农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2020年第9期

• 桃SPL基因家族成员鉴定及其基因表达与果实发育的相关性分析

  汪先菊, 张绍宇, 徐泽, 石佩, 康同洋, 李琴, 赵彩平

  SQUAMOSA启动子结合蛋白(SQUAMOSA promoter-binding protein like, SPL/SBP)基因家族在植物的胚胎、芽、叶片、花、果实等器官生长发育过程中起着重要作用。本研究鉴定了桃中SPL基因家族成员,并分析了其在不同组织及果实发育过程中的表达特性。结果表明,桃中共有25个PrupeSPL基因,其中除了PrupeSPL16缺少Zn-2结构外,其他所有PrupeSPL基因均含有1个SBP保守结构域,2个锌指结构和1个核定位信号。SPL基因家族的大部分成员在不同组织中均有表达,且多数成员在幼果中表达量较高。PrupeSPL1, 3, 4, 7, 8, 10, 13, 14, 16~21, 24, 25随着果实生长发育表达量显著下调,揭示这些成员可能参与了桃幼果发育的调控;而PrupeSPL1~4, 7, 8, 10, 16, 17, 19, 21随果实成熟软化呈显著上调表达趋势,表明这些成员可能与桃果实发育后期的成熟软化及衰老相关。本研究对桃PrupeSPL基因家族进行了系统的分析,初步筛选了可能参与调控桃果实生长发育和成熟软化进程的PrupeSPL基因成员,为进一步研究SPL基因在桃果实发育过程中的功能特性提供了基础资料。

• 利用CRISPR/Cas9技术制备CD163基因SRCR5序列敲除猪

  韩晓松, 高杨, 刘海龙, 熊友才, 谢胜松, 李长春, 李新云, 赵书红, 阮进学

  猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是养猪(Sus scrofa)业中的重要传染性疾病之一,CD163 (cluster of differentiation 163)是PRRS病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)入侵机体的重要受体,其第7外显子编码的SRCR5 (scavenger receptor cysteine-rich domain 5)是PRRSV侵染细胞的关键结构域。为生产能够抵抗PRRSV的基因编辑猪,本研究利用CRISPR/Cas9技术,同时将靶向猪CD163内含子6和7的2条小向导RNA (small guide RNA, sgRNA)与Cas9表达载体转染大白猪的胎儿成纤维细胞(pig embryonic fibroblast cells, PEFs)。利用有限稀释法挑选32株单克隆细胞,经PCR扩增与测序鉴定,获得SRCR5序列缺失的PEFs,其中纯合敲除效率为6.25%;随后以CD163基因编辑的纯合细胞为供体细胞进行体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT),获得1头正常存活的SRCR5序列缺失猪。本研究通过2条sgRNA精准敲除靶基因的功能结构域,可为相关研究提供方法学参考,所获得的CD163基因编辑猪可用于后续抗病育种研究。

• 秦川牛ANGPTL3基因g.-38T>C和g.509A>G的遗传多样性及其与生长和胴体性状的关联性分析

  李亚星, 成功, 赵云博, 王申元, 吴凯峰, 成立新, 刘剑锋, 周欢敏, 李光鹏, 昝林森, 佟彬

  肉牛(Bos taurus)的生长速度和胴体性状在肉牛产业中具有重要的经济价值。血管生成素样蛋白3 (angiopoietin-like protein 3, ANGPTL3)在动物脂质、葡萄糖和能量代谢反应中具有关键作用。已有研究表明,ANGPTL3基因上存在的g.-38T>C和g.509A>G突变位点与肉牛生长和胴体性状显著相关。为探究ANGPTL3基因g.-38T>C和g.509A>G位点对秦川牛(Qinchuan cattle)(B. taurus)生长和胴体性状的影响及其在不同黄牛群体中的多样性,本研究利用直接测序和MassARRAY技术,对599头牛—陕西秦川牛384头、山东鲁西黄牛(Luxi cattle) 24头、内蒙古蒙古牛(Mongolia cattle) 41头、蒙古国蒙古牛(Mongolia cattle) 50头、湖南巫陵牛(Wuling cattle) 50头和广西隆林牛(Longlin cattle) 50头的ANGPTL3基因g.-38T>C和g.509A>G位点进行基因分型和遗传多样性分析,并对其与秦川牛生长和胴体性状的关联性进行分析。结果表明,ANGPTL3基因g.-38T>C和g.509A>G位点在6个黄牛群体中均符合Hardy-Weinberg平衡;在秦川牛群体中,g.-38T>C位点存在TT(0.695)、TC(0.261)和CC(0.044) 3种基因型,该位点与眼肌面积和肌内脂肪极显著相关(P<0.01),与体斜长、腰角宽、胸围和背膘厚显著相关(P<0.05);该位点在秦川牛群体中的C等位基因频率与其他5个黄牛群体存在不同程度的显著差异。在秦川牛群体中,g.509A>G位点存在AA (0.690)、AG (0.279)和GG (0.031) 3种基因型,该位点与胸围和眼肌面积极显著相关(P<0.01),与体斜长、腰角宽、坐骨端宽和肌内脂肪显著相关(P<0.05);该位点在秦川牛群体中的A等位基因频率与其他5个黄牛群体存在不同程度的显著差异。g.-38T>C和g.509A>G位点联合分析结果显示,TC和AG基因型个体的眼肌面积和肌内脂肪显著高于TT和AA基因型个体(P<0.05)。综上所述,ANGPTL3基因g.-38T>C和g.509A>G位点与秦川牛的生长和胴体性状显著相关。本研究可为秦川牛分子标记辅助育种提供有效分子遗传标记,为秦川牛的遗传改良提供参考依据。

• 高粱转录因子基因SbSBP15的克隆及表达分析

  方远鹏, 蒋君梅, 杜巧丽, 陈美晴, 裴会敏, 屈志广, 任明见, 谢鑫

  SQUA启动子结合蛋白-box (SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN box, SBP-box)基因家族编码一类植物特有的SBP转录因子,在植物界分布广泛,参与植物生长、发育、繁衍等多方面调控,包括胚胎发生、次生产物合成、胁迫应答等,在作物改良方面具有价值。本研究主要通过生物信息学以及实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)方法,对高粱(Sorghum bicolor) SbSBP15基因进行克隆和表达分析。研究结果显示,该基因CDS全长1 227 bp (GenBank No. MT634207),编码408个氨基酸。SbSBP15蛋白含有1个典型SBP结构域,相对分子质量为42.19 kD,等电点为8.87;与玉米(Zea mays)相应的同源基因亲缘关系最近;亚细胞定位主要在细胞核;具较强的亲水性;蛋白互作网络分析表明,SbSBP15可与蛋白激酶相互作用。qRT-PCR分析表明,SbSBP15在高粱茎中表达量最高,受干旱和盐胁迫诱导表达;植物激素吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)处理后其表达上调,而水杨酸(salicylic acid, SA)则抑制其表达。SbSBP15蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3)菌株的原核表达结果显示,0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)于25 ℃诱导的表达量最高。本研究可为高粱分子遗传研究提供候选基因,为植物SBP15基因的生物学功能研究提供基础资料。

• Bt-Cry5Aa杀虫基因的原核表达、纯化及其在棉花中的鉴定

  马肖, 赵世浩, 王峰, 贺文, 陈金湘, 张秋平, 周仲华

  单一转苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)基因Cry1Ab/Cry1Ac抗虫棉(Gossypium)作为我国生产上大面积种植作物,随着种植时间及面积的增加导致害虫对Bt毒蛋白的抗性增强迫使新型Bt基因研究工作成为解决问题的关键。Cry5Aa是一种具有兼抗鳞翅目和线虫的新型Bt杀虫基因,由湖南农业大学棉花研究所成功转入棉花,并获得稳定遗传的'JX0010'、'JX0020'品系,本研究构建了Cry5Aa全长基因原核表达载体,优化了原核表达诱导条件,并且对其在转Bt-Cry5Aa基因棉花品系中的表达进行了鉴定。结果表明,在37 ℃ 220 r/min 1.0 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)条件下诱导4 h,其蛋白表达量最高。通过Western blot分析,发现蛋白分子量为79 kD,与理论值一致;同时,该蛋白以包涵体形式存在,通过谷胱甘肽-Sepharose4B小颗粒亲和层析纯化,蛋白纯度可达95%以上;转Bt-Cry5Aa基因棉花品系的鉴定实验表明：Cry5Aa基因能在转基因品系'JX0010'、'JX0020'中表达杀虫毒蛋白,且'JX0010'的Cry5Aa毒蛋白表达量在棉花不同时期及不同部位均高于'JX0020',且在生长期以蕾期为最高表达,植株部位上以叶片为最高表达。本研究构建了Bt-Cry5Aa杀虫基因的原核表达载体,获得了Cry5Aa的纯化蛋白,初步对其在棉花中的表达进行了鉴定,为对Bt-Cry5Aa杀虫基因的抗虫性、安全性等转基因检测及进一步在棉花中的应用提供了理论基础。

• 洋葱AcLOX2基因的克隆与表达分析

  高璐瑶, 李倩, 周雪梅, 王勇, 黄科, 王永勤

  植物脂氧合酶(lipoxygenases, LOXs)是一类非血红素和含铁的脂肪酸双氧合酶,在脂类氧化过程起到关键作用,对种子老化过程有一定影响。洋葱(Allium cepa)种子为短命种子,对实际生产造成严重影响。为研究LOX基因对洋葱种子发育及老化过程的影响,本研究以洋葱为实验材料,通过cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术对AcLOX2 (Gene Bank登录号：KX427168.1)cDNA全长进行克隆;结合生物信息学分析其基因序列特征;亚细胞定位研究其表达部位;利用qRT-PCR明确AcLOX2在洋葱种子不同时期、不同部位的表达模式。结果表明,AcLOX2全长3 087 bp,包含2 727 bp的开放阅读框,编码908个氨基酸;亚细胞定位揭示AcLOX2位于线粒体中;时空表达模式分析表明,AcLOX2在所有测量的组织中均有表达,其表达水平与衰老时间呈正相关。本实验初步证实了AcLOX2在种子老化过程中起重要作用,为洋葱种子短寿命机理的研究奠定了基础。

• GGTA1、GGTA1/β4GalNT2不同基因型敲除猪免疫原性检测

  刘春晨, 杜敏杰, 邢向阳, 鲁琳, 潘登科

  免疫排斥反应是限制异种器官移植的主要因素,本研究以获得α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase, GGTA1)敲除的巴马小型猪(Sus scrofa)和GGTA1、β1,4 N-乙酰半乳糖胺转移酶(β1, 4 N-acetylgalactosaminyl transferase, β4GalNT2)双基因敲除的巴马小型猪为基础,筛选低免疫原性群体。通过分离获得的不同基因型猪外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)与过异硫氰酸荧光素标记的植物凝集素(fluorescein isothiocyanate-griffonia simplicifolia isolectin B4, FITC-GSIB4)和双花扁豆凝集素(fluorescein isothiocyanate conjugated Dolichos bliflorus agglutinin, FITC-DBA)共孵育,检测GGTA1基因和β4GalNT2基因的表达情况;检测血液生理、生化指标,评估GGTA1/β4GalNT2双基因敲除对巴马小型猪健康的影响;检测不同基因修饰猪的混合PBMC与ABO血型系统的人(Homo saplens)血清孵育后IgG结合量,分析理想受体血型;检测不同基因修饰猪的PBMC与AB血型人血清孵育后IgG结合量,筛选低免疫原性供体基因型。GSIB4和DBA孵育结果显示GGTA1/β4GalNT2基因敲除猪细胞表面不表达相应抗原;生理生化检测结果显示,与野生型(wide type, WT)巴马猪相比,GGTA1-/-和GGTA1-/-/β-4GalNT2+/-基因修饰猪各项指标没有显著差异,GGTA1-/-/β4GalNT2-/-基因修饰猪中性粒细胞数显著减少,肌酸激酶和肌酐显著升高;不同血型血清孵育结果显示,与A型、B型和O型血IgG结合量相比,AB型血IgG结合量最低,为理想受体血型;不同基因型敲除猪血清孵育结果显示,与WT巴马猪和GGTA1-/-基因敲除猪相比,GGTA1/β4GalNT2双基因敲除猪IgG结合量下降,免疫原性降低。GGTA1/β4GalNT2基因敲除巴马小型猪免疫原性进一步降低,与AB血型人血清产生的免疫排斥反应最低。本研究为未来异种器官移植临床试验提供了免疫排斥相关数据。

• 牛QPCT基因为母源等位基因表达的印记基因

  谷书凯, 刘晓倩, 李俊良, 陈玮娜, 张萃, 李冬杰, 李世杰

  基因组印记是哺乳动物中存在的一种单等位基因表达的表观遗传学现象。基因组印记与动物的生长发育以及疾病的发生有密切联系。谷氨酰胺肽环转移酶(glutaminyl-peptide cyclotransferase, QPCT)参与蛋白质的翻译后修饰,与人类(Homo sapiens)多种精神疾病有关。Qpct基因在小鼠(Mus musculus)中为胎盘特异的父源印记基因,而在牛(Bos taurus)中的印记状态尚未有研究报道。本研究旨在揭示QPCT基因在牛中的印记状态以及DNA甲基化修饰在调控QPCT基因印记中的可能作用。首先应用基于单核苷酸多态的反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)产物直接测序法对QPCT基因在牛6个组织(心脏, 肝脏, 脾脏, 肺脏, 肾脏和大脑)和胎盘中的等位基因表达状态进行分析,发现QPCT基因在被检测的6个组织和胎盘中均为单等位基因表达。通过分析胎盘父本和母本的基因型,确定QPCT在牛的胎盘中为母源等位基因表达。进一步通过亚硫酸氢盐测序法分析QPCT基因启动子区的CpG岛在牛胎盘和组织中的甲基化状态,发现被检测区域的55个CpG位点在胎盘和组织中均呈现轻甲基化,表明QPCT基因启动子区的DNA甲基化修饰不参与调控QPCT基因在牛中的印记表达。本研究可为深入探讨QPCT基因的功能提供参考依据。

• 黔北麻羊HSD3B1基因真核表达载体构建及其对卵巢颗粒细胞的影响

  洪磊, 陈祥, 敖叶, 周志楠, 唐文, 韦仕南

  3β-羟基类固醇脱氢酶-1 (3β-hydroxysteroid dehydrogenase 1, HSD3B1)是类固醇激素家族中的关键成员之一,与动物的繁殖性状密切相关。为了克隆黔北麻羊(Capra hircus) HSD3B1基因,构建真核表达载体,探究其对产羔性状相关基因在卵巢颗粒细胞表达的影响,本研究采集黔北麻羊卵巢组织进行卵巢颗粒细胞培养并提取组织中的总RNA,反转录为cDNA,克隆黔北麻羊HSD3B1基因(GenBank No. NM_001135932.1) CDS区全长序列,并进行生物信息学分析;同时将构建的HSD3B1基因真核表达载体,转染至卵巢颗粒细胞,qRT-PCR检测HSD3B1、山羊产羔性状相关的骨形成蛋白15基因(bone morphogenetic protein 15, BMP15)、生长分化因子9基因(growth differentiation factor 9, GDF9)、骨形态发生蛋白受体1B基因(bone morphogenetic protein receptor type 1B, BMPR-1B)的mRNA表达水平。结果发现：T-克隆的黔北麻羊HSD3B1基因CDS区为1 122 bp,编码373个氨基酸,与NCBI上登录的绵羊(Ovis aries)的mRNA序列相同;蛋白预测结果显示：黔北麻羊HSD3B1蛋白的分子式为C1940H3002N506O543S15,相对分子质量为42.583 14 kD;等电点为7.96;遗传进化树分析得出,黔北麻羊HSD3B1基因与牛(Bos taurus)的遗传距离最近;qRT-PCR结果显示,转染实验组HSD3B1表达量极显著高于空白组(P<0.01),产羔性状相关的GDF9基因表达量极显著高于空白对照组(P<0.01),BMP15基因的表达量显著高于空白对照组(P<0.05),表明HSD3B1基因的超表达可以促进产羔相关的GDF9基因和BMP15基因在卵巢颗粒细胞的表达。本研究成功构建pEGFP-N3-HSD3B1真核表达载体,检测HSD3B1基因对黔北麻羊产羔性状相关基因的表达影响,为进一步研究HSD3B1基因对黔北麻羊产羔性状的影响提供基础资料。

• 雄性小鼠生殖轴组织中AURKA表达定位及敲低后对双氢睾酮合成代谢的影响

  赵彩英, 李怡娜, 王琪, 甘泽, 张勇, 马友记, 张全伟, 赵兴绪

  极光激酶A (aurora kinase A, AURKA)是细胞周期有丝分裂调节蛋白激酶之一,参与调控生殖细胞的发生和成熟。研究表明AURKA是雄激素受体(androgen receptor, AR)的靶基因,双氢睾酮(dihydrotestosterone, DHT)与胞内AR结合后促进精子成熟。因此,探究AURKA与DHT的作用机制对雄性动物生殖及相关疾病的研究有重要意义,但其具体作用及机制尚不完全清楚。本研究采集8周龄昆明雄性小鼠(Mus musculus)下丘脑、垂体和睾丸组织生殖轴器官组织,通过半定量PCR、免疫印迹(Western blot, WB)、苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)和免疫组化学染色(immunohistochemistry, IHC),探究AURKA在雄性小鼠性腺轴的表达规律及定位。设计AURKA-siRNA干扰序列,转染原代成年小鼠睾丸支持细胞,利用实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, qRT-PCR)和WB检测转染24 h后,细胞AURKA和5α-还原酶1 (5α-reductase type 1, SRD5A1)基因和蛋白表达变化;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)分析AURKA-siRNA干扰睾丸支持细胞对DHT含量的变化。结果表明,雄性小鼠性腺轴器官的组织中AURKA基因和蛋白均有表达,且睾丸组织中其表达量极显著高于下丘脑和垂体(P<0.01);睾丸支持细胞及精子中AURKA蛋白阳性反应最强;AURKA-siRNA干扰小鼠支持细胞24 h后,AURKA基因和蛋白的表达明显下调(P<0.05),而SRD5A1基因和蛋白表达显著上调(P<0.05)且DHT的含量显著增加(P<0.05)。说明AURKA负反馈调控SRD5A1表达促进DHT合成,本研究为雄性动物生殖过程中AURKA功能研究提供参考依据。

• 鸭不同羽色毛囊组织差异表达基因转录组测序分析

  蒋兵兵, 黄曼曼, 白天, 曾涛, 陈黎, 沈军达, 陶争荣, 周玮, 刘国发, 卢立志, 李海英

  羽色作为鸭(Anas platyrhynchos)的重要经济性状和品种特征,有着重要的研究意义,但其遗传机制尚不明确。为研究鸭不同羽色毛囊组织转录组差异、丰富鸭毛囊转录组数据信息,本研究选用'连城白鸭'与'樱桃谷鸭'杂交F1代花色羽鸭4羽(取每羽鸭背部黑色羽毛和腹部白色羽毛, 共8个样品),利用二代测序分析了同1个体不同羽色毛囊组织的转录组特征。本研究共获得449 067 116个高质量数据,总碱基数目为67.36 Gb,每个样本均获得了7.4 Gb以上的碱基,8个样品平均GC含量为52%,碱基测序错误率低于1% (Q20)的数据均在96.73%以上,其中平均73.94%的高质量数据可比对到鸭参考基因组上。对两种羽色毛囊组织转录组进行比较,发现有231个差异表达基因,其中相较于白羽毛囊组织而言,黑色毛囊组织中上调基因有175个,下调基因有56个,包括与黑色素合成过程相关的基因,如酪氨酸相关蛋白1基因(tyrosinase-related protein1, TYRP1)、酪氨酸酶基因(tyrosinase, TYR)、干细胞因子受体基因(stem cell factor receptor, KIT)、溶质载体45家族第2成员基因(solute carrier family 45 member 2, SLC45A2)、黑素亲和素基因(melanophilin, MLPH)、黑色素A基因(melan-A, MLANA)、多巴色素异构酶基因(dopachrome tautomerase, DCT/TYRP2)、瞬时受体势M亚基1基因(transient receptor potential cation channel subfamily M member 1, TRPM1)、眼皮肤白化病Ⅱ型基因(oculocutaneous albinism type Ⅱ, OCA2)、SOX基因家族第10成员(SOX gene family member 10, SOX10)等,且这些基因在黑色羽毛毛囊中表达量要显著高于在白色毛囊中表达量。基因本体(Gene Ontology, GO)分析发现19个差异基因显著富集于8个GO term,包括G蛋白偶联受体信号通路、跨膜受体活性、分子传感器活性等;KEGG通路分析表明3个通路显著富集,包括神经活性配体-受体相互作用、酪氨酸代谢和黑色素合成通路,其中黑色素合成通路和酪氨酸代谢通路与鸭羽毛颜色形成密切相关,参与黑色素合成通路的有TYRP1、TYR、KIT、DCT等5个差异表达基因,参与酪氨酸代谢通路的基因有TYRP1、TYR、DCT。经qRT-PCR验证,基因表达变化模式与转录组测序结果一致,表明测序结果准确。研究结果提示鸭羽毛毛囊中TYRP1、TYR、KIT、DCT、SLC45A2、TRPM1、MLANA、MLPH、SOX10、OCA2等基因的下调可能是造成鸭白羽的原因之一,揭示了酪氨酸代谢和黑色素合成信号通路在鸭羽毛颜色表型形成中发挥了重要作用。本研究为鸭毛囊组织基因表达谱提供了新的信息,为探究鸭羽色性状的遗传机制及分子标记育种提供了基础材料。

• 基于COI基因的鸽遗传多样性和品种鉴定研究

  陆俊贤, 贾晓旭, 付胜勇, 唐修君, 樊艳凤, 葛庆联, 卜柱, 高玉时

  我国鸽(Columba livia)产量仅次于鸡(Gallus gallus)、鸭(Anas platyrhynchos)、鹅(Anser cygnoides orientalis),为名副其实的第四家禽。研究鸽遗传资源的遗传多样性和品种鉴定,对于品种的保护和开发利用有重要的意义。本研究对白羽王鸽、泰深鸽和银王鸽3个群体的线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (cytochrome C oxidase subunit Ⅰ, COI)基因全序列进行PCR扩增和测序。结果表明,鸽mtDNA COI基因全长为1 551 bp,没有发现插入和缺失,编码517个氨基酸。共计检测到核苷酸变异位点7个,定义了6个单倍型,其中单倍型Hap1和Hap2为3个鸽品种共享,出现频率分别为26次和15次。总体单倍型多样性、核苷酸多样性和平均核苷酸差异数分别0.726、0.000 98和1.518,其中银王鸽最高,白羽王鸽最低。系统发育分析发现,家鸽和原鸽可以分为A和B 2个世系分支,中介网络图以Hap1为中心节点,呈星状发散分布,经历过群体扩张。上述结果揭示,鸽COI基因突变较少,相对较为保守,不太适合区分不同鸽品种,但可以作为遗传标记研究遗传多样性和起源。该研究结果提供了鸽遗传多样性和遗传结构信息,为以后相关研究提供了参考依据。

• NONHSAT184603.1基因对解旋酶基因BLM表达的影响

  杨丽红, 吴小敏, 崔小芝, 吴巧群, 罗斌杰, 谌颖莲, 许厚强

  解旋酶BLM (bloom helicase)在细胞的增殖生长过程中有着重要的调控作用,YAP (yes associated protein)和TAZ (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)蛋白作为哺乳动物Hippo信号通路下游的转录共激活因子和关键成分,参与调控细胞的增殖、凋亡以及迁移等多种生理过程,而长链非编码RNA (long non-coding RNA, LncRNA)在细胞的生长增殖过程中具有重要的调控作用。为探究LncRNA对BLM、YAP、TAZ表达的影响,本研究通过mirBase (http://www.mirbase.org/)、NONCODE (http://www.noncode.org/)及自主开发程序SWChen 2.3筛选与BLM解旋酶相关的LncRNAs,利用荧光定量PCR技术检测筛选的LncRNA在22RV-1、PC3、LNCap、WPMY-1四种细胞系中的表达情况,构建LncRNA超表达载体,检测转染后24及48 h LncRNA对BLM、YAP及TAZ的影响。本研究以筛选出的NONHSAT184603.1 (缩写为N183)(GenBank No. m121218_085412_00126_c100)为候选基因,荧光定量PCR检测结果显示,N183在前列腺癌细胞系22RV-1和LNCap细胞中的表达极显著低于前列腺正常上皮细胞系WPMY-1 (P<0.01),但在前列腺癌细胞系PC3中的表达极显著高于WPMY-1 (P<0.01);WPMY-1细胞转染N183超表达载体24 h后与对照组比较,BLM表达极显著下调(P<0.01),且TAZ表达也是极显著下调(P<0.01),转染48 h后BLM和YAP表达均极显著上调(P<0.01);PC3细胞在转染48 h后,BLM表达量显著下调(P<0.05),但YAP和TAZ表达差异不显著(P>0.05);以上结果表明N183在前列腺癌细胞及正常细胞中能够抑制BLM基因的表达,但对增殖指标基因YAP和TAZ的影响具有差异,为今后以BLM解旋酶为抗癌靶标对抗癌症提供基础数据。

• 表达鸭源鸡杆菌flfA的重组乳酸杆菌构建及口服免疫效果评价

  王坤芃, 刘盼盼, 夏银河, 高冬生, 常洪涛, 王新卫, 李永涛, 赵军, 陈陆, 王川庆, 杨霞

  蛋鸡(Gallus?gallus domesticus)输卵管炎与输卵管囊肿是危害养禽业的重要疫病,引起该病的病原较多,其中鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)是比较常见的病原。目前,乳酸菌作为食品级的表达载体在研制活载体疫苗中被广泛应用。本研究以干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei, CECT5276)作为递呈抗原的活菌载体,构建能够稳定表达鸭源鸡杆菌菌毛FlfA蛋白的重组干酪乳酸杆菌,并初步评价其免疫效果。首先将鸭源鸡杆菌flfA基因克隆至穿梭表达质粒pMG36e,然后电转化干酪乳酸杆菌,对重组菌中FlfA蛋白表达和重组菌生长状况、稳定性、存留性能及耐受力等进行检测分析,初步评价重组菌的免疫效果。SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组干酪乳酸杆菌成功表达分子量约为20.3 kD的融合蛋白,该蛋白能与兔抗鸭源鸡杆菌阳性血清发生反应,具有反应原性;生长状况及稳定性等分析显示,目的基因的插入对干酪乳酸杆菌生长无影响,可在宿主菌中稳定遗传;在模拟肠液、胃液及高盐环境中均有较好的耐受力;免疫后第14、28、42 d免疫血清及肠道黏液的特异性IgG和sIgA的抗体水平均高于空载体组和PBS对照组(P<0.05);动物攻毒试验结果显示,3组受试鸡腹腔注射鸭源鸡杆菌PDS-RZ-1-SLG菌株后均未见死亡,但是免疫重组菌的鸡脏器中鸭源鸡杆菌分离率低于空载体组和PBS组,提示重组菌对鸡具有一定的免疫保护作用。本研究可为鸭源鸡杆菌口服疫苗研究提供参考依据。

• 水稻单基因系品种IRBL9-W抗瘟初期基因表达谱分析

  姜兆远, 任金平, 李莉, 刘晓梅, 朱峰, 王继春, 孙辉

  水稻(Oryza sativa)单基因系品种'IRBL9-W' (含抗病基因Pi9)对吉林省采集的大部分稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)菌株表现抗性,说明含无毒基因(avirulence, AVR)的菌株在吉林省广泛存在。为了探究Pi9与无毒基因互作(AVR-Pi9)初期水稻基因表达谱及其抗病相关信号通路中基因表达情况,本研究将稻瘟菌菌株C2 (AVR-Pi9)接种于水稻单基因系'IRBL9-W' (Pi9),通过高通量RNA-Seq技术对接种36 h后的水稻叶片和未接种水稻叶片进行转录组表达谱分析,共获得差异表达基因2 311个。基因功能注释和代谢通路分析显示转录调控因子中4个亮氨酸拉链蛋白基因中1个上调表达,1个锌指蛋白基因上调表达,而WRKY蛋白基因全部下调表达;真菌细胞壁降解酶中10个几丁质酶基因中2个上调表达,2个β-1,3葡聚糖酶基因全部下调表达;植物-病原体互作信号通路中1个病程相关蛋白1基因(pathogenesis-related protein 1, PR1)上调表达,其他基因下调表达;类黄酮化合物生物合成信号通路中的差异表达基因全部上调表达;苯丙素类化合物生物合成信号通路中9个基因上调表达1个基因下调表达。3个信号通路中差异表达基因产物,主要参与活性氧的产生、过敏性坏死反应及抗氧化过程。信号通路中差异基因产物对应化合物的功能包括抗氧化、抑菌及木质化作用。本研究为进一步了解水稻抗稻瘟病机制提供理论依据。

• 食用昆虫斗米虫的微生物安全性评价

  蔡泱莲, 邱凡, 黄宽官, 张心齐, 吴鸿, 黄俊浩

  斗米虫是桑天牛(Apriona germari)和锈色粒肩天牛(A. swainsoni)寄生于豆科植物云实(Caesalpinia decapetala)树干的幼虫,具有丰富的营养价值和药用价值,一直在民间被广泛流传和应用。本研究拟为斗米虫的食用安全性评价提供参考依据。首先通过高通量测序和传统培养两种方法对鲜食斗米虫的微生物群落结构进行表征,进一步根据GB4789.1-2016和ISO标准,针对食品微生物学安全性检验要求的肠杆菌(Enterobacteriaceae)、酵母菌(Saccharomycete)、霉菌和乳酸菌(Lactobacillales) 4类微生物进行分析,并针对耐热菌进行传统培养。结果表明,两种斗米虫的微生物群落组成无显著差异。细菌群落结构中,桑天牛幼虫以变形菌门、带氧发光菌门和拟杆菌门为主,锈色粒肩天牛以变形菌门、厚壁菌门和放线菌门为主。子囊菌门和担子菌门为两种斗米虫真菌群落的优势菌群,其中以子囊菌门占绝对优势。安全性检测相关指标的分析表明,对于桑天牛和绣色粒肩天牛,在细菌丰度中,肠杆菌科分别占60.28%和39.82%,乳杆菌目分别占1.24%和3.65%;在真菌丰度中,霉菌分别占40.26%和6.74%,酵母分别占59.74%和93.26%,其中常见有害酵母21属。此外,两种斗米虫中还存在葡萄球菌属、链霉菌属、不动杆菌属、假单胞菌属等4个具有潜在危害的耐热菌种属,在50 ℃、60 ℃和70 ℃处理后菌落数显著减少,80 ℃条件下基本完全灭活。上述研究结果表明,斗米虫中存在多种潜在的腐败细菌和食物病原体,通过热处理等具有微生物灭活作用的加工步骤可避免或最小化食用安全风险。本研究基于高通量测序的安全评价,可对食用昆虫卫生标准提供参考依据。

• 基于合成生物学的功能微生物在种植业生产中的研究进展

  迟佳妮, 郭明璋, 刘洋儿, 许文涛

  合成生物学将工程学和生命科学结合在一起,以设计和构建自然界中目前不存在的新的生物部件、设备和系统,或调整现有生物系统的设计。与传统转基因技术相比,合成生物学使用基因组设计、合成方面的新技术以及更有效的分子工具,可以更高效、更广泛地开发新品种、新技术应用。由于合成生物学具有靶向性强、操作简便、应用周期短、灵敏度高等特点,利用合成生物学替代传统农业技术、生物技术可以为农业生产变革带来巨大潜力。本文综述了基于合成生物学的功能微生物在土壤监测与修复、促进植物生长、植物病原体检测、农产品安全检测、植物天然产物生产等方向的研究进展,阐明了现阶段合成生物学用于种植业生产中的潜在问题,在数据库层面、技术层面、安全层面及监管层面分析并提出解决方案。

• 猪病毒性腹泻病相关病原的MLPA检测技术的建立及应用

  何海健, 刘正奎, 吴瑗, 王志鹏, 陈琳, 王磊, 周莹珊, 蒋春燕, 宋厚辉, 王晓杜

  每年冬春季爆发于规模化养猪场的腹泻常由不同病毒引起,临床表现为相似腹泻症状。为了区分临床腹泻样本中的病毒性病原体,迫切需求建立一种快速同时检测常见6种病毒性腹泻疾病的病原技术。本研究针对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)S基因、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)N基因、猪Delta冠状病毒(Porcine delta coronavirus, PDCoV)N基因、猪博卡病毒(Porcine bocavirus, pBCaV)NS1基因、猪诺如病毒(Porcine norovirus, pNoV)RdRp基因、猪轮状病毒(Porcine rotavirus, pRV)NSP1基因的核酸保守区域, 设计多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)探针和预扩增引物,利用MLPA技术和毛细管电泳技术,建立检测6种疾病病原核酸的检测方法。结果表明,单一探针检测混合模板,显示出高度特异性;混合探针总浓度在1.33 nmol/L时,各种疾病扩增条带具有特异性且与预期大小一致,pBCaV、pNoV、PDCoV、PEDV、 pRV 、TGEV分别约为102、110、117、124 、131、138 bp。本方法与其他临床疾病如猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪瘟病毒(Classic swine fever virus , CSFV)、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2 , PCV2)没有交叉反应,特异性佳。pBCaV、pNoV、PDCoV、PEDV、 pRV 、TGEV检测最低极限值分别为：7.58×101、7.56×100、7.54×100、7.53×100、7.50×101和7.49×100 copies/µL。组间和组内重复性好,利用本方法检测临床收集和模拟样本67份,PEDV与病毒分离方法100%符合,pRV 、TGEV、pBCaV、pNoV、PDCoV与病毒模拟样本符合率达到100%。本研究为临床提供一种新型的可同时检测6种腹泻病原的技术,为临床疾病防控快速反应提供技术支持。