群体中,CNVI、CNV2和CNV3位点与山羊生长性状均无显著相关性。PPP3CA基因的CNV位点间不存在连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)单倍型区块,但可能存在SPT23、SIP4和YOX1转录因子的结合位点。综上所述,在陕北白绒山羊群体中,PPP3CA基因的CNV1、CNV2和CNV3位点可以作为分子标记用于山羊的生长性状选育。

• PPARγ激活和抑制状态下调控IFNβ表达的互作蛋白鉴定与分析

  马卓媛, 杨玢, 陈云龙, 樊港, 吴晓龙, 王希音, 华进联, 王妍, 张永强, 张仕强

  过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ)在肺泡巨噬细胞中特异性高表达,具有代谢和免疫调控作用。在先天免疫诱导产生Ⅰ型干扰素过程中,PPARγ究竟与哪些互作蛋白共同参与该过程的调控目前尚不清楚。本研究利用慢病毒载体系统构建了稳定过表达PPARγ-3×Flag的野猪(Sus scrofa)肺细胞系(wild boar lung cell line, WSL)。以该细胞为模型,通过荧光定量PCR检测发现,添加PPARγ激动剂罗格列酮能显著降低双链DNA模拟物Poly (dA:dT)刺激诱发的干扰素β (interferon β, IFNβ)表达水平;相反,添加PPARγ抑制剂T0070907能显著提高Poly (dA:dT)刺激引起的IFNβ表达水平。进一步利用抗Flag蛋白的免疫磁珠富集沉淀调控上述过程的PPARγ-3×Flag蛋白复合物,将细胞质蛋白和细胞核蛋白富集的PPARγ-3×Flag复合物分别消化成肽段,利用液相色谱-串联质谱联用(liquid chromatograph-tandem mass spectrometer, LC-MS/MS)进行检测分析。结果发现,在添加PPARγ激动剂的条件下,与PPARγ特异互作的胞质蛋白有101个,胞核蛋白有95个;在添加PPARγ抑制剂的条件下,与PPARγ特异互作的胞质蛋白有24个,胞核蛋白有14个。GO和KEGG分析表明,与PPARγ特异互作的胞质蛋白和核蛋白均与翻译调控相关。本研究为深入探究PPARγ调控IFNβ表达机制提供了新线索。

• 基于基因组信息的大蒲莲猪遗传多样性和群体结构变化分析

  张鑫, 张婷, 王怀中, 杨晴, 高世超, 王彦平, 王继英

  由于系谱错误、留种不均衡和杂种个体混入等原因,地方猪保种过程中可能会出现群体近交系数增速过快、个体间亲缘关系不明等问题。为分析大蒲莲猪(Sus scrofa)保种群的遗传多样性和群体结构,监测保种群2017~2022年期间基因组信息变化情况,本研究利用高密度SNP芯片对110头大蒲莲猪全基因组SNP进行扫描,对比分析了2017年和2022年大蒲莲猪保种核心群样本的遗传多样性、近交系数、系统发生树以及与引进猪的关系。结果表明：1) 2022年大蒲莲猪样本的观察杂合度(observe heterozygosity, HO)(0.356 vs 0.292)、期望杂合度(expected heterozygosity, HE)(0.342 vs 0.285)和遗传距离(0.270 vs 0.233)均高于2017年样本,血缘同源(identity by descent, IBD)比例(0.108 vs 0.127)和基于纯合性片段(runs of homozygosity, ROH)计算的基因组近交系数FROH (0.108 vs. 0.163)低于2017年样本,系统发生树结构与2017年样本相似但家系间的均衡性增加,说明2022年核心群的遗传多样性比2017年有所提高,群体结构有所改善。2) 2022年样本的HO和HE比值(1.041 vs. 1.025)高于2017年样本,与引进品种的主成分分析(PCA)中,2022年样本比2017年样本更偏向于引进品种猪,说明大蒲莲猪中混有一定的其他群体血缘,且2022年大蒲莲猪群体中其他品种的血缘比2017年有所增加。本研究分析了大蒲莲猪群体变化趋势,为大蒲莲猪进一步的保种与科学利用提供参考依据。

• 兔促性腺激素抑制激素受体基因NPFFR1的克隆及其在HPT轴的表达分析

  桑雷, 高承芳, 孙世坤, 王锦祥, 陈冬金, 谢喜平

  神经肽FF受体1 (neuropeptide FF receptor 1, NPFFR1)是促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone, GnIH)的主要受体,在调控动物生殖生理方面起着重要作用。为了解NPFFR1基因的功能,本研究以闽西南黑兔(Oryctolagus cuniculus)为研究对象,采用cDNA末端快速克隆(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆了NPFFR1基因(GenBank No. OP791886),并对其进行了生物信息学和时空表达谱分析;此外,公兔腹腔注射0、0.5、5和50 μg GnIH多肽,利用qPCR方法检测下丘脑-垂体-睾丸(hypothalamic-pituitary-testicular, HPT)轴中NPFFR1基因的表达水平。生物信息学分析表明,兔NPFFR1全长3 712 bp,编码432个氨基酸;其翻译的蛋白由α螺旋、无规卷曲和β折叠组成,是镶嵌于质膜的7次跨膜蛋白,与高原鼠兔(Ochotona curzoniae)和北美鼠兔(Ochotona princeps) NPFFR1高度同源。qPCR结果表明,NPFFR1基因在HPT轴中均有表达,在下丘脑的表达量显著高于垂体和睾丸(P<0.05)。出生后,90日龄兔下丘脑NPFFR1基因表达量显著低于11、30、60和150日龄(P<0.05),30和120日龄兔垂体NPFFR1基因表达量显著低于11和90日龄(P<0.05),30日龄兔睾丸NPFFR1基因表达量显著低于11和90日龄。兔腹腔注射5~50 μg GnIH多肽后,下丘脑NPFFR1基因表达量呈现剂量依赖性增加;50 μg剂量组睾丸NPFFR1基因表达量显著大于5 μg剂量组(P<0.05);注射4种剂量GnIH多肽都未引起垂体NPFFR1表达量发生改变。本研究为深入探讨兔NPFFR1在生殖生理方面的作用机制提供基础资料。

• LncRNA-TUG1通过调节miR-31-5p/YWHAE轴影响22Rv1细胞的增殖和迁移

  赵佳福, 李永, 周明帅, 温晓艳, 陆情梅, 刘彬

  酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白ε (tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activating protein ε, YWHAE)在前列腺癌(prostate cancer, PCa)中高表达,miR-31-5p可靶向调控YWHAE的表达影响前列腺癌细胞的增殖。但是,参与miR-31-5p对YWHAE靶向调控的长链非编码RNA (long non-coding RNA, LncRNA)目前尚不明确。本研究根据前人研究结果及生物信息学分析软件筛选出LncRNA-牛磺酸上调基因(LncRNA-tauronic upregulation, LncRNA-TUG1)、LINC02604和PDCD6IP-DT 3条LncRNAs能靶向调控miR-31-5p的表达。通过RT-qPCR检测3条LncRNAs在前列腺癌细胞系LNCaP、PC3、22Rv1及正常前列腺基质永生化细胞(WPMY-1)中的表达,筛选调控miR-31-5p/YWHAE轴的最佳LncRNA;RT-qPCR检测干扰LncRNA-TUG1及过表达miR-31-5p对22Rv1细胞中LncRNA-TUG1、miR-31-5p和YWHAE表达的影响;同时,通过CCK-8、细胞划痕实验检测共转染sh-TUG1及miR-31-5p mimics对22Rv1细胞增殖和迁移的影响;Western blot检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、B细胞淋巴瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2, BCL-2)、Bcl-2相关X蛋白(BCL2-associated X, BAX)和半胱氨酸蛋白酶-3 (cysteine proteinase-3, Caspase-3)表达的影响。结果表明,LncRNA-TUG1、LINC02604和PDCD6IP-DT为调控miR-31-5p/YWHAE轴的3条LncRNAs,且与正常细胞相比,LncRNA-TUG1在PCa各细胞系中高表达,尤其在22Rv1细胞中的表达量最高。以LncRNA-TUG1为研究对象,分别转染sh-TUG1及miR-31-5p mimics到22Rv1细胞后,qPCR结果显示,与NC mimics组相比,转染miR-31-5p mimics组中miR-31-5p的表达量极显著上调(P<0.01),LncRNA-TUG1和YWHAE基因的表达显著下调(P<0.05);与sh-NC组相比,转染sh-TUG1组中miR-31-5p的表达无显著变化,LncRNA-TUG1的表达显著下调(P<0.05),YWHAE基因的表达极显著下调(P<0.01);CCK-8及细胞划痕实验表明,共转染sh-TUG1及miR-31-5p mimics后,能够显著抑制细胞增殖及迁移;Western blot结果表明,共转染sh-TUG1及miR-31-5p mimics能够显著抑制PCNA、BCL-2/BAX蛋白的表达,促进caspase-3蛋白的表达。以上结果说明,LncRNA-TUG1可通过调节miR-31-5p/YWHAE来调控PCNA、BCL-2、BAX和caspase-3蛋白的表达,进而影响22Rv1细胞的增殖。本研究为前列腺癌症靶向药物的开发提供理论参考和实验思路。

• 玉米大斑病菌铁载体合成基因簇鉴定及表达分析

  岳浩峰, 赵天益, 李海笑, 闫秋静, 徐雅迪, 孟亚南, 曹志艳, 刘宁, 董金皋

  铁是微生物生长必需的元素,在氧代谢、电子转移以及DNA和RNA合成等过程中发挥重要作用,微生物主要依赖于铁载体吸收环境中的铁离子。铁载体作为微生物分泌的低分子量铁螯合物,协助机体运输铁离子。真菌主要利用非核糖体多肽合成酶编码基因为核心的次级代谢物生物合成基因簇合成铁载体,本研究旨在明确玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)铁载体的合成基因簇以及关键基因的表达。利用铬天青(chrome azurol sulphonate, CAS)鉴定玉米大斑病菌合成铁载体的类型并利用AntiSMASH网站预测其生物合成基因簇,利用玉米大斑病菌孢子不同发育时期的转录组数据及qRT-PCR分析病菌侵染过程中铁载体合成基因簇中各关键基因的表达水平以及外源铁浓度对基因表达的影响。结果表明,玉米大斑病菌产生异羟肟酸盐型铁载体,在基因组中鉴定得到1个产生异羟肟酸盐铁载体的次级代谢物生物合成基因簇,由非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)编码基因StNPS6为核心的12个铁载体合成相关基因组成。在玉米大斑病菌孢子萌发和侵染玉米叶片的过程中,基因簇中多个基因表达显著上调。与菌丝时期相比,侵染6 d后StNPS6表达量上调5.52倍,侵染9 d时后辅助合成基因StrhbE表达量上调24.12倍,编码转运相关蛋白的基因Stpmd1上调19.95倍。同时发现富铁和贫铁均对病菌的生长具有一定的抑制作用,且富铁情况下病菌黑色素合成受阻,培养基中铁含量差异导致基因簇中多个基因表达量显著变化,尤其是转运相关蛋白基因Stpmd1在富铁条件下表达量上升73.28倍。本研究为解析玉米大斑病菌铁载体的潜在作用提供了参考。

• 玉米大斑病菌转录因子StbHLH10基因的克隆及其功能分析

  韩丹, 张心雨, 王小敏, 肖怡铭, 裴智勇, 谷守芹, 刘玉卫, 巩校东

  碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)转录因子家族广泛参与植物病原真菌的生长发育和侵染致病过程。StbHLH10是玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)中编码bHLH类转录因子的基因,为了解该基因的功能,本研究以玉米大斑病菌为材料克隆了StbHLH10 (GenBank No. XP_0080332037.1) CDS全长,并对其序列和结构特征进行了分析。结果显示,该基因CDS全长1 659 bp,编码552个氨基酸,其编码的蛋白质序列在第335~441位氨基酸残基处含有1个HLH保守结构域,由2个α-螺旋和1个Loop环构成特定空间结构;表达模式分析显示,StbHLH10基因的表达量随着病菌侵染玉米叶片的时间延长而增加;通过构建其调控网络发现,StbHLH10可能通过调控33个下游靶基因的表达参与病菌的生长发育和侵染过程;原核诱导表达分析发现,在28 ℃诱导6 h条件下StbHLH10-His融合蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达,分子量为78.5 kD,与理论值一致,并通过镍柱亲和层析获得该转录因子可溶性的纯化蛋白。本研究初步探究了StbHLH10转录因子的功能,为进一步研究该基因的作用机制提供数据支持。

• 中国北方玉米产区玉米大斑病菌交配型组成及其分布分析

  王超红, 张璐, 郭正宇, 阎晓光, 刘欣芳, 刘宁, 曹志艳, 董金皋

  玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)可危害玉米(Zea mays)叶片、叶鞘和苞叶等,导致玉米产量降低和品质下降,进而造成严重的经济损失,玉米大斑病已成为我国玉米上最重要的真菌病害之一。玉米大斑病菌有3种交配类型(mating type, MAT),分为仅含StMAT1-1基因的A交配型、仅含StMAT1-2基因的a交配型和同时含有2个基因的Aa交配型。在我国,玉米大斑病菌交配型组成及分布在年度和地域间存在明显差异,导致病菌遗传变异频繁。为明确中国北方玉米产区不同年份该病菌交配型组成及其分布,本研究利用玉米大斑病菌交配型鉴定特异引物对2018~2022年间采自中国陕西、山西、河南、河北、甘肃、黑龙江、宁夏、内蒙古、辽宁、吉林10个省份(自治区)的365株玉米大斑病菌进行交配型测定。结果显示A交配型菌株61株、a交配型菌株224株和Aa两性交配型菌株80株,分离频率分别为16.71%、61.37%和21.92%,说明a交配型为我国北方玉米产区的主要交配型;不同年份间玉米大斑病菌群体交配型的出现频率差异不大,a交配型在2018、2019、2020、2021、2022年的分离频率分别为61.73%、72.50%、55.74%、58.65%和63.29%,均为优势交配型。不同地区玉米大斑病菌交配型组成存在差异,在黑龙江省未分离到A交配型菌株,其余9个省份(自治区)均有A、a和Aa 3种交配类型的分布,但各地区间不同交配型菌株的分布频率存在差异,a交配型的菌株在黑龙江省出现频率最高,为87.50%,A交配型的菌株在陕西省出现频率最高,为26.67%,Aa交配型的菌株在内蒙古和吉林省出现频率最高,均为33.33%,表明玉米大斑病菌群体交配型存在多样性。本研究进一步阐明了中国北方玉米产区大斑病菌交配型组成与分布情况,为病菌变异趋势分析及有效防治提供了借鉴。

• 单细胞转录组测序技术及其在动物骨骼研究中的应用

  刘哲, 田学凯, 何玉琳, 杨培钰, 于太永

  骨骼是动物机体重要部分,在提供生物力学支持、维持运动、造血和钙稳态等方面发挥重要作用。普通转录组测序(bulk RNA sequencing, bulk RNA-seq)在骨骼研究中的应用已为骨细胞的发育研究提供了重要参考,但仍有局限性,无法揭示骨骼细胞的异质性。近年来兴起的单细胞转录组测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技术在细胞捕获效率和存活率等方面都得到了极大的提高,研究人员可以在群体细胞中以单个细胞的角度解读生物学信息,为研究骨骼细胞间异质性信息和细胞群体之间的关系提供了新的研究策略。本文就单细胞转录组测序技术及其在动物骨骼研究中的应用进展进行综述,以期为后续的研究提供参考。

• 内质网应激对骨骼肌细胞影响的研究进展

  刘颖, 石建凯, 郭肖蓉, 林晓, 周荣

  骨骼肌对人体和畜禽均有重要意义,与身体机能及畜禽的产肉性能直接相关。当细胞受到外界刺激或内环境发生改变时,内质网(endoplasmic reticulum, ER)会引发一系列保护机制—内质网应激。内质网应激反应具有双向作用, 适当的内质网应激会通过自噬、未折叠蛋白反应等行为缓解细胞对生存条件的不适应性, 但是不利因素引起的持续内质网应激会影响内质网的功能, 进而促进细胞凋亡。本文主要针对近年来内质网应激对骨骼肌细胞脂质代谢、细胞自噬凋亡、分化等生理过程的影响及作用机制进行综述,旨在为进一步揭示内质网应激对骨骼肌细胞的作用机制提供理论依据。

• 同义密码子使用模式控制核糖体扫描节律的分子机制

  高明阳, 吴玉湖, 杨宣叶, 王进千, 胡欣妍, 周建华

  翻译过程中新生多肽链的正确折叠是蛋白质具备生物学活性的基石,但往往新生多肽链正确形成空间构象需通过共翻译折叠机制才能实现。在核糖体翻译mRNA序列时同义密码子使用模式的生物遗传学效应至关重要。越来越多的研究表明,虽然同义密码子使用模式的改变不能影响多肽的氨基酸组成,但其使用模式的偏嗜性对相同多肽链空间构象的影响深远,特别是在调控核糖体翻译过程中的运动节律方面。本综述旨在说明同义密码子使用模式在翻译过程中的重要作用及其对翻译动力学的影响机制,同时明确其在蛋白质能否正确折叠成天然构象过程中的重要作用。同义密码子也与许多疾病有重要联系,本文为蛋白质合成以及核糖体运动节律失调所致疾病的相关研究提供思路。

• 菰黑粉菌细胞核和线粒体的荧光标记菌株构建

  汤近天, 杨芙容, 章蕾蕾, 李钰康, 张雅芬, 傅慧兰, 夏文强, 崔海峰, 叶子弘

  菰(Zizania latifolia)的茎部膨大形成可食用的茭白,与菰黑粉菌(Ustilago esculenta)的侵染有关,而侵染与否取决于菰黑粉菌的二型态转换。在二型态转换过程中,细胞核与线粒体的变化动态仍然未知。本研究将定位于细胞核的组蛋白H1编码基因和线粒体定位信号(mitochondrial targeting signa, MTS)编码序列,分别连接GFP和mCherry荧光蛋白基因后,构建细胞核和线粒体荧光标记载体。采用根癌农杆菌介导遗传转化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT),以菰黑粉菌野生型菌株UeT14和UeT55为出发菌株来进行遗传转化,得到细胞核或线粒体中稳定表达红、绿色荧光蛋白的重组菌株：UeT55-H1-GFP、UeT14-H1-mCherry、UeT55-MTS-GFP和UeT14-MTS-mCherry。在UeT55-H1-GFP和UeT14-H1-mCherry菌株中,孢子中央有明亮的荧光点,与DAPI染色所形成的蓝色荧光共定位。在UeT55-MTS-GFP、UeT14-MTS-mCherry菌株中,孢子内可见小点状荧光,且绿色荧光与MitoTracker形成的红色荧光共定位。本研究获得了细胞核及线粒体能稳定表达荧光蛋白标记的菰黑粉菌,为研究菰黑粉菌生长发育、融合和侵染的分子机制提供了重要的参考和材料。

• 菌核青霉SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

  宋嘉仪, 张海霞, 齐是, 张纪利, 陈东豪, 韦建玉, 黎平, 陈泽鹏, 颜健

  菌核青霉(Penicillium sclerotiorum)是青霉属中一种具有很高生物活性的内生真菌,其产生的次级代谢产物具有一定的生物防治潜力,已在医学、农业等领域有广泛的应用。本研究以马齿苋(Portulaca oleracea)植株中分离纯化而来的菌核青霉为材料,针对其特异性保守序列设计引物,将目的片段通过分子克隆技术连接至pBM73-T载体中构建重组质粒为阳性标准品,选用SYBR GreenⅠ染料法建立菌核青霉实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,PCR扩增后只有菌核青霉产生条带,青霉属的波兰青霉(P. chrysogenum)和产黄青霉(P. polonicum)均无条带产生,且未检测到其熔解曲线和扩增曲线,说明该方法具有很强的特异性。以重组质粒作为标准品构建的标准曲线,其循环阈值(Ct)与模板浓度在2.35×103~2.35×1010 copies/μL间有良好的线性关系,所得到的标准曲线为y=-3.211x+39.42,相关系数R2=0.999 3,组内和组间变异系数均低于5%。土壤样品检测结果表明,该方法可以灵敏地检测到环境样本中的菌核青霉及其数量,具有较好的应用潜力。本研究建立的方法具有良好的特异性、重复性及实用性,可用于探究菌核青霉在植株和土壤中的定殖情况,量化植物不同组织及土壤中菌核青霉数量。本研究为菌核青霉促生及抗性机制研究提供一定的数据和理论支持。

• 表达E7蛋白的重组减毒李斯特菌在小鼠宫颈癌模型中的治疗效果

  潘晓欣, 崔明珠, 罗亚如, 孙静, 程昌勇, 王晶, 宋厚辉

  单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种能在细胞间迁徙繁殖并能促进抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞增殖产生适应性细胞免疫的优质候选疫苗活载体。本课题组发现新型减毒李斯特菌(attenuated Listeria monocytogenes, LAM)较野生型李斯特菌的溶血能力和增殖能力均显著降低的同时仍可正常分泌李斯特菌溶血素O (Listeriolysin O, LLO)蛋白。为了研究LAM的安全性及其对宫颈癌特异性抗原E7蛋白的递送与免疫效果,本研究在小鼠(Mus musculus)模型上检测了LAM的毒力,并对LAM-E7重组菌株在小鼠宫颈癌免疫治疗和预防中的作用进行了评价。结果显示,LAM对小鼠的毒力是野生型李斯特菌毒力的1/8709,且小鼠脏器中的LAM可在一周内被清除。本研究通过同源重组的方法将E7基因整合到LAM基因组上,PCR鉴定结果显示,LAM-E7菌株构建成功。Western blot结果显示,E7蛋白能够与LLO在重组菌株中融合表达并释放。通过对LAM-E7的体外生长能力和溶血活性分析发现,融合后对LAM的生长能力和溶血能力无显著影响,表明E7蛋白的融合不会影响LAM的安全性。通过腹部皮下注射方式构建小鼠宫颈癌模型发现,LAM-E7组小鼠肿瘤平均体积(161.1202 mm3)显著小于LAM组(349.4625 mm3)和PBS组(512.4149 mm3)(P<0.01),说明接种LAM-E7对肿瘤生长具有显著的抑制作用。经免疫预防试验发现,LAM-E7组小鼠肿瘤平均体积(3.86 mm3)显著小于LAM组(172.67 mm3)和PBS组(57.38 mm3)(P<0.001),表明LAM-E7对宫颈癌有一定的预防效果。本研究证实LAM-E7对小鼠宫颈癌具有良好的治疗和预防效果,为减毒李斯特菌作为疫苗载体用于宫颈癌治疗提供了新的思路,也为今后宫颈癌治疗疫苗的研发提供数据支持。

• 展示口蹄疫病毒优势中和表位的铁蛋白纳米颗粒制备及其在小鼠模型上的免疫原性评价

  卢炳州, 茹毅, 郝荣增, 李亚军, 杨洋, 杨锐, 毛玉涵, 蒋成辉, 陶世宇, 郑海学, 余四九, 崔燕

  蛋白纳米颗粒能够在表面展现多拷贝抗原,模拟病毒的结构形态,更有利于免疫细胞摄取和促进抗原递呈,从而增强疫苗保护效力。本研究旨在利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统制备展示口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)优势中和表位的铁蛋白纳米颗粒,并评估其免疫原性。首先以幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)铁蛋白序列为基础,将FMDV优势中和表位序列插入铁蛋白第33和34位氨基酸之间,同时将耶尔森氏菌属(Yersinia) T细胞表位序列插入铁蛋白氨基酸序列的氨基末端,构建具有铁蛋白序列、B细胞表位(优势中和表位)和T细胞表位的重组表达质粒pET28a-FBT,以仅插入铁蛋白序列的重组质粒pET28a-Fer作为对照。将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞,经诱导表达和分子筛层析纯化获得目的蛋白,利用SDS-PAGE、Western blot、粒径分析和透射电镜进行鉴定,进一步免疫BALB/c小鼠(Mus musculus)评价免疫原性。结果显示,利用大肠杆菌表达系统成功制备的铁蛋白纳米颗粒FBT可与FMDV阳性血清发生特异性反应;FBT免疫14 d即产生血清抗体,并持续升高,在免疫35 d中和抗体效价最高可达1∶128;同时,FBT免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖水平和白介素2 (interleukin 2, IL-2)、IL-4、IL-10、干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)分泌水平显著高于对照组(P<0.05)。本研究制备了展示FMDV中和表位且具有良好免疫原性的铁蛋白纳米颗粒,为新型口蹄疫基因工程疫苗的研制提供技术支持。