农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2023年第7期

• miR-10b靶向调节PTEN基因及其蛋白对猪卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用

  章会斌, 刘阳光, 尚金男, 韩政, 周忍, 许黎明, 徐启隆, 郑先瑞, 殷宗俊, 张晓东

  miRNA (microRNA, miR)是可参与基因转录后调控的内源性非编码小 RNA,miR-10b 是猪(Sus scrofa) 卵巢闭锁过程中的一个关键调控因子,而其靶向基因同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN)基因在细胞凋亡中起着重要作用。为探讨 miR-10b和PTEN基因对猪卵巢颗粒细 胞 (pig ovarian granulosa cells, pGCs) 凋亡的调控作用,本研究分别用miR-10b 的模拟物及抑制物转染 pGCs,构建过表达和抑制 miR-10b 的 pGCs 模型,采用流式细胞术检测过表达和抑制 miR-10b对pGCs凋亡的影响。结果显示,过表达 miR-10b 极显著增加了 pGCs 凋亡率(P<0.01),抑制 miR-10b 表达后 pGCs 凋亡率极显著降低(P<0.01)。基于生物信息学分析可知,miR-10b 能直接结合PTEN 3'UTR 区。进一步构建通过荧光素酶报告基因载体,发现相对于pmirGLO-PTEN-WT 与 mimic NC共转染组,pmirGLO- PTEN-WT与miR-10b mimic 共转染后的荧光活性更低(P<0.01),pmirGLO-PTEN-MUT 与 miR-10b mimic共转染,或与 mimic NC 共转染后,荧光活性无显著差异(P>0.05),pmiGLO 与 miR-10b mimic 共转染,或与 mimic NC 共转染的荧光也无显著差异(P>0.05),通过双荧光素酶报告基因系统再次证实了 miR-10b 能靶向结合 PTEN 3'UTR 区,抑制 PTEN 基因表达。利用 qPCR 及 Westren blot 检测 PTEN 基因及其蛋白的 表达水平,发现 miR-10b 可以抑制 PTEN 基因及其蛋白的表达水平。此外,在抑制 miR-10b 表达后,引入 siRNA 下调 PTEN 基因的表达,可以缓解 miR-10b 对 pGCs 凋亡的促进作用。本研究证实了 miR-10b 可以通过抑制靶基因 PTEN 的表达来调控 pGCs 凋亡,为深入了解 pGCs 的凋亡机制和研究卵泡发育提供了数据支持。

• 小麦类甜蛋白TaTLP1互作蛋白的筛选及其与TaGF14的互作验证

  申松松, 冯燕, 孟麟硕, 王菲, 崔钟池, 马秋颖, 刘大群, 马利松, 王海燕

  类甜蛋白(thaumatin-like protein, TLP)是一类重要的病程相关蛋白,在植物抵御生物胁迫和非生物逆境中具有重要作用。课题组前期发现小麦(Triticum aestivum)类甜蛋白基因 TaTLP1 参与小麦抗叶锈 病菌防御反应,为进一步解析其抗病机制,本研究利用 GST-pull down 和酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)技术同时筛选小麦中 TaTLP1 的互作蛋白,两种技术均筛选到 14-3-3 类蛋白(TaGF14)为 TaTLP1 的 候选互作蛋白,利用 Y2H 和共定位技术验证了 TaTLP1 与 TaGF14 的互作;qPCR 分析发现 TaGF14 基因与 TaTLP1 基因受叶锈菌诱导后的表达趋势基本一致,均在叶锈菌诱导前期高表达,且非亲和组合中表达量 高于同期亲和组合中表达量 ;亚细胞定位研究显示 TaGF14 定位于细胞核。进一步的特征分析表明, TaGF14 可能具有潜在的抗病功能。本研究为深入研究 TaTLP1 参与小麦抗叶锈病防御反应的分子机制以及发掘寄主中更多抗病基因提供了基础,为小麦抗性品种的培育提供更多优秀的抗病资源。

• 基于BSA-seq技术对番茄封顶花序节位基因的精细定位

  师海林, 张丹丹, 高倩, 尤园园, 舒金帅, 王帅, 毛秀杰

  主茎花序数的多少影响着自封顶类型番茄(Solanum lycopersicum)的产量,精细定位其封顶花序节位基因,可为进一步基因克隆以及功能分析、调控机理解析提供依据。本研究以低节位自封顶番茄品 系 AXF 和高节位自封顶番茄品系 GXF 为亲本构建 F2 分离群体,应用混合群组分离分析测序(bulked segregant analysis sequencing, BSA-seq)和分子标记方法进行了连锁分析及基因定位。结果表明,关联区间位于2号染色体 47.56~47.59 Mb,大小约为25 497 bp,含有3个候选基因(硫代硫酸硫转移酶18 (thiosulfatesul furtransferase 18, TST18) (GenBank No. XM_004232452.4), MLO类家族蛋白4(MLO-like protein 4, MLO4) (GenBank No. XM_019212390.2) 和26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基 4 (26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 4, PSMD4) (GenBank No. XM_010318126.3))。进一步开发118对InDel (insertion-deletion)/CAPS (cleaved amplified polymorphism sequences)/dCAPS (derived CAPS) 引物进行精细定位,筛选获得 1 对多态性高的 dCAPS14 分子标记,该标记与 PSMD4 紧密连锁。qRT-PCR 分析表明该候选基因在两个亲本不同组织中的表达量存在显著性差异。PSMD4 功能为参与泛素-蛋白酶体系统介导的蛋白降解,可能对番茄封顶花序节位起着重要调控作用。本研究对分子辅助选育易于栽培操作的理想型自封顶番茄品种具有重要意义。

• 辣椒CaDDB1基因克隆及功能研究

  单庆云, 袁巧玲, 郭思思, 熊程, 刘峰, 邹学校

  辣椒(Capsicum annuum)是茄科辣椒属一年生或有限多年生草本植物。DNA 损伤结合蛋白 1 (damaged DNA binding protein 1, DDB1)基因在番茄(Solanum lycopersicum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana) 等模式植物中已有一定研究,但该基因在辣椒中的功能尚不明确。本研究在辣椒中克隆了番茄 DDB1 同源基因,命名为 CaDDB1 (GenBank No. XM_016701551)。采用病毒诱导基因沉默 (virus-induced gene silencing, VIGS)技术获得了辣椒 CaDDB1 基因沉默植株,通过观察其表型,初步鉴定了 CaDDB1 的生物学功能。研究结果表明,CaDDB1 基因沉默后辣椒植株极显著矮化(P<0.01),第 3~6 片真叶花青素含量极显著升高(P<0.01),说明 CaDDB1 基因影响辣椒的生长发育并在花青素合成方面起负调控作用。本研究结 果为辣椒生长发育调控及品种改良提供一定的理论指导。

• 青花椒花器官分化基因ZaAG的克隆与生物信息学分析

  王宇, 王凯, 刘瑞, 何雨欣, 李红娇, 胥蒙, 唐子媛, 惠文凯

  以孤雌生殖为主的青花椒(Zanthoxylum armatum)常出现雄花分化现象,易导致大面积减产,但雄花形成的内在原因暂未可知。现有研究表明,植物的花器官受到 ABC 模型的调控,其中 C 类基因 AG (AGAMOUS)对雄蕊和心皮的分化具有决定性作用。本研究以青花椒为研究对象,基于课题组前期积累的转录组数据和已发表基因组数据剖析了青花椒 AG 基因序列,并通过 PCR 扩增技术克隆鉴定了 AG 编码序列全长。结果表明,青花椒 ZaAG 编码序列全长 732 bp,共编码 243 个氨基酸,其中包括 77 个氨基酸组成 的 MADS 结构域和 86 个氨基酸组成的 K-box 结构域。系统进化分析显示,AG 蛋白序列在同科植物中比较保守,ZaAG 与同科植物克莱门柚(Citrus clementina)和甜橙(C. sinensis)等芸香科植物亲缘关系较近。此外,ZaAG 编码序列共预测到 148 个转录因子结合位点,主要涉及生殖生长和植物抗性等多种调控途径。顺式作用元件分析发现,ZaAG 启动子区富含光信号、植物激素和逆境胁迫等相关元件。同时,该基因在 根、茎、叶和刺等营养器官中几乎不表达,但在雌雄花分化过程中表达量显著提高(P<0.05),尤其是在雄花成熟期表达量最高,暗示 ZaAG 可能参与青花椒雌雄蕊分化过程。本研究对于进一步探究青花椒雌雄蕊分化的遗传调控机制,培育高产青花椒种质资源具有积极意义。

• 乳白石蒜LaDFR1基因及启动子克隆与功能研究

  朱熠辰, 薛惠敏, 周琪, 宗杰, 高燕会

  乳白石蒜(Lycoris albiflora)新品种'梦幻少女'的渐变花色为石蒜属(Lycoris)特殊花色,二氢黄酮醇4-还原酶基因(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)是乳白石蒜花瓣花色变化的关键酶基因。为进一步研究 该基因的功能和作用,本研究利用 RT-PCR 和染色体步移技术(Genome walking)分别从乳白石蒜花瓣中克隆到LaDFR1 基因及启动子序列,对 LaDFR1 基因进行生物信息学和表达模式分析,并进一步在烟草(Nicotiana tabacum)中过表达 LaDFR1,研究其功能。结果表明,LaDFR1 cDNA 序列 OFR 长 1 161 bp,编码386 个氨基酸。LaDFR1 蛋白保守结构域具有 NADPH 和底物结合位点,属 NADB-Rossmann 超基因家族。序列比对和系统发育分析显示,乳白石蒜与百子莲(Agapanthus praecox)的 DFR 氨基酸序列一致性达到80.43%,聚为一个分支。qPCR 检测发现,LaDFR1 基因在乳白石蒜 3 个不同开花时期均有表达,开花第 1天表达量最低,随着开花时间的延长,表达量逐渐上升;LaDFR1 主要在花瓣中表达,其次是花丝,在花葶中表达最低。获得一条长 1 570 bp 的 LaDFR1 基因启动子序列,含有多个光照、脱落酸诱导、MYB 和 NAC 结合顺式作用元件,构建 LaDFR1pro: PBI121 整合载体瞬时转化烟草叶片,光照条件下较黑暗处理诱导 的 GUS 活性更高,说明 LaDFR1 启动子具有光诱导活性。综上,本研究成功获得 LaDFR1 基因及其启动子序列,LaDFR1 可能参与乳白石蒜花瓣花青素苷的合成和积累,这一研究结果可为进一步研究乳白石蒜花色变化的调控及用基因工程进行花色改良提供靶基因。

• 转录组分析揭示PpCYP703A2、Pp4CL和PpABCG26参与调控桃花粉育性

  叶茂, 刘春生, 刘亚婷, 张曼, 苏凯, 张晨光, 李晓颖, 王海静, 肖啸, 张立彬, 杨清, 武军凯

  桃(Prunus persica)多数品种可以自花结实,花粉正常发育对产量至关重要,花粉发育异常影响自花授粉受精和坐果。因此,研究桃的花粉育性具有重要的产业和理论意义。本研究以不育品种'久硕' ('JiuShuo', JS)与可育品种'久脆' ('JiuCui', JC)及其杂交后代为实验材料对花粉育性基因进行研究。花药 解剖观察结果表明,JS 花粉不育发生在单核小孢子期,绒毡层细胞质不能正常浓缩、退化。RNA 测序 (RNA sequencing, RNA-seq)分析结果表明,与绒毡层细胞程序性死亡和花粉外壁形成相关的途径-糖代谢、苯丙氨酸代谢、脂肪酸的生物合成和氧化还原反应在四分体和单核小孢子时期被显著富集。qRT- PCR检测可育品种 JC、不育品种 JS以及 JS×JC 后代中相关基因表达模式发现,细胞色素 P450703A2 (cytochrome P450 703A2, PpCYP703A2) (GenBank No. XM_007220109)、4-香豆酸 -CoA连接酶 -1 (4- coumarate-CoA ligase-like 1, Pp4CL)(GenBank No. XM_007225695)和 ABC 转运蛋白 G 家族成员 26 (ABC transporter G family member 26, PpABCG26)(GenBank No. XM_020565361)参与了花粉育性的调控。本研究为桃的花粉育性研究挖掘到新的基因,也为进一步揭示桃花粉育性的分子机制提供了新的理论依据。

• 秦川牛LRRN1基因表达分析及其对成肌细胞增殖分化的影响

  宋贵兵, 贾鸿儒, 蒋蕾, 昝林森, 王洪宝

  富亮氨酸重复序列神经元蛋白-1 基因(leucine rich repeat neuronal protein-1, LRRN1)编码一种Ⅰ 型跨膜蛋白,在神经发育与再生进程中发挥重要作用。牛成肌细胞的增殖分化直接影响其肌肉的生长发 育,从而影响牛肉的产量。本研究旨在探究 LRRN1 基因在秦川牛(Bos taurus)不同组织中的表达规律及其对牛成肌细胞增殖分化的影响,以确定其在成肌分化中的主要作用。首先采用 qRT-PCR 技术检测 LRRN1 在新生(3 日龄)和成年(24 月龄)秦川牛不同组织中的表达规律,及其在体外培养的牛骨骼肌成肌细胞不同 分化时期的表达特性;利用腺病毒介导的 shRNA 和 pcDNA3.1(+)构建 LRRN1 基因干扰和过表达载体,转 染秦川牛成肌细胞,采用 EdU 法检测细胞增殖,通过 qRT-PCR 和 Western blot 检测增殖标志分子的表达变化 ;经成肌诱导分化培养基作用后,观察肌管形成表型并检测分化标志分子的表达变化。结果显示, LRRN1 在秦川牛各组织中广泛表达,在新生牛和成年牛肾脏和背最长肌中高表达;LRRN1 基因表达在成肌分化过程中先升高、后降低,在分化 4 d 达到峰值,此后逐渐降低,与成肌细胞的体外分化进程具有相同 的变化趋势。在成肌细胞中干扰 LRRN1 基因表达,结果显示,EdU 染色的增殖细胞占比显著减少(P<0.05),增殖标志基因 CCNA2 (P<0.01)、CCNB1 (P<0.05)、PCNA (P<0.01)、CCND2 (P<0.05)和 CDK1 (P<0.05)下调表达,CCND2、CDK1、CCNB1 和 PCNA 蛋白表达量也降低;LRRN1 过表达也显著抑制成肌细胞增殖 (P<0.05),CCNA2 (P<0.05)、CCNB1 (P<0.01)、PCNA (P<0.01) 和 CCNE2 (P<0.05)基因表达被抑制,CCNB1、PCNA 与 CDK1 的蛋白表达量也降低。对细胞分化表型进行观察,发现 LRRN1 干扰抑制肌管形成,抑制分化标志基因 MYOG (P<0.01)、MYF5 (P<0.01)、MYF6 (P<0.01)、MYH3 (P<0.01)和 CKM (P<0.05)的表达,MYOG、MYF5 和 MYH3 的蛋白表达量也降低 ;LRRN1 过表达则促进肌管形成,MYH3 (P<0.01)、MYOD (P<0.05)、MYF5 (P<0.05)和 MYF6 (P<0.05)的基因表达量显著升高,MYOD 和 MYH3 的蛋 白表达量也增加。上述结果提示,LRRN1 是成肌细胞分化的正向调节因子,但是对成肌细胞增殖的作用尚需更全面和深入的研究。因此,LRRN1 对秦川牛肌肉组织的生长发育具有潜在的调控作用,对其深入的功能研究可用于秦川牛的分子育种实践。

• MVK和PMVK在临床型乳房炎奶牛乳腺中的表达定位及功能预测

  张博皓, 张全伟, 蔺婷, 戴丽君, 白旭, 赵兴绪, 张勇

  甲戊酸激酶(mevalonate kinase, MVK)和磷酸甲戊酸激酶(phosphomevalonate kinase, PMVK)与 动物炎症发生和发展密切相关,而其在奶牛(Bos taurus)临床型乳房炎(clinical mastitis, CM)中的表达规律 和作用机制尚不完全清楚。为探讨 MVK 和 PMVK 在正常与患 CM 奶牛乳腺组织中的表达规律及其潜在 功能,本研究采集泌乳期正常(control, C) 与患 CM 的荷斯坦奶牛乳腺组织(n=3/组),通过苏木精- 伊红 (hematoxylin-eosin, HE)染色观察奶牛乳腺组织病理变化,使用免疫组织化学(immunohistochemical, IHC) 染色、免疫荧光(immunofluorescence, IF)染色和 qRT-PCR 分析奶牛乳腺组织中 MVK 和 PMVK 分布特征 和表达规律;基于数据非依赖型模式(data-independent acquisition, DIA)蛋白质组学数据,通过生物信息学 分析和探讨 MVK 和 PMVK 在奶牛 CM 中的作用。结果显示,MVK 和 PMVK 主要定位于奶牛乳腺上皮细 胞的细胞质;与 C 组相比,CM 组中 MVK 和 PMVK 基因及其蛋白表达极显著下调(P<0.01);生物信息学结 果提示,MVK 与 PMVK 可能通过调控辅酶、氨基酸及脂肪酸合成代谢影响奶牛 CM 炎症发展。结果表明,MVK 和 PMVK 参与调控奶牛CM发展,其表达下调可加剧乳腺炎症反应。本研究为奶牛CM中MVK和PMVK作用机制的研究提供参考。

• 黄牛circCAP2在前体脂肪细胞分化过程中的功能研究

  高玉红, 冯雪, 汪书哲, 户春丽, 李芬, 张路培, 杨润军, 马云

  环状 RNA (circular RNA, circRNA)在调节前体脂肪细胞的增殖和分化中起着重要作用。前期高通量测序结果显示,circRNA-环化酶相关肌动蛋白细胞骨架调节蛋白 2 (circRNA-cyclase associated actin cytoskeleton regulatory protein 2, circCAP2)在黄牛(Bos taurus)前体脂肪细胞分化前后表达具有差异性。为探讨 circCAP2 在前体脂肪细胞分化过程中的作用机制,本研究通过 Sanger 测序及 qPCR技术对 circCAP2 进行鉴定和表达模式分析。进一步利用过表达和干扰技术将其转染至黄牛前体脂肪细胞中,利用油红 O 染色方法检测脂肪细胞脂质积累情况,通过 qPCR 检测成脂标志基因表达,结果显示,circCAP2 是真实存在且稳定表达的 circRNA,在成熟的脂肪细胞中极高表达(P<0.01)。circCAP2 过表达实验表明,在黄牛前体脂肪细胞中,过表达 circCAP2 显著促进脂肪细胞的脂质累积,显著上调成脂标志基因过氧化物酶增殖激活受体 γ (peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARγ)、脂肪酸结合蛋白 4 (fatty acid binding protein 4, FABP4)、增强子结合蛋白 α (CCAAT/enhancer-binding protein α, C/EBPα)和 C/ EBPβ 的表达(P<0.05)。而 circCAP2 干扰实验显示,干扰 circCAP2 显著抑制脂肪细胞中的脂质累积,且 成脂标志基因 PPARγ、FABP4、C/EBPα 和 C/EBPβ 的表达水平显著下调(P<0.05)。综上表明,circCAP2 可能是黄牛前体脂肪细胞分化的正调控因子,可作为改善黄牛育种中脂肪沉积的新型标志物。本研究为深入探究 circCAP2 在黄牛脂肪沉积中的调控机制提供参考。

• 酉州乌羊五个组织的权重基因共表达网络分析

  陈灿灿, 蒋婧, 孙晓燕, 李杰, 刘良佳, 王高富, 周鹏, 任航行

  酉州乌羊(Capra hircus)是地方特色山羊遗传资源,研究其特色性状形成机制具有重要意义。本研究收集酉州乌羊心脏、肝脏、背最长肌、前唇、皮肤(每个组织各 3 个样本)共计 15 个样本的转录组数据进行分析,采用权重基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)软件包 构建共表达网络,并对特异性模块中的基因进行 GO 和 KEGG 富集分析。结果显示,心脏和肝脏各鉴定 出 1 个特异表达模块,其中心脏特异性蓝色模块内基因主要富集到柠檬酸循环信号通路和各种代谢过 程,肝脏特异性黄色模块内基因主要富集到过氧化物酶、氨基酸代谢过程和化学致癌等功能;宝石绿模块内基因主要富集到蛋白质结合等功能,绿色模块内基因主要富集到磷脂酰肌醇结合等功能,棕色模块内基因主要富集到细胞蛋白质代谢等生物学过程。通过 CytoHubba 插件算法,将宝石绿、蓝色和棕色模块中连通性靠前的 10 个基因定义为核心基因 ;利用 qRT-PCR 方法验证 3 个模块内 6 个核心基因的组织表 达,结果表明,ADCY9 和 ADCY6 基因在心脏和背最长肌表达量较高,AKT2 和 MAPK3 基因在前唇组织高表 达,CAMK2G 和 CAMK2B 基因在背最长肌高表达,与转录组测序结果基本一致。上述结果对于深入开展 酉州乌羊功能基因的生物信息学研究具有参考价值。本研究为我国地方山羊遗传资源特色性状的挖掘及开发利用提供基础资料。

• 鸡IL-17基因的克隆、序列分析及密码子优化提高表达水平

  孙鹏, 朱爱臣, 梁天, 王明迪, 赵玉龙, 霍书英, 张建楼

  白细胞介素-17 (interleukin-17, IL-17)是 T 细胞诱导炎症的早期启动因子,可促进促炎性细胞因子的释放和刺激炎症反应,同时 IL-17 也能够抵抗某些病原,因此具有生物佐剂作用。鸡(Gallus gallus)的 IL-17 是否具有生物佐剂作用尚不清楚。为探讨鸡 IL-17 的生物佐剂作用,需要制备鸡 IL-17 的重组蛋白。为此本研究通过 RT-PCR 扩增了鸡的 IL-17 cDNA 序列,利用生物学软件对其基因序列及氨基酸序列进行 比较分析。为提高鸡 IL-17 基因在真核细胞中的表达水平,依据人(Homo sapiens)和鸡偏爱的密码子对 IL-17 基因进行密码子优化,分别构建了野生型和密码子优化的真核表达载体,并在人胚胎肾(human embryonic kidney, HEK) 293T细胞进行了表达。实验结果显示,扩增的鸡IL-17 基因序列与 GenBank 的相 比有 2 个碱基的差异和 1 个存在于信号肽序列中氨基酸的突变,所以未改变成熟鸡 IL-17 蛋白质氨基酸的序列,表明鸡的 IL-17 基因存在着多态性。生物信息学分析表明,鸡 IL-17 基因含有 1 个典型的信号肽序列以介导鸡 IL-17 的分泌表达,同时蛋白中含有 1 个 N-糖基化位点。通过在 HEK 293T 细胞的瞬时表达,证 明密码子优化可明显提高鸡 IL-17 的表达水平,表达水平由野生型 IL-17 基因的 13 µg/T75 细胞培养瓶提 高到密码子优化的 IL-17 基因的 45 µg/T75 细胞培养瓶,提高了 3.5 倍,同时优化后的重组蛋白可以刺激淋 巴细胞的增殖和诱导鸡成纤维细胞产生 IL-6。本研究表明密码子优化可明显提高 IL-17 基因在真核细胞中的表达并且优化表达的 IL-17 蛋白仍具有生物活性。这为进一步研究鸡 IL-17 的生物佐剂作用提供了有利条件。

• 兰州熊蜂产卵工蜂血淋巴的蛋白质组学分析

  董捷, 黄敏婕, 吴杰, 韩蕾, 王德前

  熊蜂出现工蜂卵巢发育并产卵的现象预示着蜂群发展的衰败,工蜂的劳动分工由产卵前的积极 采集转变为专职产卵,将对蜂群的采集力和授粉效果造成不利影响。为了探究工蜂产卵的调控机制,本研究利用非标记(label-free)定量蛋白质组学技术,对兰州熊蜂(Bombus lantschouensis)产卵与未产卵工蜂血 淋巴中的差异表达蛋白(differentially expressed proteins, DEPs)进行鉴定和比较,并对 DEPs 进行 GO 分类 和 KEGG 通路富集分析,利用 qRT-PCR 对随机选取的 6 个 DEPs 进行转录水平的验证。结果显示,产卵与未产卵工蜂血淋巴共鉴定得到 370 个 DEPs,其中在产卵工蜂上调表达的蛋白有 212 个,下调表达的蛋白有 158 个;GO 功能注释发现 DEPs 富集最多的条目为代谢过程(61 个 DEPs),其次是催化活性(60 个 DEPs) 和结合功能(50 个 DEPs),其中富集在解毒、免疫和抗氧化活性功能的 DEPs 均呈上调趋势;KEGG 通路富集分析显示,DEPs 显著富集于能量代谢密切相关的糖酵解/糖异生、碳代谢、脂肪酸氧化、乙醛酸和二羧酸代谢通路,以及蛋白合成相关的细胞外基质受体互作、核糖体和蛋白酶体代谢通路,与昆虫生长发育相 关的 Notch 和 Hippo 信号通路上也有 DEPs 显著富集 ;随机挑选的 6 个 DEPs 在转录水平的变化趋势与蛋 白质组学结果一致。本研究为深入探讨兰州熊蜂工蜂产卵调控的分子机制提供基础资料,为实现人工抑制工蜂产卵现象提供一定的理论指导。

• 复合诱变改善枯草芽胞杆菌表面活性素的抗菌能力

  李光月, 胡文锋, 李雪玲

  与化学表面活性剂相比,表面活性素具有毒性低、环境友好和降低表面张力等特性,在农业、食品、医药和化妆品等领域具有良好的应用前景,但生产上存在产量低和成本高的问题。本研究采用紫外、 化学和航天诱变多种诱变方法,对出发菌株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) YUAN.0 进行选育和诱变,以血平板、氯化十六烷基吡啶-溴百里酚蓝(cetylpyridinium chloride-bromothymol blue, CPC-BTB)比色法和高效液相色谱法筛选相结合,选育得到1株稳定遗传的复合诱变菌株FHYB201030;对出发菌株(YUAN.0)和突变菌株(FUYB201030)分别进行全基因组测序,收集 FHYB201030 诱变菌发酵液并进行分离纯化,对获得的表面活性素进行产量测定和体外抑菌活性检测。结果显示,FHYB201030 的表面活性素产量相比 YUAN.0 提高了 16.8 倍,产量高达 353 mg/L。YUAN.0 全基因组由 1 条 5 209 013 bp 的完整环 状染色体和 1 条 299 348 bp 的完整环状质粒组成。通过初步分析 FHYB201030 的重测序数据发现,复合诱变处理致使该菌株 CDS 出现 450 个 SNP 突变位点,主要涉及 28 个基因序列。复合诱变处理不仅提高了枯草芽胞杆菌的产量,且会影响该菌株的生长周期并提高表面活性素的抗菌能力。相对于 YUAN.0, 相同浓度的 FHYB201030 合成的表面活性素(40 mg/L)对细菌和真菌的抑制效果均有增强,并且对指示菌的生长具有明显抑杀作用。综上所述,通过复合诱变手段可以有效地提高枯草芽胞杆菌产表面活性素的能力以及表面活性素的活性,本研究为表面活性素的进一步研究和应用提供了依据。

• 菱形节杆菌BFL-3分离鉴定及耐盐碱机理研究

  卢雨欣, 颜宏, 白亚妮, 梁建强, 冯志珍

  耐盐碱微生物资源能促进土壤养分循环,提高植物保水耐盐能力,因此在盐碱土改良领域有重要应用意义。课题组前期分离得到一株耐盐碱细菌菌株 BFL-3,为明确该菌株的遗传进化关系、耐盐碱 程度及机理,本研究对 BFL-3 进行了形态学观察和 16S rRNA 序列分析,采用光密度法研究了 BFL-3 在不同pH及 NaCl胁迫下的生长特性。利用二代测序技术对 BFL-3 进行全基因组测序分析,并对其进行比对注释,通过 qPCR 验证 BFL-3 在含 5% NaCl、pH 9 的培养基中耐盐碱相关基因的表达。结果显示,菌株 BFL-3 为菱形节杆菌(Arthrobacter rhombi),其对 NaCl 的耐受范围为 0.5%~10%,对 pH 的耐受范围为 5~10; 全基因组测序分析最终获得 35 条支架(Scaffold)序列,总序列长度为 3 476 199 bp,G+C 摩尔百分含量为69.15%,编码基因数量为 3 170 个,含有 tRNA 基因 50 个,rRNA 基因 7 个。基因注释显示,菌株 BFL-3 在 氨基酸和碳水化合物代谢途径富集大量基因,同时在离子转运蛋白相关途径富集一定数量的基因,表明 BFL-3 可能采用相容溶质积累和离子平衡两种策略来响应盐碱胁迫。qPCR 验证显示,BFL-3 在培养基含5% NaCl、pH 值9的条件下,海藻糖合成酶 (trehalose synthase, treS)、二 氨 基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶 (diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase, ectB)、谷氨酸脱氢酶 (glutamate dehydrogenase, gdhA)、甜菜碱/L-脯氨酸 ABC 转运透性酶(glycine betaine/L-proline ABC transporter permease, proW)、Trk系统钾离子转运蛋白(Trk system potassium transporter, trkA)、胆碱 ABC 转运透性酶(choline ABC transporter permease, opuBD)表达量均上调,分别是对照的 11.0、6.2、6.0、13.1、7.4 和 6.3 倍(P<0.01),说明菌株 BFL-3 通过在胞内合成积累海藻糖、四氢嘧啶、谷氨酸等相容性物质并调控离子平衡来缓解盐碱胁迫的压力。本研究结 果明确了 BFL-3 的耐盐碱特性,初步探索了该菌株的盐碱耐受机理,为进一步利用该菌株修复盐碱地提供科学依据。

• 灰葡萄孢Homeodomain家族基因的鉴定与表达分析

  李白, 魏雅迪, 刘英姿, 曹宏哲, 张康, 邢继红, 董金皋

  Homeodomain 家族基因在病原菌的分生孢子发育、致病过程以及胁迫响应过程中发挥重要作用。本研究利用生物信息学方法,在全基因组水平上对灰葡萄孢 Homeodomain 家族基因进行鉴定,并对其蛋白理化性质、系统进化关系、保守结构域及其在病菌分生孢子发育时期和侵染时期的表达规律进行 分析 ;同时,利用 qPCR 技术,检测灰葡萄孢 Homeodomain 家族基因在 NaCl、刚果红处理后的表达情况。结果发现,灰葡萄孢基因组中共包含14个Homeodomain 家族基因,系统进化分析将其分为 4 个亚家族 ; 灰葡萄孢 Homeodomain 家族基因均含有 Homeodomain 家族典型的 SANT 结构域,部分基因在分生孢子 的不同发育时期和侵染时期上调表达,在 NaCl 和刚果红处理后 Homeodomain 家族基因表达水平存在明显差异,表明灰葡萄孢 Homeodomain 家族基因在病菌生长发育、侵染过程以及响应胁迫方面发挥重要的作用,本研究为阐明灰葡萄孢 Homeodomain 家族基因的功能及其作用机制提供了理论依据。

• 单细胞转录组测序在植物组织发育研究中的应用

  苗龙, 汪文辉, 何艮华, 李佳佳, 高慧慧, 王晓波, 邱丽娟

  单细胞转录组测序 (single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技术能够揭示同一组织中异质细胞 的表达谱,在细胞发育轨迹研究中发挥重要作用。目前,拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)以及玉米(Zea mays)等植物中已经逐步开展单细胞转录组研究,但相比动物细胞,植物中单细胞转录组应用尚处于起步阶段。本文阐述了植物单细胞转录组测序常用技术及其在组织发育机制、植物细胞动态发育 轨迹、细胞间分化方向与互作关系等研究中的应用,讨论了单细胞转录组测序技术应用在植物中存在的问题和挑战,并对其发展前景进行展望,为利用单细胞转录组测序技术探究植物组织发育机制提供参考。

• m6A甲基化调控哺乳动物配子成熟和胚胎发育的研究进展

  张梦雅, 闫业联, 汪薪, 刘秋晨, 张运海, 曹祖兵

  配子成熟和胚胎发育是决定哺乳动物繁殖的关键因素,配子成熟和胚胎发育过程受到多种表观遗传信息的调控。N6-甲基腺嘌呤(N6- methyladenine, m6A)是专指发生在 RNA 腺嘌呤上第六位 N 原子上 的内源性甲基化修饰,是哺乳动物 mRNA 中最丰富的内部修饰,影响着 RNA 代谢的多个方面。m6A 在哺 乳动物配子成熟和胚胎发育中起着重要的作用。m6A 修饰异常损害配子成熟、性激素合成、生育能力和早期胚胎发育。本文围绕 m6A 修饰相关酶及其对哺乳动物配子成熟和早期胚胎发育调控的研究进行综述,以期为深人探究 m6A 调控哺乳动物配子成熟和胚胎发育的机制提供参考。

• 增强VIGE诱导靶基因突变的拟南芥Cas9表达株系筛选

  彭静, 麦尔哈巴·海散, 陈林羊, 卡米燃·买吐送, 林嘉豪, 刘壮, 雷建峰

  植物病毒介导的基因编辑(virus-mediated gene editing, VIGE)体系可以快速筛选出高效的单向 导 RNA (single guide RNA, sgRNA)用于植物目标基因的靶向编辑,为定向创制遗传突变体材料提供了基因编辑工具。为了在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中筛选出能高效敲除目标基因的 VIGE 受体材料,本研究以拟南芥 AtBRI1 (brassinosteroid insensitive 1)和 AtGL2 (GLABRA 2)基因为靶标,利用基于棉花叶皱缩 病毒(Cotton leaf crumple virus, CLCrV)介导的 VIGE 系统,探究了以不同组织特异性 Cas9 超表达(Cas9-OE) 株系作为 VIGE 受体对这 2 个基因的编辑效率。qPCR 检测了 Cas9-OE 株系中 Cas9 基因的表达量,发现 Cas9 基因在不同组织特异性 Cas9-OE 株系中稳定遗传表达。利用农杆菌(Agrobacterium)介导的瞬时转化 法将 CLCrV-AtU6-26::AtBRI1-sgRNA 和 CLCrV-AtU6-26::AtGL2-sgRNA 接种不同组织特异性 Cas9-OE 植 株叶片。突变检测结果表明,3 种组织特异性 Cas9-OE 株系作为 VIGE 受体均可以实现 AtBRI1 和 AtGL2 基因的靶向编辑,在这 2 个基因靶序列区域出现了不同碱基插入、替换和缺失的突变类型,证明了这 3 种组织特异性 Cas9-OE 株系作为 VIGE 受体的有效性。进一步对每一株接种 CLCrV-AtU6-26::AtBRI1-sgRNA 和 CLCrV-AtU6-26::AtGL2-sgRNA 的单株进行突变检测,突变分析结果显示,ProCDC45::Cas9 和 ProYao:: Cas9 对 AtBRI1 和 AtGL2 基因的编辑效率相对较高,编辑效率为 50%~81.25%,表明 ProCDC45:: Cas9 和 ProYao::Cas9 转基因拟南芥可作为理想的 VIGE 受体用于拟南芥基因编辑的研究。本研究为进一步提升拟南芥中VIGE系统的基因编辑效率和高效创制拟南芥突变体材料提供了参考。