农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2023年第5期

• Hotspot 突变介导的油菜 EPSPS 草甘膦抗性改造与功能验证

  柯达, 何云浩, 吴方, 曾玉兰, 华雨, 戴成, 吴高兵

  草甘膦通过抑制植物5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS),无选择性地杀死绝大多数草本植物。通过转基因策略,将对草甘膦具有抗性的 EPSPS 酶编码基因转入作物,可培育耐草甘膦的作物。当前商业应用的抗草甘膦 EPSPS 主要来源于微生物,这种“跨界”的基因转移更容易引发人们对转基因安全的顾虑。因此,改造作物自身的 EPSPS 酶,进而利用内源基因培育耐除草剂作物,具有较大的应用价值。本研究通过构建甘蓝型油菜(Brassica napus) EPSPS 突变热点 (Hotspot)小型突变体文库, 进而筛选高抗草甘膦的突变体。结果显示, 获得了5个对除草剂抗性提高的突变体,其中突变体 mBnEPSPS 表现出最高的草甘膦抗性。相对于野生型 BnEPSPS,突变体催化常数 kcat 由 515/s 下降到 257/s,酶活下降了 50%。 草甘膦抑制动力学分析表明, 存在草甘膦时, mBnEPSPS 与 BnEPSPS 转换数 kcat(gly)分别为116/s和13/s,突变体对草甘膦的抗性提高了8.9倍。酶学性质分析表明突变基本不改变酶对植物细胞微环境的适应性。mBnEPSPS转入烟草 (Nicotiana benthamiana)后, 能够使烟草耐受5倍于商业推荐剂量的农达(41% 草甘膦异丙胺盐)处理, 这一结果表明 mBnEPSPS 具有较高的育种应用价值。本研究为通过转基因和基因编辑培育抗除草剂油菜提供了基因资源和理论指导。

• 基于转录组学分析性别、月龄对荷斯坦牛网膜脂肪组织炎症相关基因表达的影响

  柴金宝, 刘利, 王芳, 杨硕, 曹培丽, 赵晓川, 许珊珊, 孟详人, 卜也, 岳萌萌, 武瑞, 孙芳

  公牛(Bos taurus)去势和长期育肥能够促进内脏脂肪的沉积,过多的脂肪沉积易引发机体慢性炎症,然而有关牛网膜脂肪组织炎症的分子机理研究相对较少。本研究以牛网膜脂肪组织为研究对象,旨在探究性别和月龄对荷斯坦育肥牛网膜脂肪组织炎症相关基因表达的影响。选择16月龄荷斯坦公牛(BF16)、阉牛(SF16)及26月龄阉牛(SF26)各3头,测定生长和血液生化指标,屠宰后采集网膜脂肪组织,进行组织切片苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)染色,采用 RNA-seq 技术对3组牛网膜脂肪组织进行转录组学分析,筛选组间差异基因,并对差异基因进行GO功能注释和KEGG富集分析、qPCR验证、候选基因筛选及蛋白网络互作分析。结果显示,共得到1 173个组间差异表达基因, 富集在8个基因表达趋势模式中;功能分析显示差异基因富集多个与炎症相关的生物学过程和信号通路;随机选择6个差异表达的基因进行qPCR验证,表达趋势与转录组测序结果一致,表明测序结果可靠;筛选到与炎症相关的5个生物学过程条目和5个信号通路共50个非冗余基因,聚类分析发现,与BF16组相比,去势能够上调SF16组网膜脂肪组织中抗炎症和促脂肪细胞分化基因(如TNF-α诱导蛋白3(TNF alpha induced protein 3, TNFAIP3), 骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP2)等)的表达,下调促炎症基因(如白细胞介素1β (interleukin-1beta, IL1B))的表达; 与 BF16 和 SF16 组相比, 长期育肥能够上调 SF26 组网膜脂肪组织中衰老和慢性炎症相关的基因(如半乳糖凝集素3(galectin 3, LGALS3), C-C 基序趋化因子受体7(C-C motif chemokine receptor 7, CCR7)等)的表达。蛋白网络互作分析显示 IL1B 为关键中心节点。本研究结果为优化利用荷斯坦阉牛生产大理石纹牛肉技术提供理论依据。

• CaMV 35S 增强子调节玉米基因表达的机制研究

  郭金洁, 张丹, 张伟, 张方东, 杜邓襄

  玉米(Zea mays)是重要的粮食作物、饲料来源和工业原料等,随着生物技术的发展,转基因等新型技术在玉米育种中的应用越来越广泛。花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus, CaMV)启动子 CaMV 35S 及其增强子广泛应用于玉米等作物的转基因操作中,因此,研究 CaMV 35S 增强子的的作用机理对于今后的应用具有重要的理论价值。本研究从已经获得的玉米激活标记突变体库中筛选出突变体材料,在分离突变位点在染色体上分布的基础上,利用qPCR分析了转座子插入位点上游和下游约100 kb 范围内基因的时空表达变化。结果表明,CaMV 35S 增强子显著上调了邻近基因的表达(P<0.05),转录增加的基因分布在转座子插入位点的上下游,激活距离可达 63.7 kb。在上调表达的4个基因中, 基因表达水平增强呈剂量依赖性,纯合突变体的表达显著高于杂合突变体(P<0.05)。CaMV 35S 增强子虽然提高了玉米突变体基因的转录水平,但并未显著改变基因在不同组织中的表达模式。CaMV 35S 增强剂在玉米中的作用范围、剂量效应和组织特异性为后续在玉米分子生物学和基因工程中的应用提供了实验依据,也为 CaMV 35S 启动子在其他植物中的应用提供了借鉴。

• 木豆 NAC 家族基因鉴定及其在真菌侵染下的响应分析

  张修齐, 吴睿, 董碧莹, 杜婷婷, 宋治华, 李娜, 曹红燕, 杨清, 孟冬

  NAC (NAM, ATAF1/2 和 CUC2)转录因子家族是具有保守 NAC 结构域蛋白的统称, 在植物生长、发育和应激反应等生命活动中发挥关键调控作用。本研究利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)的 NAC 家族基因,通过序列比对,从木豆(Cajanus cajan)基因组中初步鉴定了 90 个 CcNAC 候选基因,系统发育分析显示, 90 个 CcNAC 基因可分为 13 个亚族, 根据拟南芥基因功能的研究, 筛选到 Group 1~4 亚族中, 共 24 个 CcNAC 家族基因为潜在的生物胁迫响应基因。对 24 个 CcNAC 家族基因进行理化性质和启动子顺式作用元件分析,结果表明,启动子区域含有包括多种植物激素响应元件,可能与激素信号调控密切相关, 具有潜在的响应生物与非生物胁迫的功能。转录组分析结果显示, 在茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)处理 12 h 时,13 个 NAC 基因显著上调表达,5 个 NAC 基因显著下调表达,其中 CcNAC55 在处理 3、6 和 12 h 时均显著上调,且在 6、12 h 时表达水平最高。进一步利用半定量 PCR 检测发现,CcNAC55 在真菌 Cc1-1 胁迫时持续显著上调, 而在高温胁迫时没有明显差异, 说明 CcNAC55 在木豆抵御生物胁迫的反应中可能发挥重要作用。为了验证 CcNAC55 应对生物胁迫的功能,本研究利用真空渗透转化法建立了过表达 CcNAC55 的木豆株系,并在叶片上接种致病真菌 Cc1-1,结果显示,CcNAC55 过表达可以显著降低木豆叶片的侵染率和侵染面积比率。本研究为木豆 NAC 基因功能的研究了提供参考,将有助于鉴定和选择与生物胁迫耐受性相关的候选基因。

• 桂花 AQP 基因家族鉴定及在花开放阶段的表达分析

  周杰, 钟诗蔚, 方遒, 董彬, 王艺光, 肖政, 赵宏波

  水通道蛋白(aquaporin, AQP)是一种小分子膜内在蛋白,介导细胞与介质之间快速且被动的水分运输。本研究以桂花(Osmanthus fragrans) 为材料,基于桂花基因组数据库,依据非冗余蛋白库 (non- redundant protein sequence database, Nr)注释筛选获得桂花 AQP 家族 41 个成员的基因序列,通过系统进化分析将其划分为4个亚族：16个质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins, PIP)、14 个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins, TIP)、8 个类 NOD26 膜内在蛋白(nodulin-26-like intrinsic proteins, NIP)和3个小分子碱性膜内在蛋白(small intrinsic proteins, SIP)。同一亚族成员在基因结构和保守基序等方面具有较高保守性, 其编码蛋白长度为 145~432 个氨基酸; 分子量为 14.81~45.90 kD;等电点为 4.84~9.81。 qPCR 分析 OfPIPs 和 OfTIPs 在桂花不同组织中的表达模式发现,OfPIP1、OfPIP5、OfPIP12、OfPIP13、 OfPIP14、OfPIP15、OfPIP16、OfTIP1、OfTIP3、OfTIP4、OfTIP6、OfTIP9 和 OfTIP13 在花中呈现特异性表达, 进一步对其在桂花花开放进程中的表达模式研究发现,OfTIP6 在花开放前期(S1~S2)有较高转录,推测其对花开放初期液泡的扩展发挥重要功能。而 OfPIP1、OfPIP13、OfPIP14、OfPIP15、OfPIP16 和 OfTIP13 在桂花花开放的后期(S4~S5)相对表达量显著上调(P<0.05),推测这6个基因是在花开放后期行使功能的关键基因。本研究为进一步解析 OfAQPs 蛋白的生物学功能提供参考。

• 金鱼草 AmFIM 基因在龙葵中的表达和对其花发育的影响

  冯丽君, 陈柯俐, 郝燕敏, 李菲菲, 崔敏龙, 朴春兰

  UFO (unusual floral organs)基因及其直系同源基因在调控花分生组织确定性和花器官的发育中具有重要作用,其功能在多个物种中都已得到揭示。AmFIM (AmFimbriata)基因作为最早克隆的 UFO 类基因,与其他UFO类基因相比在功能和基因相互作用方面具有一定的差异性,此外,其在金鱼草(Antirrhinum majus)中的研究局限于转座子介导的突变体, 因此 AmFIM 基因的功能还需进一步的验证与完善。本研究将 pBI35S::AmFIM 过表达载体在茄科龙葵(Solanum nigrum)中异源转化,通过形态学观察发现, 转基因龙葵植株表现出明显的矮化、早花的表型, 且 AmFIM 基因表达量的差异对龙葵聚伞花序和花器官产生不同的影响。弱表型株系中,每个花序中花数目减少,顶端花序结构复杂,花器官与野生型相比无明显差异;强表型株系中,聚伞花序转变为单花,花器官发生同源异型转化,即萼片出现花瓣状组织,雄蕊出现花瓣状组织,心皮出现雄蕊状结构,此外还出现了花器官的融合,表现为萼片和花瓣融合,花瓣和雄蕊融合。通过石蜡切片进一步观察强表型转基因龙葵雄蕊样心皮的内部结构,发现具有类似花药的组织。结果表明,AmFIM基因在龙葵中的过表达主要影响龙葵的花序结构和花器官的发育,AmFIM在调控花分生组织确定性、花器官分化和维持花器官边界等方面具有重要功能。本研究进一步完善了 AmFIM 基因的研究内容,为 UFO 类基因的分子调控机制提供了参考。

• 基于转录组测序的上部烟叶遮阴响应解析

  张霞, 李国明, 李斌华, 陈燕, 陆引罡, 刘丽

  烟草(Nicotiana tabacum)为喜光作物,遮阴可影响其生长。为深入了解烟草遮阴胁迫下的响应机制,探讨遮阴对烟草叶片光合生理的影响及烟叶转录组的变化,本研究以'云烟 87'为供试材料,对自然光照和 40% 遮光率两个处理组进行烟叶中叶绿素含量和光合参数的测定,并对烟叶进行转录组测序。结果表明, 与对照比较, 遮光处理组上部烟叶的光合色素—叶绿素 a (chlorophyll a, Chla)、Chlb、类胡萝卜素、 Chla+Chlb 含量增加(P<0.05),Chla/Chlb 没有显著变化; 光合参数—净光合速率(net photosynthetic rate, Pn)显著下降(P<0.05),气孔导度(stomatal conductance, Gs)、蒸腾速率(transpiration rate, Tr)和胞间 CO2 浓度(intercellular CO2 concentration, Ci)没有显著变化。转录组数据分析显示,对照组和遮光处理组之间共有 10 110 个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),其中4 438 个上调表达、5 672 个下调表达。GO 分析显示, DEGs 与结合、催化活性、细胞部分、膜部分、细胞过程、代谢过程等条目密切相关。 KEGG 分析显示,DEGs 主要富集在光合作用-天线蛋白、植物激素信号转导、吞噬体、谷胱甘肽代谢、淀粉和蔗糖代谢、甘油脂代谢、卟啉和叶绿素代谢等代谢通路。对于光合作用相关基因,遮光处理提高光系统Ⅰ(photosystem Ⅰ, PSA)和光系统Ⅱ(photosystemⅡ, PSB)的部分基因表达, 而 PsaB、PsbS、PsbR 等基因下调表达,与光合电子传递途径及 F 型 ATP 酶相关的基因下调表达;对于卟啉和叶绿素代谢相关基因,与叶绿素合成相关的基因均上调表达, 与叶绿素降解相关的基因下调表达。qRT-PCR 验证实验结果显示, DEGs 的表达趋势与 RNA-seq 结果高度一致。本研究为抗逆分子在烟草种植和新品种选育中的应用提供实验依据。

• CIDEA 基因对奶牛乳腺上皮细胞脂代谢相关基因表达及甘油三酯合成的影响

  赵欣, 姚大为, 赵淑颖, 杨春蕾, 张漫, 陈成彬, 马毅

  诱导细胞死亡的 DNA 片段化因子-α 样效应物 A (cell death-inducing DNA fragmentation factor α- like effector A, CIDEA)是一种脂滴(lipid droplet, LD)相关蛋白,在哺乳期的乳腺中高度表达,介导小脂滴变成大脂滴并促进甘油三酯(triglyceride, TAG) 的积累。为了检测CIDEA 基因对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells, BMEC)中脂代谢相关基因表达及 TAG 合成的影响,本研究通过 qPCR 技术检测奶牛(Bos taurus)干奶期和泌乳盛期乳腺组织中的 CIDEA 基因表达变化;设计合成靶向 CIDEA 基因的siRNA检测脂代谢相关基因的表达;利用 TAG 试剂盒检测细胞内 TAG 的含量。结果表明,通过克隆得到全长 660 bp 的奶牛 CIDEA 基因(GenBank No. MW960011)的 CDS 区序列; 对其进行了生物信息学分析发现,奶牛 CIDEA 基因核苷酸序列与婆罗门牛(B. indicus)(GenBank No. XM_019986952.1)、牦牛(B. mutus) (GenBank No. XM_005892367.1)、印度水牛(Bubalus bubalis)(GenBank No. XM_006043025.3)的同源性分别为 99.73%、99.46% 和 98.52%,氨基酸序列同源性均在 95% 以上;qPCR 检测发现,CIDEA 基因在奶牛泌乳盛期的表达量是干奶期的 1.5 倍;在 BMEC 中转染 siRNA,干扰效率达到 95% 以上;干扰 CIDEA 基因后, 显著下调了脂肪酸从头合成相关基因固醇调节元件结合蛋白1(sterol-regulatory element binding proteins 1, SREBF1)、乙酰辅酶 A 羧化酶 α (acetyl-CoA carboxylaseα, ACACA)的表达, 同时抑制了 TAG 合成相关基因二酰甘油酰基转移酶1(diacylglycerol O-acyltransferase 1, DGAT1)、DGAT2、脂素1(lipin 1, LPIN1)和脂肪酸转运相关基因心脏脂肪酸结合蛋白3(heart fatty acid binding protein 3, FABP3)、人类白细胞分化抗原36 (cluster of differentiation 36, CD36) 的表达 (P<0.05),并且促进了甘油三酯水解酶(adipose triglyceridelipase, ATGL)的表达(P<0.05);CIDEA 干扰后, BMEC 内 TAG 含量显著下降(P<0.05)。综上所述, CIDEA 基因在调节 BMEC 脂代谢相关基因及TAG 合成方面发挥着重要的作用。本研究进一步明确乳脂代谢的调控机理,对奶牛产业的健康发展具有重要的理论和实践意义。

• LPA 对牦牛卵丘细胞主要卵源因子表达的影响

  刘斌, 王靖雷, 高丽青, 许瑞华, 张倩, 王萌, 王立斌, 余四九, 徐庚全, 潘阳阳

  一定浓度的溶血磷脂酸(lysobisphosphatidic acid, LPA)可以促进卵母细胞成熟,而卵丘细胞以及卵源因子(oocyte-secreted factors, OSFs)能够保障卵母细胞生长发育及功能的正常发挥。本研究旨在对卵丘细胞所分泌的卵源因子受到外源性溶血磷脂酸的调控后,其表达量的变化进行研究。以体外培养的牦牛(Bos grunniens)卵丘细胞为研究对象;添加外源性 LPA (0, 5, 15, 30 和 50 µmol/L)进行调控,采用 PCR、 qPCR、Western blot 及间接免疫荧光等方法,检测经 LPA 调控后卵丘细胞分泌的 OSFs 的表达变化。qPCR 结果显示：当添加的 LPA 浓度为 15 µmol/L 时,生长分化因子9(growth differentiation factor 9, GDF9)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGF10) mRNA 的相对表达水平达到最高,浓度大于 15 µmol/L 时, GDF9 和 FGF10 mRNA的表达水平降低。LPA浓度为30µmol/L时,骨形态发生蛋白1(bone morphogenetic proteins 1, BMP1) 和 BMP15 mRNA的相对表达水平达到最高,浓度大于30 µmol/L 时, BMP15 mRNA 的表达水平降低, BMP1 mRNA 的相对表达水平变化不显著。Western blot 结果显示: 当LPA 浓度为 30 µmol/L 时, GDF9、BMP1、BMP15 蛋白的相对表达水平最高,浓度大于30 µmol/L 时, BMP1、BMP15 蛋白的表达水平降低,而 GDF9 蛋白的表达受到抑制。相比较其他 OSFs 蛋白对 LPA 的应答,在一定 LPA 浓度范围内,FGF10 蛋白相对表达水平与 LPA 的浓度之间呈现剂量依赖性。免疫荧光结果显示：0 µmol/L 处理组 OSFs 在卵丘细胞的荧光标记主要集中在细胞质和细胞核, 而 LPA 处理后的样本,OSFs 在卵丘细胞细胞质中的荧光标记明显增强。本研究证实,在牦牛卵丘细胞体外培养过程中,外源性 LPA 能够在基因与蛋白水平上调节 OSFs 在卵丘细胞中的表达,添加适当浓度的 LPA 能够增加卵丘细胞相关细胞因子的分泌,进而对卵母细胞的发育进行调节。本研究对于构建牦牛以及其他哺乳动物卵母细胞成熟的体外培养模式具有借鉴意义。

• 基于转录组测序技术对哈萨克马产奶量相关差异表达 lncRNA 的研究

  马应国, 梁金超, 马海玉, 刘玲玲, 刘武军

  长链非编码 RNA (long-chain non-coding RNA, lncRNA)已成为几乎所有基因功能和调控水平的重要参与者。为了揭示 lncRNA 对泌乳前期马(Equus caballus)产奶量的潜在作用,本研究选取8匹 3~4 岁体型相似、处于泌乳前期的健康哈萨克马,根据产奶量高低分为高产奶量组(H)和低产奶量组(L),利用转录组测序技术对2组马匹乳进行非编码 RNA 测序。通过 GO 和 Pathway 功能显著性富集分析来确定差异表达基因行使的主要生物学功能和参与的生化代谢途径及信号途径。按照 P<0.05、FC≥1 筛选出差异表达 lncRNA 并对差异表达 lncRNA 进行后续的功能研究。结果表明, 在泌乳前期高产组和低产组的哈萨克马乳中共发现30个差异表达lncRNA ( 上调16个,下调14个)。从中筛选出血管内皮生长因子-D (vascular endothlial growth factor, VEGFD)、磷脂酰肌醇聚糖类A(phosphatidylinositol glycan, class A, PIGA)、乌头酸酶 -1 (aconitase closing odor, ACO1) 等与乳腺发育及泌乳相关的基因。研究结果表明,lncRNA 可能通过靶向乳腺发育和泌乳相关基因来调控泌乳或乳腺发育的过程。本研究为 lncRNA 在马育种工作中的应用提供参考。

• PMSG 联合 GnRH 对小鼠胚胎着床的影响

  李桂琳, 袁文, 杨静怡, 李相运, 吴兴龙

  孕马血清促性腺激素 (pregnant mare serum gonadotropin, PMSG) 联合促性腺激素释放激素 (gonadotropin-releasing hormone, GnRH)通过刺激小鼠(Mus musculus)卵巢可提高繁殖效率,但是其对胚胎着床的影响尚不明确。本研究旨在探讨PMSG联合GnRH方案对小鼠胚胎着床的影响。实验组腹腔注射7.5 IU PMSG,48 h 后再注射 3.5 µg GnRH 类似物亮丙瑞林(简称 P+G 处理组),对照组注射生理盐水;将正常囊胚移植到假孕小鼠子宫中,5 d 后比较不同处理组胚胎移植后的着床率,检测着床期子宫内膜容受性标记分子—白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, Lif)的基因表达;采用转录组数据分析 P+G 处理对子宫内膜容受性的影响,利用 qRT-PCR 和 Western blot 验证测序结果的准确性。结果显示,P+G 假孕受体的胚胎着床率显著低于对照组(P<0.05),并且 P+G 处理的子宫内膜容受性标记基因 Lif 表达显著降低 (P<0.05)。转录组测序分析发现 751 个差异表达基因, 其中 587 个上调表达 、164 个下调表达; GO 和 KEGG 分析显示,P+G 处理后差异表达基因主要富集在免疫反应、调节免疫系统过程、细胞黏附分子通路以及细胞因子间的相互作用通路;qRT-PCR 和 Western blot 验证结果显示,P+G 处理使 Lif 基因及蛋白表达均下调, Lcn2 和 Prap1 基因及蛋白表达均上调, 变化趋势与转录组测序结果一致。本研究为深入探讨 PMSG 和 GnRH 参与胚胎着床的调控机制提供一定的理论基础。

• 鸡 E2F1 和 TBP 蛋白的相互作用及其基因组织表达特性分析

  唐宏, 王燕碧, 赵采芹, 王小亚, 石海英, 邢静如, 段志强

  E2F 转录因子1(E2F transcription factor 1, E2F1)和 TATA 结合蛋白(TATA-binding protein, TBP) 共同参与了基因转录调节。为探究鸡(Gallus gallus) E2F1 和 TBP 蛋白的相互作用及其基因组织表达特性,本研究通过构建鸡 E2F1 和 TBP 基因的重组真核表达载体,共同转染人胚胎肾细胞(HEK-293T)后,利用间接免疫荧光和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)实验验证两者的相互作用;采用 qPCR 检测鸡 E2F1、TBP 基因在胚胎发育 14 d (E14 d)、出壳后1日龄(H1 d)、7 日龄(H7 d)和 14 日龄(H14 d)不同组织中的表达情况。结果表明,成功构建了鸡E2F1 和 TBP 基因的重组真核表达载体pCMV-HA-E2F1、 pCMV-Myc-TBP,其在细胞中得到正确表达且两者均主要定位在细胞核。Co-IP 结果表明, 鸡 E2F1 和 TBP 蛋白存在相互作用。组织表达特性分析表明, 鸡 E2F1 和 TBP 基因在4个阶段的不同组织中均有表达,且其表达水平存在显著差异(P<0.05);在 E14 d 时,E2F1 和 TBP 基因在肺脏中表达较高,在脑组织中的表达较低; H1 d 时,两者在肝脏中表达较高,在脑组织中的表达较低; H7 d 时,两者在脑组织中表达较高,在腿肌中的表达较低;H14 d 时,两者在肺脏、肝脏和心脏中表达较高,在胸肌、腿肌中的表达较低。鸡 E2F1 和 TBP 蛋白在细胞核中存在相互作用,E2F1 和 TBP 基因在4个阶段的多种组织中均有表达,但以肺脏和肝脏中的相对表达较高。本研究为 E2F1 和 TBP 蛋白互作调控鸡肺脏和肝脏组织发育的作用机理提供参考。

• 不同开口饵料对罗非鱼发育早期肠道菌群结构的影响

  范梓健, 张紫玥, 曹建萌, 衣萌萌, 高风英, 可小丽, 刘志刚, 王淼, 卢迈新

  罗非鱼(Oreochromis niloticus)是我国主要的淡水鱼养殖品种之一。了解不同开口饵料对罗非鱼肠道菌群的影响,可为罗非鱼苗的科学培育提供参考资料。本研究利用 16S rRNA 高通量测序技术,分析不同开口饵料对罗非鱼早期肠道组织结构及肠道微生物菌群结构的影响。从罗非鱼雌鱼苗 11 日龄开始分别投喂3种开口饵料：丰年虫(Artemia salina)(FA 组)、25.5% 蛋白水平的高蛋白饲料(FH 组)、16% 蛋白水平的低蛋白饲料(FL 组),饲养 20 d;分别于罗非鱼孵化后 11 (开口前)、20 和 30 d 取样。结果表明,FL组鱼苗的存活率与FA组和FH组存在显著差异 (P<0.05),FA 组最高 ((98.00±0.54)% ),FL 组最低 ((92.00±1.50)%)。肠道组织学观察显示,FL 组肠道皱襞有破损,排列稀疏。高通量测序分析显示,20 日龄的 FA 组罗非鱼肠道菌群丰度和菌群多样性均最低,30 日龄的 FL 组罗非鱼肠道菌群丰度最高,30 日龄的 FA 组罗非鱼肠道菌群多样性最高;在门水平,FA、FH 和 FL 组鱼苗肠道优势菌群为变形菌门(Proteobacteria),在属水平,红杆菌属(Rhodobacter)和花蕾杆菌属(Gemmobacter)占绝对优势;与 FH 和 FL 组相比,FA 组肠道中的红杆菌属和鲸杆菌属(Cetobacterium)相对丰度显著增加(P<0.05);与 FA 和 FL 组相比,FH 组肠道中的气单胞菌属(Aeromonas)和假单胞菌属(Pseudomonas)相对丰度显著增加(P<0.05);与 FA 和 FH 组相比,FL 组罗非鱼肠道中的申氏杆菌属(Shinella)和 Brevifollis 属相对丰度显著增加(P<0.05)。上述结果表明,相比于配合饲料,投喂丰年虫有助于提高罗非鱼鱼苗存活率、改善肠道组织结构,对肠道菌群结构产生有益影响; 高蛋白饲料组的罗非鱼存活率显著高于低蛋白饲料组,与丰年虫组无显著差异,可作为罗非鱼的开口饵料。本研究为罗非鱼鱼苗开口饵料的选择提供了基础资料。

• 2 种规格虹鳟免疫相关基因表达及肠道微生物菌群差异分析

  海强, 王建福, 康维国, 吕娜娜, 刘钰, 刘哲, 成述儒

  传染性造血器官坏死病毒 (Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV) 感染后,小规格虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的发病和死亡率要远高于大规格虹鳟。为了从鱼体肠道、肝脏免疫应答及微生态健康角度阐明产生这种差异的可能机制,在检测有 IHNV 感染的网箱养殖区选取表观正常的大小2种规格虹鳟,利用 qPCR 技术和 16S rDNA 扩增子高通量测序技术对比分析了 Toll 样受体 2/7 (toll like receptor 2/7, TLR2/7)、白细胞介素 -8/18 (interleukin-8/18, IL-8/18)、干扰素 (interferon, IFN)、干扰素调节因子9(interferon regulatory factor 9, IRF9)、抗黏液病毒1(myxovirus resistant 1, MX1)和 vipern (VIG-1)共8个参与机体免疫应答机制相关的基因表达及肠道微生物菌群差异。结果表明: 在检测的8个基因中, TLR7 和 MX1 在小规格虹鳟的肠道内表达量显著高于大规格虹鳟(P<0.05),IL-8 在小规格虹鳟的肝脏中表达量显著高于大规格虹鳟(P<0.05),大规格虹鳟肠道微生物多样性则高于小规格虹鳟。在相对含量大于 1% 的菌群中, 大规格虹鳟肠道内的放线菌门(Actinobacteria)和芽孢菌属(Bacillus)的丰度显著高于小规格虹鳟 (P<0.05),小规格虹鳟肠道中的沙雷氏菌(Serratia)显著高于大规格虹鳟(P<0.05)。综上可得, 小规格虹鳟对环境中可能存在的病毒等致病应激源具有更高的敏感性,肠道微生态系统相较于大规格虹鳟稳定性差,且大规格虹鳟的肠道中存在可能和机体抗病力有关的有益菌丰度更高。本研究阐明了不同规格虹鳟免疫基因和肠道微生物的差异,并为 IHNV 从免疫基因和肠道微生物调节方面的防治提供了理论支持。

• 毛竹和阔叶林凋落物浸提液对土壤微生物及氮矿化的影响

  王兰鸽, 张前前, 赵明水, 苗丹妮, 李永夫, 滕秋梅, 李永春

  亚热带地区降雨淋溶显著影响森林土壤养分循环和植物生长。为探究毛竹(Phyllostachys edulis) 入侵阔叶林生态系统中林下凋落物如何通过水溶性碳、氮释放影响土壤氮矿化过程及其机制,本研究将毛竹和阔叶林凋落物水浸提液添加到阔叶林土壤进行 42 d 培养,研究2种林分凋落物浸提液对土壤净氮矿化(氨化速率, 硝化速率和氮矿化速率)、水解酶(β-葡萄糖苷酶、β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶, 亮氨酸氨肽酶)活性、土壤细菌和真菌丰度以及土壤 pH 的影响。结果表明：与对照相比,加入毛竹林凋落物浸提液可显著促进净氨化速率(9.2%~52.3%)、净硝化速率(8.4%~138.9%)和净氮矿化速率(8.7%~37.9%) (P<0.05),但加入阔叶林凋落物浸提液可显著降低净氨化速率(6.1%~92.1%)和净硝化速率(13.8%~279.7%), 极显著降低净氮矿化速率(15.1%~65.4%)(P<0.01)。与阔叶林凋落物浸提液相比, 毛竹林浸提液添加后显著降低了土壤 pH (P<0.05),显著提升了土壤真菌与细菌丰度比(P<0.05),同时显著促进了 β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶等氮矿化相关酶活性(P<0.05)。相关分析表明,氮矿化速率受土壤 pH、土壤真菌与细菌丰度比、β-葡萄糖苷酶、β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、亮氨酸氨肽酶及不同凋落物浸提液 C/N 的共同调节。本研究表明,入侵植物毛竹可通过其凋落物淋溶液显著提高土壤氮矿化速率,将产生利于毛竹生长的土壤养分环境以促进其入侵进程,本研究为解析毛竹入侵天然林过程中的植物— 土壤互作机制提供了科学依据。

• 组蛋白 H2B 单泛素化在植物生长发育和胁迫应答中的作用

  刘善贺, 潘延云, 李君

  组蛋白 H2B 单泛素化(H2Bub1)是一种进化保守的组蛋白修饰形式,广泛存在于真核生物中,对生物体的生长发育过程至关重要。近年来,大量的研究表明H2Bub1广泛的参与了植物生长、发育及胁迫应答等生物学事件。本文主要介绍H2Bub1在种子休眠、光形态建成、开花时间及组织器官发育等植物生长过程方面的作用;并介绍了其在植物响应生物胁迫和非生物胁迫中的生物学作用,以期为作物遗传改良提供参考。

• 单细胞转录组测序技术及其在动物科学领域的应用

  娄姬英, 郭其新, 毕瑜林, 江勇, 王志秀, 陈国宏, 白皓, 常国斌

  单细胞测序是一个新兴的研究领域,主要包括转录组测序、全基因组测序以及表观基因组测序。 单细胞转录组测序(single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq)是指在单个细胞水平上对 RNA 进行高通量测序和分析的一项新技术。近年来,单细胞相关实验技术发展迅速,目前已被广泛应用于生物及医学领域,主要用于研究生物进化过程、组织器官发育、肿瘤疾病发生和精准医疗诊断等,然而在动物科学领域的研究及其应用相对较少,目前大多停留在对动物生理和进化发育层面的研究。本文就单细胞转录组测序技术方法及其在动物科学领域的引用进行综述,以期为单细胞转录组测序技术的发展及其在动物科学领域的应用提供理论依据。

• 东京四照花盐胁迫响应下实时荧光定量 PCR 内参基因的筛选与验证

  孙大伟, 袁佳秋, 蔡梅, 洑香香

  利用实时荧光定量 PCR 技术(real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)分析基因的表达时, 内参基因的选择对保证研究结果的准确性至关重要。本研究以东京四照花(Cornus hongkongensis subsp. tonkinensis)经过不同盐胁迫时间的根与叶为材料,基于转录组数据,选择9个候选内参基因：18S 核糖体 RNA (18S ribosome RNA, 18S rRNA)、翻译起始因子2(initiation factor 2, IF2)、转录延伸因子1(elongation factor-1α 1, EF-1- α1)、EF-1- α2、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase, APT)、亲环蛋白1(cycloidea1, cyc1)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、GAPDH2 和 β 微管蛋白(β-tubulin, TUB)基因进行 qRT-PCR 扩增。运用 GeNorm、NormFinder 和 BestKeeper3种软件对9个候选内参基因进行表达稳定性分析,最后用 RefFinder 程序综合分析、得出最适的内参基因,并利用目的基因超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)基因进行验证。实验结果表明, 18S rRNA 和 GAPDH 为盐胁迫下东京四照花各组织中表达最稳定的基因, EF-1- α2 是最不稳定的基因。但18S rRNA 的 Ct值较高,意味着18S rRNA 在各个组织中的表达量比GAPDH 低。验证结果也表明以 GAPDH 为内参基因时,目的基因相对表达量与转录组测序结果较为一致。 因此认为 GAPDH 为盐胁迫下东京四照花荧光定量 PCR 基因分析的最适内参基因。本研究可为后期研究东京四照花相关耐盐基因表达及功能提供参考。

• 非洲猪瘟病毒 MGF505-5R 基因分子特征及蛋白表达载体构建

  沈兆基, 谢春嫡, 沙嘎那日·吉日木图, 郭肖蓉, 周荣, 李奎

  非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种对猪(Sus scrofa)具有毁灭性的疾病,通常引发出血热, 对养猪业危害巨大。多基因家族(multigene families, MGF) 505-5R 位于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)基因组右侧可变区域(the right variable region, RVR),能够影响病毒的毒力。本研究旨在分析 MGF505-5R 基因和蛋白的分子特征,构建MGF505-5R基因真核表达载体。根据ASFV参考基因组(GenBank No. MK128995.1)提取 MGF505-5R 基因序列进行生物信息学分析, 并合成 MGF505-5R 基因片段。通过同源重组的方式将 MGF505-5R 基因连接至 pRK5M-C-2×Strep 载体。经 PCR 和测序鉴定后, 将重组质粒 pRK5M-C-2×Strep-MGF505-5R 转染至猪小肠上皮细胞系(porcine intestinal columnar epithelial cells, IPEC-J2)中, 通过免疫荧光和 Western blot 检测 MGF505-5R 的基因表达效果。通过 qPCR 检测过表达 pRK5M-C-2×Strep-MGF505-5R 的 IPEC-J2 细胞中外切体(exosome)8个亚基、Mtr4 外切体 RNA 解旋酶(Mtr4 exosome RNA helicase, MTREX)、末端核苷酸转移酶 4A (terminal nucleotidyltransferase 4A, TENT4A)、锌指 DHHC 型棕榈酰转移酶 16 (zinc finger DHHC-type palmitoyltransferase 16, ZDHHC16)基因的表达。生物信息学分析结果表明,MGF505-5R 基因在系统发育树中分为3个分支,MGF505-5R 蛋白在20、105 和 485 位氨基酸存在正向选择。MGF505-5R 蛋白的二级结构与三级结构相符, 正选择位点均位于无规则卷曲上。PCR 结果显示 MGF505-5R 基因片段成功连接至 pRK5M-C-2×Strep 载体中。免疫荧光和Western blot 检测结果显示, MGF505-5R 蛋白能够在猪 IPEC-J2 细胞中表达。qPCR 结果显示, 过表达pRK5M-C-2×Strep-MGF505-5R 的 IPEC-J2 细胞中外切体组分(exosome component, EXOSC) 1、EXOSC2、EXOSC3、EXOSC4、EXOSC5、EXOSC7、EXOSC8、EXOSC10、TENT4A 和 ZDHHC16 的表达量极显著降低(P<0.01);MTREX 的表达量无显著变化。本研究对 MGF505-5R 分子特征的分析,为该基因的进化研究提供基础; 构建 MGF505-5R 在猪 IPEC-J2 细胞的表达载体, 为 ASFV 与宿主之间的蛋白质相互作用研究提供有效的工具和实验素材。