农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2022年第7期

• 贵紫麦 SLC25A4 基因参与花青素合成的功能初步研究

  李鲁华, 熊富敏, 安畅, 彭亚姝, 任明见, 徐如宏

  溶质转运家族 25 (solute carrier family 25, SLC25)成员参与花青素合成的调控过程。其家族成 员 SLC25A4 是腺嘌呤转移酶 1 (adenine nucleotide translocase 1, ANT1),参与植物生长发育和植物对逆境 胁迫响应等生物学过程。为了丰富小麦(Triticum aestivum) SLC25A4 的研究内容,探讨其在调控花青素合 成方面的生物学功能。本研究深入挖掘不同发育时期'贵紫麦 1 号'籽粒转录组数据中 SLC25A4 的表达情 况并进行 qPCR 验证 ,发现花后 25 天和花后 35 天(day post-anthesis, DPA) TaSLC25A4-7A、TaSLC25A4-7B 和 TaSLC25A4-7D1 基因的表达量显著高于 10 DPA (P<0.05),TaSLC25A4-7A 基因表达水平的变化趋势与 花青素积累量的变化趋势一致。本研究进一步获得了 TaSLC25A4-7A 过表达烟草(Nicotiana tabacum)转基 因株系 ,发现转基因株系中花青素合成相关基因 NtDFR, Nt4CL, NtCHI 和 NtF3H 的表达量显著高于野生 型(P<0.05),表明 TaSLC25A4-7A 参与调控花青素合成的生物学过程。用羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone, CCCP) 处理过表达转基因株系和野生型发现 ,过表达转基因株系对 CCCP 处理更敏感。本研究结果表明,TaSLC25A4 基因(特别是 TaSLC25A4-7A)参与调控花青素的合成,为 深入探讨 TaSLC25A4 基因在小麦花青素积累方面的生物学功能提供参考。

• 转cry1A.301基因玉米对主要鳞翅目害虫的抗性研究

  杨小艳, 王云鹤, 翁建峰, 吴红, 韩垚, 雷开荣, 谢树章

  亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、黏虫(Mythimna separata)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)是为害 玉米(Zea mays)的主要鳞翅目害虫。cry1A.301 基因是经优化的抗虫基因。为探讨转 cry1A.301 基因玉米 对亚洲玉米螟、黏虫和棉铃虫的抗性,本研究采用室内玉米离体组织生测和田间人工接虫鉴定相结合的 方法,评价了 CM8201 和 CM8204 两个转化体对亚洲玉米螟、黏虫和棉铃虫的杀虫效果。室内生测结果表 明：CM8201 和 CM8204 的心叶、花丝及籽粒对亚洲玉米螟、棉铃虫、黏虫有很强的毒杀作用,接虫 5 d 后幼 虫死亡率均达 95% 以上。田间接虫鉴定结果表明：CM8201 和 CM8204 心叶期接虫后,亚洲玉米螟的食叶 级别平均值分别为 1.17 和 1.18,虫害级别均为 1 级 ,抗性水平均为高抗 ,黏虫的食叶级别平均值分别为

• 二穗短柄草 BdDREB-30 基因的表达及其启动子的功能分析

  黄钢, 谭生龙, 孙婧, 陈利红

  脱水应答元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein, DREB)转录因子在植物 生长发育和响应逆境胁迫中发挥着重要作用。研究二穗短柄草(Brachypodium distachyon) DREB 转录因 子对禾本科作物 DREB 类转录因子抗逆分子机制的阐明具有一定的促进作用。本课题组前期针对二穗 短柄草 DREB 转录因子芯片数据的研究发现 BdDREB-30 (GenBank No. XM_003561067.4)响应多种逆境 胁迫。为进一步了解其功能,本研究采用 qPCR 技术研究了 BdDREB-30 基因在不同组织和 7 种非生物胁 迫条件下的表达模式,并采用 GUS 染色法研究了其启动子的功能。结果表明：BdDREB-30 基因在茎中的 表达量最高 ,在干旱和 H2O2 条件下其表达量显著高于对照。与其他物种同源蛋白的多序列比对结果表 明 ,BdDREB-30 蛋白质含 DREB/CBF 亚家族典型的 AP2/ERF 结构域和 A-1 亚类的特征序列。进化分析 显示其与大麦(Hordeum vulgare)和黑麦(Secale cereale)等麦类作物的同源蛋白亲缘关系相对较近。启动子 顺式作用元件分析结果显示,其启动子含有众多光响应元件,以及一些植物激素应答元件和一些胁迫应 答元件。构建 BdDREB-30 启动子的植物表达载体并转入烟草(Nicotiana tabacum),在低温、干旱和盐胁迫 处理条件下对转基因烟草叶片进行 GUS 染色。结果表明 BdDREB-30 启动子受干旱诱导较明显,是一种 干旱诱导型启动子。本研究为二穗短柄草 BdDREB-30 基因响应逆境分子机制的研究提供了理论依据。

• 茄子 miR171b 在抵抗黄萎病菌侵染中的功能

  陈敏, 林元秘, 朱文姣, 杨清

  microRNA171b (miR171b)是 miR171 家族的成员 ,在植物的生长发育、应答非生物胁迫和生物胁 迫中发挥重要作用。为了揭示 miR171b 在茄子(Solanum melongena)应答黄萎病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染过程中的功能,本研究以茄子栽培品种'苏琦 1 号'为实验材料,克隆 pri-miR171b 基因并构建表 达载体 ,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化系统构建 miR171b 转基因茄子植株 , 并对其抗黄萎病能力进行评估分析。抗病性分析表明 ,与对照相比 ,miR171b 过表达株系对大丽轮枝菌 侵染具有较强抗性,病情指数为 18.5,大约是对照的 1/3~1/2;而 miR171b 反义抑制株系对大丽轮枝菌侵染 较为敏感,病情指数分别为 68.4 和 72.6,是对照的 1.5~1.6 倍。病原菌内部转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)定量分析显示 ,miR171b 过表达株系维管束组织中大丽轮枝菌的含量较对照显著降低 ,而 miR171b 反义抑制株系的菌含量显著增加(P<0.05)。抗氧化酶活性分析显示 ,miR171b 过表达株系中超 氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)酶 活性高于对照株系,而反义抑制株系则低于对照。上述结果表明 miR171b 参与了茄子对黄萎病的防卫过 程,并起着正调控作用。本研究为茄子抗黄萎病育种提供了理论依据。

• 胁迫下海马齿生理指标变化及相关基因表达分析

  李雨欣, 罗秀丽, 张婷婷, 康宇乾, 王鹏, 江行玉, 周扬

  盐胁迫是限制植物生长发育的主要非生物胁迫之 一 。 本研究以盐生植物海马齿 (Sesuvium portulacastrum)为研究对象 ,分析海马齿幼苗在 400 和 800 mmol/L NaCl 处理 0、6、12、24、48 和 72 h 后 ,其 根和叶生理指标变化及相关耐盐基因的表达情况。结果表明：在 400 mmol/L NaCl 胁迫下,海马齿幼苗在 胁迫初期出现萎蔫现象,随着胁迫时间的延长,海马齿幼苗的生长逐渐稳定；在 800 mmol/L NaCl 胁迫下, 海马齿幼苗随着胁迫时间的延长出现萎蔫并最终死亡 ；叶和根中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)、过氧化物酶(peroxidase, POD)的活性在 12 h 内显 著增加,可溶性糖和脯氨酸积累量增加较明显,此后酶活性和渗透调节物质含量均降低。相对电导率呈 先升高后下降的趋势。400 mmol/L NaCl 胁迫下 ,海马齿中耐盐相关基因质膜 Na+/H+ 逆转运蛋白基因 (salt overly sensitive 1, SOS1)、蛋白激酶基因(CBL-interaccting protein kinase 8, CIPK8)、类似钙调磷酸酶 B 亚 基 蛋 白 基 因 (calcineurin B-like 10, CBL10) 与 质 膜 H+-ATPase 基 因 (plasma membrane H+-ATPase gene, AHA1)在根和叶中均呈上调表达,在 800 mmol/L NaCl 胁迫下,SpSOS1、SpCIPK8、SpCBL10 和 SpAHA1 基因 在海马齿叶中的表达量在处理后 12 h 达到最高 ,为同时间 400 mmol/L NaCl 胁迫下基因表达量的 6.80、124.32、25.93 和 9.52 倍。本研究为进一步研究植物在盐胁迫下生理指标及相关基因表达调控规律提供 理论依据。

• 山苍子 WRKY 基因家族鉴定及表达分析

  苏文娟, 陈霞, 曹瑞兰, 陈尚钘, 刘洲莹, 刘娟

  山苍子(Litsea cubeba)是我国南方地区重要的木本香料树种之一,在生长过程中极易遭受生物和 非生物胁迫影响。WRKY 转录因子在植物生长发育、胁迫应答等过程中发挥着重要作用。本研究基于 生物信息学分析 ,鉴定出 41 个 LcWRKY 家族基因 ,利用转录组数据和 qPCR 验证 ,分析并探讨其在不同 组织中的表达特异性。系统进化发育显示,LcWRKY 家族成员分为 2 个类群,其中第 2 个类群包含 5 个亚类Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d 和Ⅱ-e。对 LcWRKY 基因的保守基序和结构域进行分析,结果证实了系统发育聚类分析的准确性。蛋白互作网络共表达分析表明 ,LcWRKY36、LcWRKY38 和 LcWRKY39 等处于共线中心,推测其在山苍子响应病害、低磷胁迫等调控过程中起着关键作用。不同组织的转录组分析发现,41 个 LcWRKY 成员在不同组织中差异表达,其中 LcWRKY1、LcWRKY3、LcWRKY8 等 10 个基因在根中呈现明 显的高表达,LcWRKY8 在根中的表达量是叶中的 25 倍(P<0.01),推测其在根系发育和逆境胁迫中发挥重 要作用。此外 ,LcWRKY29、LcWRKY10、LcWRKY15、LcWRKY22 和 LcWRKY1 等基因在果实中的相对表达量 较高 ,推测其可能参与山苍子果实柠檬醛等次生代谢产物的生物合成。本研究为进一步解析山苍子 WRKY 转录因子的功能提供基础资料。

• 桃 AQP 基因家族成员的鉴定与表达分析

  徐摇光, 张政权, 于洋, 官健涛, 谢华

  植物水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一类位于生物膜上选择性运输水及其他亲水性小分子物 质的膜蛋白 ,在种子萌发、开花、果实发育等多种生理过程中发挥重要的作用。为探索 AQP 基因在桃 (Prunus persica) 果 实 发 育 过 程 中 的 作 用 ,本 研 究 在 桃 基 因 组 中 鉴 定 得 到 28 个 AQP 基 因 家 族 成 员 PpAQP1~PpAQP28。 系 统 发 育 关 系 分 析 显 示 ,这 些 PpAQPs 可 归 为 质 膜 内 在 蛋 白 (plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)、液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins, TIPs)、类 NOD26 内在蛋白(nodulin-26- like intrinsic proteins, NIPs)、小分子碱性内在蛋白(small basic intrinsic proteins, SIPs)和未归类 X 内在蛋白 (uncategorized X intrinsic proteins, XIPs) 5 个亚家族。对家族成员进行染色体定位、基因结构和保守基序 等分析 ,并结合转录组和 qPCR 方法对 PpAQPs 家族成员的组织特异性和果实不同发育阶段的表达模式 进行了分析,结果表明,PpAQPs 亚家族间以及亚家族内发生了一定程度的分化;其中 8 个 PpAQP 基因在 果实组织中高表达,且表达高峰发生在发育前期,提示这些基因可能在果实第一次快速生长期中发挥了 重要作用。本研究为进一步阐明 AQPs 在果实发育进程中的功能提供了参考依据。

• 青海高原型牦牛 SCD 基因 SNP 及单倍型与生长性状的关联性分析

  祁增源, 高占红, 周建强, 韩银仓, 刘秀, 孙永刚

  硬脂酰辅酶 A 去饱和酶(stearyl-CoA desaturase, SCD)是牦牛(Bos grunniens)体内单不饱和脂肪酸 (monounsaturated fatty acid, MUFA)生物合成的关键酶,对脂质合成和氧化的动态平衡调节过程有着重要 的作用。为探索青海高原型牦牛 SCD 基因多态性及其与生长性状的关联性,通过 DNA 测序法进行基因 的多态性分析,应用连锁不平衡分析和一般线性模型(general linear model, GLM)进行关联性分析。结果表明 ,SCD 基因第 3 内含子上存在 2 个 SNP (g.6614C>A 和 g.6660C>T),其中 g.6614C>A 上存在 2 种基因 型 ,g.6660C>T 上存在 3 种基因型 ;χ2 检验表明 ,g.6614C>A 处于哈代温伯格(Hardy-Weinberg)平衡状态 , g.6660C>T 处于不平衡状态 ,且 g.6614C>A 为低度多态(PIC<0.25),g.6660C>T 为中度多态(0.50>PIC>0.25)。与生长性状关联性分析发现,g.6614C>A 位点上 CA 基因型的体重、体高、体斜长和管围显著高于 CC 基因型(P<0.05),而胸围与 CC 基因型差异不显著。g.6660C>T 位点上 TT 基因型个体的体长与 CT 和 CC 基因型差异不显著 ,体重、体高和胸围显著高于 CC 和 CT 基因型(P<0.05),管围极显著高于 CC 基因 型(P<0.01)。单倍型和连锁不平衡分析发现 2 个位点存在 4 种单倍型,位点间不存在强连锁性(r2=0.027)。 组合单倍型分析发现,H1H3 为最优组合单倍型。综上,SCD 基因多态性与青海高原型牦牛的部分生长性 状相关,可作为牦牛分子标记辅助选择的候选基因,本研究为提高牦牛选种效率提供参考。

• 山羊 Wnt5A 基因序列变异及其组织表达特征

  李少斌,张瑞国,何兆华,赵鹏飞,赵芳芳,王继卿,刘秀,胡江,罗玉柱

  羊绒的质量和产量决定着绒山羊(Capra hircus)的经济价值,而毛囊是调控羊绒生长和性状的直 接组织 ,通过调控毛囊发育可实现羊绒性状的改良。无翅型鼠乳腺肿瘤病毒整合位点家族成员 5A (wingless-type mouse mammary tumor virus integration site family member 5A, Wnt5A)基因是毛囊发育信号 通路中的关键因子,在毛囊的发育过程中起着关键作用,但其在山羊中的研究还非常有限。为全面掌握 山 羊 Wnt5A 的 分 子 遗 传 特 征 ,本 研 究 利 用 PCR- 单 链 构 象 多 态 性 (PCR-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)结合测序,检测分析该基因在中卫山羊、柴达木绒山羊和陇东绒山羊群体中的 变异特征；利用 qPCR 技术,分析 Wnt5A 在辽宁绒山羊和陇东绒山羊组织表达特征。结果显示：在陇东绒 山羊、柴达木绒山羊和中卫山羊群体中 ,Wnt5A 的 exon 4 扩增区存在 2 个突变位点 ,分别为 c.334C>A 和 c.213A>G,形成 A、B 和 C 3 个等位基因并表现为 AA、AB、AC、BB 和 BC 5 种基因型。A 和 AB 分别为柴 达木绒山羊和陇东绒山羊中的优势等位基因和优势基因型 ,而中卫山羊中分别为 B 和 BB。在该基因 exon 6 扩增区检测到由 D 和 E 2 个等位基因构成的 DD、DE 和 EE 3 种基因型 ,序列比对发现 c.685-5C>T 和 c. 685-55G>A 2 个 SNPs。 3 个 群 体 中 E 均 为 优 势 等 位 基 因 ,DE 均 为 优 势 基 因 型 。 2 个 扩 增 区 构 成 H1~H6 6 种单倍型 ,其中频率最高的为 H2。Wnt5A 基因在辽宁绒山羊和陇东绒山羊的 7 种组织中均表 达,品种间具有差异性,同时在皮肤中的表达差异显著,推测是由于 Wnt5A 基因的表达与羊绒性状相关造 成的。该研究通过比较不同品种山羊 Wnt5A 基因的变异和表达特征,分析了该基因的分子遗传特征,为 丰富山羊基因组内容及该基因的开发利用提供了基础资料。

• 运输应激对山羊小肠紧密连接蛋白 Claudin-1、Occludin 和 ZO-1 及其基因的影响

  吴雅琳, 叶恬, 冯妮, 杨燕珍, 彭瑞妮, 杨敩校, 郑文亚, 郑路程, 杨雪

  在养殖过程中 ,存在许多应激 ,其中运输应激是不可避免的 ,例如捕获、拥挤、禁食等是最常见 的运输应激原 ,会导致山羊(Capra hircus)的生产性能降低 ,甚至会引发疾病而造成巨大经济损失。为了 探讨运输应激对山羊小肠紧密连接蛋白-封闭蛋白 1 (Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)和闭锁小带蛋白-1 (zonula occluden-1, ZO-1)的影响 ,本研究选取 18 只山羊 ,随机分为对照组(运输 0 h 组)、运输 2 h 组和运 输 6 h 组 ,采用免疫组织化学和荧光定量 PCR (qPCR)技术对山羊小肠紧密连接蛋白 Claudin-1、Occludin 和 ZO-1 基因及其蛋白分布的变化情况进行研究。免疫组织化学结果表明 ,Claudin-1、Occludin 和 ZO-1 蛋白主要在山羊十二指肠、空肠和回肠的肠绒毛上皮细胞和肠腺上皮细胞胞质中表达 ,同一肠段不同 组间 Claudin-1、Occludin 和 ZO-1 蛋白的分布情况发生了变化。qPCR 结果表明 ,与对照组相比 ,十二指 肠运输 2 h 组和 6 h 组 Claudin-1、Occludin 和 ZO-1 基因表达量均极显著降低(P<0.0001) ;空肠运输 2 h 组 和 6 h 组 Claudin-1、Occludin 和 ZO-1 基 因 表 达 量 则 极 显 著 上 升 (P<0.001) ;回 肠 运 输 6 h 组 Claudin-1、 Occludin 和 ZO-1 基因表达量极显著上升(P<0.01)。实验结果表明运输应激会影响山羊小肠紧密连接 蛋白 Claudin-1、Occludin 和 ZO-1 基因及其蛋白的表达。本研究为探究运输应激过程中的机制及研发缓 解运输应激相关产品提供基础资料。

• 五种免疫增强剂对绍兴雏鸭胸腺组织部分炎症和凋亡相关因子表达的影响

  顾天天, 李国勤,许文武,田勇,李柳萌,陈斌丹,曾涛,陈黎,陶争荣,沈军达,卢立志

  抗生素的过度使用严重威胁着鸭产业的发展，甚至危害人类健康，因此寻找可靠的抗生素替代 物已成为当务之急。免疫增强剂可以通过提高自身非特异性免疫能力，增强机体应对病原微生物或病原 体的防御。本研究旨在对 5 种不同的免疫增强剂对绍兴雏鸭(Anas platyrhynchos)胸腺组织凋亡及免疫因 子相关基因表达的影响进行研究。将 150 只 1 日龄的绍兴雏鸭随机均分为 6 组，连续 3 d 分别于颈部皮下 注射生理盐水、绿原酸、β-葡聚糖、黄芪黄酮、未甲基化 CpG 的核苷酸(CpG-containing DNA, CpG DNA)和 鸡免疫球蛋白 G (immunoglobulin G, IgG)，18 日龄采集胸腺组织，通过 qPCR 结合 Western blot 检测炎症相 关基因和凋亡基因 mRNA 和蛋白表达水平。结果发现，与对照组相比，分别注射绿原酸、β-葡聚糖、黄芪 黄酮、CpG-DNA 和鸡 IgG 的绍兴雏鸭胸腺组织中 ，B 淋巴细胞瘤 2 (B-cell lymphoma 2, Bcl2) mRNA 和蛋 白水平均显著降低(P＜0.05)，半胱天冬酶-3 (Caspase3)的表达水平均在不同程度上调。此外，分别注射五 种免疫增强剂后均在不同程度上提高了胸腺组织中诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 和 环 氧 化 酶 2 (cyclooxygenase-2, COX2) 的 表 达 水 平 ，干 扰 素 - α (interferon- α, IFN- α)、干 扰 素 - β (interferon-β, IFN-β)、白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子 α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、视黄酸诱导基因Ⅰ (retinoic acid-inducible gene-Ⅰ, RIG-Ⅰ)、Toll 样受体 3 (toll-like receptor 3, TLR3)和 Toll 样受体 7 (toll-like receptor 7, TLR7)基因的 mRNA 水平均呈现不同程度的上调表达。综上所述，绿原酸、β-葡聚糖、黄芪黄酮、CpG-DNA 和鸡 IgG 可作为免疫增强剂调控鸭先天性免疫。本研究为预防鸭重要传染性 疾病提供新途径，同时也为动物生产过程中抗生素替代物的应用提供一定的参考。

• 重组草鱼干扰素 IFNγ 原核表达及其抗 GCRV 效果

  袁雪梅, 徐铃威, 黄雷, 郝贵杰, 蔺凌云, 潘晓艺, 姚嘉赟, 沈锦玉

  近年来 ,由草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)引发的草鱼出血病给该产业造成了严重 的损失。为探究重组干扰素对草鱼(Ctenopharyngodon idella)的免疫保护作用及其作用机制,本研究构建 草 鱼 干 扰 素 γ (interferon γ, IFNγ) 的 原 核 表 达 载 体 PET-30a-rCiIFNγ,并 转 入 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli) Transetta (DE3)感受态细胞,经 IPTG 诱导表达及镍柱层析法纯化后获得重组蛋白 rCiIFNγ;通过细胞病变 效应(cytopathic effect, CPE)检测 rCiIFNγ 的体外抗病毒活性;进一步在攻毒实验中评价 rCiIFNγ 免疫对草 鱼体内抗 GCRV 感染的影响。结果显示 ,重组草鱼 IFNγ 融合蛋白(rCiIFNγ)分子量约 23 kD,纯化复性后 的 rCiIFNγ 抗病毒效价达 2.8×103 U/μg;rCiIFNγ 不仅能在体外抑制 GCRV 引起的细胞病变,还可以诱导草 鱼肝、脾、肾、肠中 IFN、IRFl、IRF7、Mx、PKR 和 STAT3 等干扰素激活基因的表达 ,并能显著降低 GCRV 攻 毒草鱼的死亡率。上述结果提示重组草鱼 IFNγ 融合蛋白 rCiIFNγ 具有明显的体内和体外抗 GCRV 效果。 本研究为草鱼 IFNγ 在抗病毒方面的应用提供了参考依据。

• 棉铃虫正性调节区锌指类似蛋白 10 基因的克隆及表达分析

  张亚林, 胡得琴, 李源, 皇甫慧琳, 加恩力斯尼·那扎尔, 余睿, 刘小宁

  棉铃虫(Helicoverpa armigera)是一种杂食性害虫 ,可对多种农作物产量造成严重损失。目前 Bt 作物的大面积种植和化学农药的大量使用使得棉铃虫进化出应对杀虫剂和植物次生物质而保护自身的 防 御 机 制 。 为 了 开 发 绿 色 杀 虫 剂 ,对 棉 铃 虫 进 行 无 害 化 防 控 ,本 研 究 以 棉 铃 虫 细 胞 色 素 P450 (cytochrome P450 proteins, CYP) CYP6B6 启动子上响应 2-十三烷酮(2-Tridecanone, 2-TD)的核心序列 HE1 做 探 针 ,利 用 DNA pull down 技 术 筛 选 出 1 个 棉 铃 虫 正 性 调 节 区 锌 指 类 似 蛋 白 10 (positive regulatory domain zinc finger protein 10 like, PRDM10l)基因。对该基因进行克隆、生信分析和融合蛋白的原核表达, 同时利用 qPCR 检测其时空表达谱及 2-TD 胁迫下该基因在 6 龄棉铃虫中肠中的表达规律。结果显示 , HaPRDM10l (GenBank No. XM_021334552.1)的 ORF 为 2 067 bp,编码 688 个氨基酸 ,蛋白分子质量和理 论等电点分别为 77.96 kD 和 8.84。HaPRDM10l 在棉铃虫的不同发育阶段均有表达,在 5 龄幼虫中表达量 最高;在 6 龄幼虫不同组织中,中肠表达量最高。不同浓度的 2-TD 处理后,HaPRDM10l 和 CYP6B6 均能响 应 2-TD 的 诱 导 。 HaPRDM10l 在 10 mg/g 的 2-TD 处 理 12 h 时 表 达 量 达 到 最 大 值 ,为 对 照 组 的 7.6 倍 ; CYP6B6 在 5 mg/g 的 2-TD 处理 6 h 后表达量达到最大值,为对照组的 4.6 倍。相关性分析显示在 6 h 处理 组中 HaPRDM10l 和 CYP6B6 的表达呈正相关(r=0.749, P<0.01)。上述结果表明 HaPRDM10l 可能调控 CYP6B6 的表达以应对 2-TD 的胁迫。本研究为明晰棉铃虫应对植物次生物质的胁迫机制提供参考。 关键词 棉铃虫;正性调节区锌指类似蛋白 10 (PRDM10l);克隆;时空表达;2-十三烷酮(2-TD)

• 刺芹侧耳软腐病病原菌分泌系统组成、蛋白互作分析及效应蛋白预测

  谷彤彤, 赵爽, 宋爽, 刘宇, 荣成博

  软 腐 病 是 刺 芹 侧 耳 (Pleurotus eryngii) ( 商 品 名 : 杏 鲍 菇) 的 主 要 病 害 ,北 京 欧 文 氏 菌 (Erwinia beijingensis)是该病的病原菌 ,目前该病原菌的致病机理尚不明确。本研究采用三代 Nanopore 与二代 Illumina 平台结合的方法获得了北京欧文氏菌的全基因组信息(0 gap),并进行了基因功能注释和分泌系 统组成分析。在 STRING 网站(https://www.string-db.org/)预测了分泌系统蛋白的相互作用并绘制了蛋白 互作网络 ;用 SecReT6 和 Effectivet3 软件预测了分泌的效应蛋白。北京欧文氏菌基因组大小为 4.11 Mb, GC 含量为 50.17%,具有编码基因 3 815 个。北京欧文氏菌具有Ⅰ型(type Ⅰ secretion system, T1SS)、Ⅲ型 (T3SS)、Ⅳ型(T4SS)和Ⅵ型分泌系统(T6SS)。T1SS 由 3 个蛋白组成,包含内膜(inner membrane, IM)蛋白、 膜融合蛋白(membrane fusion protein, MFP)和外膜(outer membrane, OM)蛋白 ,其中 2 对蛋白之间具有相 互作用,推测分泌 36 个效应蛋白。T3SS 包括 9 个保守的 Hrp (hrp conserved, Hrc)蛋白和 11 个过敏反应与 致病性(hypersensitive response and pathogenicity, Hrp)蛋白,组成 88 个蛋白互作对,预测分泌 154 个效应蛋 白。T4SS 包括 9 个毒性蛋白 B (virulence B, VirB)蛋白,组成 21 对蛋白的相互作用关系,推测分泌 11 个效 应蛋白。北京欧文氏菌具有 2 个 T6SS,T6SS-1 由 13 个 T6SS 蛋白和 11 个未知蛋白组成,形成 104 个蛋白 互作对,T6SS-2 包括 11 个蛋白和 8 个未知蛋白,组成 55 个蛋白互作对,SecReT6 软件预测 T6SS 分泌 6 个 效应蛋白。58 个分泌系统基因在病原菌侵染宿主前、后均具有表达 ,其中 34 个基因具有显著的表达差 异。本研究从基因组层面上解析了北京欧文氏菌分泌系统的组成、蛋白互作和分泌的效应蛋白,为该菌 致病相关基因的解析提供了基础数据,为深入解析其致病机理提供理论依据。

• 粉红聚端孢几丁质酶基因 Trchi2 在毕赤酵母中的表达及其酶学性质

  于松尼, 贾鹏飞, 李雅华, 咸洪泉

  粉红聚端孢(Trichothecium roseum)是一种重要的菌寄生真菌 ,能够通过菌寄生作用抑制病原微 生物的生长,可以有效防治多种植物病原真菌。几丁质酶(chitinase, chi)在粉红聚端孢寄生和抑菌过程中 发挥重要作用,本研究旨在实现粉红聚端孢几丁质酶 Trchi2 基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达,并明 确其酶学性质 ,采用逆转录 PCR (reverse transcriptase PCR, RT-PCR)克隆粉红聚端孢几丁质酶 Trchi2 基 因,构建毕赤酵母重组表达载体,转入毕赤酵母 GS115,筛选获得的酵母转化子通过甲醇诱导表达,获得 Trchi2 蛋白 ,测定其几丁质酶活性并进行酶学性质的研究。本研究成功构建了毕赤酵母重组表达载体 pPIC9K-Trchi2,获得了分泌表达几丁质酶 Trchi2 的工程菌 GS115-Trchi2-2-8;诱导培养 7 d 产酶量最高,酶 活力达 3.96 U/mL,表达的几丁质酶 Trchi2 表观分子量为 50 kD,酶解胶体几丁质的产物为几丁二糖 ;在45 ℃、pH 6.0 时酶活性最高,在 pH 4~7.5、30~55 ℃条件下相对稳定;当催化反应体系中存在 50 mmol/L 的 Ag+ 、Hg2+ 、Cu2+ 、Fe2+时,Trchi2 酶活性受到强烈抑制。本研究对几丁质酶 Trchi2 的基本性质进行了研究, 为其结构功能的深入发掘和生产应用提供了理论依据。

• 植物几丁质酶和 β-1,3-葡聚糖酶及其协同抗病性研究

  陈燕玲, 岑光莉, 孙婷婷, 尤垂淮, 阙友雄, 苏亚春

  植物几丁质酶(chitinase)和 β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)能够水解病原菌细胞壁的主成分几 丁质、β-1,3-葡聚糖和肽聚糖,有效抑制病原菌的生长,是植物防御系统中的两个重要的防卫因子。此外, 两者还具有协同抑菌作用,被广泛应用于植物抗病基因工程。本文通过阐述植物几丁质酶和 β-1,3-葡聚 糖酶的结构、分类、生物学特性、表达调控机制及两者之间的协同抗病作用研究进展,为系统了解植物几 丁质酶和 β-1,3-葡聚糖酶的作用模式以及植物抗病遗传改良提供参考资料。

• 番茄柱头外露性状研究进展

  赵攀, 沈渊博, 王新宇, 王晋, 黎玉顺, 祁世明, 梁燕

  番茄柱头外露属于部位雄性不育型重要性状,其花柱高于雄蕊,在杂交种子生产中无需人工去 雄,种子纯度高,制种成本低,不育性保持较容易,是近年来番茄(Solanum lycopersicum)雄性不育性利用与 研究的热点。本文归纳总结国内外番茄柱头外露性状相关 QTL、基因及其形成与调控等方面的研究进 展,总结了柱头外露型番茄性状的应用现状,提出了今后研究和应用的方向与对策,为加速我国番茄雄性 不育性状育种提供参考与见解。

• 鸭血管紧张素转换酶 2 (ACE2)真核表达载体的构建和稳定细胞株的筛选

  纪晓霞, 李帅, 曹西月, 张崇昊, 张源淑

  血 管 紧 张 素 转 换 酶 2 (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2) 是 肾 素 血 管 紧 张 素 系 统 (renin angiotensin system, RAS)的负调节分子和 SARS-coV-2 等冠状病毒的功能性受体。为丰富禽类鸭(Anas platyrhynchos) ACE2 蛋白的研究内容,探寻该蛋白与禽冠状病毒的关系,本研究利用 PCR 扩增鸭 ACE2 基 因编码区全长 ,通过同源重组与 pcDNA3.1(+)载体连接 ,构建真核表达体系 ,确定中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞的新霉素(geneticin, G418)最佳筛选浓度 ,pcDNA3.1(+)-ACE2 转染细胞后通过 G418 加压筛选单克隆细胞 ,采用 Western blot 和免疫荧光法对获得的细胞株进行鉴定 ,建立稳定表达鸭 ACE2 蛋白的细胞株,并测定其 ACE2 重组蛋白的酶活性。结果显示,成功克隆了鸭 ACE2 基因,其编码区 全长为 2 435 bp;成功构建 pcDNA3.1(+)-ACE2 真核表达质粒,单酶切验证 7 863 bp 左右出现单一条带;脂 质体法将重组质粒转染入 CHO 细胞 ,可表达外源 ACE2 重组蛋白 ;获得 3 株单克隆细胞株 ,分别命名为 pcDNA3.1(+)-ACE2-1、pcDNA3.1(+)-ACE2-2、pcDNA3.1(+)-ACE2-3;单克隆细胞株中提取的 ACE2 重组蛋 白具有较高的酶活性。本研究构建的鸭 ACE2 真核表达体系以及获得的可以稳定表达 ACE2 重组蛋白细 胞株,为鸭 ACE2 蛋白与冠状病毒等生物学功能的研究提供了基础,丰富了该蛋白的相关理论。

• 野生型枯草芽胞杆菌超级感受态的构建及效果评价

  刘功炜, 伍静昀, 金妙函, 王晓宇, 杨雨鑫, 陈玉林

  枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)因其安全性和良好的异源蛋白表达特性 ,被广泛应用于食品工 业、饲料发酵及生物工程等行业 ,尤其以模式菌枯草芽胞杆菌 168 为宿主菌进行基因工程改造的研究越 来越多。但是,来自自然环境的野生型枯草芽胞杆菌由于转化效率极低,其基因工程改造受到了很大程 度的限制。本研究通过双交叉同源重组方法 ,将源自枯草芽胞杆菌 168 的感受态转录因子(competence transcription factor, comK)基因融合木糖启动子 PxylA,并插入至野生型枯草芽胞杆菌 C6 (BS-C6)的胞外 丝氨酸蛋白酶(extracellular serine protease, epr)基因位点,成功获得野生型枯草芽胞杆菌超级感受态菌株 C6-comks。结果表明 ,超级感受态 C6-comks 的质粒转化效率可达到(4117±363) CFU/µg,相对 BS-C6 提 高了 8 倍(P<0.01),转化 PCR 纯化产物效率可达到(442±52) CFU/µg,超过 BS-C6 转化效率的 73.7 倍(P<0.01)。同时,荧光定量结果表明,C6-comks 中感受态形成关键基因 comK、comGB、comGF、comFA 和 comFC的基因表达量相对 BS-C6 分别极显著升高了 77、1 654、1 180、885 和 108 倍(P<0.01)。本研究成功构建了 野生型枯草芽胞杆菌超级感受态菌株,并分析了感受态转化效率产生差异的原因,为基于野生型枯草芽 胞杆菌作为表达宿主的基因工程应用提供了良好的借鉴。