农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2024年第10期

• 水稻miR169基因家族成员的进化及热应激响应研究

  吴雪瑜, 沈秋平, 谢裕俊, 陈家怡, 於金生

  微小RNA (microRNA, miRNA)是长约18~22个碱基的高度保守的非编码RNA,参与植物应对多种非生物胁迫。前期高通量测序发现miR169家族部分成员响应高温胁迫。本研究采用生物信息学工具预测miR169家族的染色体分布、序列结构特征、系统发育关系和倍增情况;利用qRT-PCR检测高温胁迫处理下多个时间点的水稻(Oryza sativa)苗期miR169家族成员及其靶基因的表达。结果显示,miR169家族有2个主要进化分支,成员扩增方式主要为多次串联重复与染色体片段倍增,位于同一分支的miR169h、miR169l、miR169i和miR169m是水稻进化过程中的活跃基因簇,其中3个成员miR169h、miR169l、miR169i均积极响应热应激,预测的靶基因—核因子Y-A1 (nuclear factor Y-A1, NF-YA1)在高温处理16~24 h呈现表达下调的变化趋势。综上所述,水稻miR169基因家族miR169h、miR169i和miR169l响应水稻不温和热应激,可能在水稻耐热性方面发挥重要作用。本研究为深入探讨miRNA参与水稻热应激的分子调控机制提供基础资料。

• 水稻粒长基因GW7的分子标记开发与利用

  郑国利, 顾巧美, 杜明, 方玉, 王攀

  水稻(Oryza sativa)粒长是重要的农艺性状,与水稻产量和稻米外观品质密切相关。为进一步挖掘改良水稻粒长新的分子标记,本研究在前人克隆的基础上,根据GW7基因(Gene ID: 10208)在功能区域上发生的单碱基突变,结合五引物扩增受阻突变体系(penta-primer amplification refractory mutation system, PARMS)技术,开发了GW7基因荧光分子标记。结合粒长表型及PCR测序,对该标记在13个水稻亲本材料的检测结果表明,该标记可以准确鉴定出不同的GW7基因型。之后,利用该标记从94份水稻材料中筛选到了16份纯合GW7基因型的材料;分子标记辅助选择的结果表明,在'R91'和'卓20'的F2代中,可以获得粒长增加的优良水稻材料。本研究所选标记能够在苗期筛选目标单株,开花期进行杂交、回交,无需等到成熟收获,从而加快水稻外观品质的育种进程。

• 贝莱斯芽胞杆菌WB对西瓜植株的促生效应和机制

  陈忠男, 王志刚, 徐伟慧

  西瓜(Citrullus lanatus)是最受欢迎的水果之一,随着人们对生活品质的不断追求,提高产品质量已成为农作物高销量的关键因素。植物根际促生菌是一类能够促进植物吸收土壤中营养元素并提高植物健康的有益细菌。为了探究贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)菌株WB对西瓜植株的促生效应。本研究以菌株WB和西瓜种子为材料,使用功能性培养基解析菌株WB的促生能力,采用种子萌发实验以及盆栽实验验证菌株WB的促生效应并利用转录组测序(RNA sequencing, RNA-seq)技术阐释菌株WB的促生机制。结果表明,贝莱斯芽胞杆菌WB具有产生长素(indole-acetic acid, IAA)与纤维素酶的能力,还具有解磷、解钾和固氮的能力。种子萌发实验和盆栽实验的结果表明,菌株WB对西瓜植株的生长有促进作用。此外,菌株WB上调了与植物促生长相关的信号通路中基因的表达,包括：半萜和三萜类生物合成、苯丙烷类生物合成和植物激素信号转导途径;参与促进生长的转录因子,如MYB (myeloblastosis)、NAC (NAM, ATAF, CUC)和Dof (DNA binding with one finger)等也被诱导上调表达。综上,本研究发现了贝莱斯芽胞杆菌WB可以促进西瓜生长并对其促生机制进行了阐释,为其进一步应用提供了理论依据。

• 红麻基因组WRKY家族成员的鉴定及其在镉胁迫下的表达分析

  李辉, 陈安国, 唐慧娟, 栾明宝

  重金属镉污染农田的修复是世界性的难题。红麻(Hibiscus cannabinus)耐逆性强,可用于镉污染农田的修复。为了探索红麻WRKY家族成员对镉胁迫的响应模式,本研究利用HMMER和BLAST软件在红麻基因组中鉴定获得HcWRKY家族成员,并通过ExPasy在线网站获得了HcWRKY家族成员的分子信息,同时利用TBtools v1.6软件将家族成员全部定位到相应染色体上。结果表明,33个HcWRKY家族成员不均匀地分布在12条染色体上,其理化性质,如氨基酸数量、蛋白质分子量和理论等电点各不相同。除HcWRKY4-2位于细胞质外,其他HcWRKY成员均定位于细胞核内。系统发育分析表明,33个HcWRKY蛋白分为4组：其中第Ⅱ组和第Ⅳ组仅含HcWRKY家族成员;第Ⅰ组和Ⅲ组同时含有HcWRKY和AtWRKY家族成员。实时荧光定量PCR分析表明,受镉胁迫诱导表达的HcWRKY家族成员有24个。在红麻响应镉胁迫反应过程中22个HcWRKY家族成员基因表达量上调,2个HcWRKY家族成员基因表达量下调。这可能是红麻耐镉能力强的一个重要因素。本研究结果为进一步探索HcWRKY基因家族在红麻响应镉胁迫过程中的生物学功能提供了基础资料。

• 紫薇WOX家族基因鉴定及其对愈伤诱导的影响

  康佳音, 池秀凤, 申萍, 王鑫, 万志庭, 蔡明, 程堂仁, 王佳, 张启翔, 潘会堂

  作为植物特有的转录因子,WUSCHEL同源异型盒(WUSCHEL-related homeobox, WOX)基因家族对植物的生长发育、组织器官发生和形成具有重要的调节作用。本研究利用生物信息学方法,在紫薇(Lagerstroemia indica)全基因组中鉴定出15个WOX基因家族成员,命名为LfiWOX1~LfiWOX15,分布在14条染色体上,家族成员间分子量和等电点有较大差异,亚细胞预测15个基因均定位于细胞核上。系统进化分析表明,15个基因共聚为3类,紫薇WOX家族成员中存在5个与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)紧密相关的直系同源WOX成员,多个含有特定保守基序的WOX蛋白在进化树的同一分支上,所有家族成员都含有motif 1、motif 2和motif 5。WOX家族基因包含9种与植物生长发育、激素调控和逆境胁迫相关的顺式作用元件,不同成员含有不同的元件。qRT-PCR分析表明,与叶片相比,LfiWOX12、LfiWOX13、LfiWOX15在愈伤组织中表达量升高,是叶片中的1.5~1.9倍,其他基因在愈伤组织中表达量降低,是叶片中的0.1%~90%,说明LfiWOX12、LfiWOX13、LfiWOX15与愈伤形成相关。本研究为进一步研究紫薇WOX基因对愈伤诱导的调控提供了依据,为紫薇高效再生及遗传转化体系的建立提供参考。

• 牛RASGRF1基因的组织印记表达与分析

  张银蛟, 陈玮娜, 王思伟, 李冬杰, 杨利丹, 郑云畅, 张萃, 王昆, 李世杰

  基因组印记是哺乳动物中的一种表观遗传学现象,其基因呈现亲本特异性的单等位基因表达。印记基因在胚胎发育以及胎盘的营养运输中发挥着重要作用。Ras蛋白特异性鸟苷酸释放因子1 (Ras protein specific guanine nucleotide releasing factor 1, RASGRF1)基因编码140 kD的Ras特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子,并且该基因与动物幼年时期的生长发育性状相关。Rasgrf1基因在小鼠(Mus musculus)中是父源印记基因,而在牛(Bos taurus)中的印记状态尚未研究。为研究RASGRF1基因在牛中的印记状态和调控机理,本研究首先利用qRT-PCR对RASGRF1基因在牛的6个组织(心脏, 肝脏, 脾脏, 肺脏, 肾脏, 大脑)及胎盘中的表达进行分析,然后应用基于SNP的逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)产物直接测序法分析RASGRF1基因在牛的组织及胎盘的等位基因表达状态,最后采用亚硫酸盐直接测序法对RASGRF1基因启动子区域的甲基化状态进行研究。结果显示,RASGRF1基因在牛中呈现组织特异性表达,在心脏和肝脏中没有检测到表达;在脾脏、肺脏、肾脏和大脑中为单等位基因表达;在胎盘中为父源等位基因表达。在牛RASGRF1基因启动子及第1个外显子区域没有发现差异甲基化区(differential methylation region, DMRs),在被检测的组织(心脏, 肝脏, 脾脏, 肺脏, 肾脏, 大脑)、胎盘和精子中均为轻甲基化,说明该区域的甲基化修饰不参与调控RASGRF1基因的印记表达,其印记表达可能由其他的表观遗传修饰调控。本研究可为深入研究RASGRF1基因的功能以及印记调控机制提供参考依据。

• 妊娠中期和后期牦牛胎盘组织中ELANE表达、定位及功能分析

  陈文丽, 张博皓, 李建富, 袁宝, 周斌, 张勇, 赵兴绪, 张全伟

  哺乳动物妊娠和分娩过程与胎盘炎症发生和发展密切,炎症反应过早或免疫失衡可导致妊娠终止或流产。中性粒细胞弹性蛋白酶(elastase, neutrophil expressed, ELANE)在炎症发生和发展过程中发挥重要作用。本研究旨在探究妊娠中期和后期牦牛(Bos grunniens)胎盘组织中ELANE定位、表达规律及潜在功能。采集妊娠中期和后期牦牛胎盘组织(n=3/组),通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色、免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色、免疫荧光(immunofluorescence, IF)染色、实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)分析ELANE的定位及表达;基于数据非依赖型模式(data-independent acquisition, DIA)蛋白质组学数据预测牦牛胎盘中ELANE潜在生物学功能。HE显示妊娠中期牦牛胎盘组织可见大量滋养层巨细胞和单核滋养层细胞;妊娠后期滋养层细胞数目减少。IHC和IF表明,ELANE蛋白主要定位于牦牛胎盘滋养层巨细胞和单核滋养层细胞胞质。qRT-PCR和Western blot显示,与妊娠中期相比,妊娠后期牦牛胎盘组织ELANE基因及其蛋白表达显著上调(P<0.01)。生物信息学分析发现,ELANE可能通过吞噬作用、细胞外空间的组成、丝氨酸型内肽酶活性和与细胞因子结合等途径调控妊娠中期和后期牦牛胎盘的生长发育。综上,ELANE可能通过调节牦牛胎盘滋养层细胞的功能调控胎盘动态发育和妊娠维持。本研究为深入探讨牦牛胎盘组织ELANE功能提供参考。

• 牦牛瘦素基因克隆及其在肾周和皮下脂肪组织的表达和分布

  范伟峰, 陈付菊, 赵宇田, 李颖帮, 童依然, 陈杏娣, 胡亚青

  瘦素(leptin)在机体能量平衡及脂肪沉积方面具有重要作用,其在牦牛(Bos grunniens)能量代谢中的作用尚不明确。本研究采集1和30日龄的健康雄性犊牦牛肾周和皮下棕色及白色脂肪组织,通过RT-PCR克隆leptin基因编码区序列(CDS),采用生物信息学方法分析其序列特征,并利用qRT-PCR和免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色方法检测其在牦牛肾周和皮下脂肪组织中的表达和分布。结果显示,牦牛leptin基因CDS序列(GenBank No. PP385937)长504 bp,编码167个氨基酸,与野牦牛(Bos mutus)的同源性可达99.01%,表明该基因在进化过程中较为保守。基因表达分析显示,与1日龄比较,30日龄牦牛肾周和皮下脂肪组织中leptin基因表达量显著增加(P<0.05)。免疫组织化学染色显示,1和30日龄牦牛的肾周和皮下棕色及白色脂肪细胞膜上均有leptin阳性染色,30日龄的染色强度均显著高于1日龄(P<0.05)。本研究为深入阐明leptin在牦牛寒冷适应中的作用机制提供了基础资料。

• LOC112447378/miR-15a/PRLR信号轴对MAC-T细胞增殖及凋亡的调控及机制

  高梦静, 韩承芮, 张晓雨, 郭月美, 刘思萌, 谢圣浩, 李秋玲, 齐颖

  全球气候变暖使奶牛(Bos taurus)热应激问题日益突出,给乳业带来巨大的经济损失。阐明奶牛热应激发生及应答的分子机制,可以更好地解决热应激问题。本研究团队前期通过高通量测序技术筛选出热应激与非热应激差异表达的长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)、微小RNA (microRNAs, miRNA)及mRNA表达谱。本研究通过生物信息学分析,筛选并确定LOC112447378/ miR-15a/PRLR为热应激应答关键竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)网络。通过牛乳腺上皮细胞(mammary alveolar cells-large T antigen cells, MAC-T)构建体外热应激模型,以此模型为基础,通过qRT-PCR技术确定LOC112447378、miR-15a和催乳素受体(prolactin receptor, PRLR)的mRNA表达水平,通过Western blot技术确定PRLR的蛋白质水平,均与高通量测序结果一致。过表达miR-15a后, LOC112447378的mRNA表达水平显著下调;PRLR的mRNA及蛋白质水平均显著下调。敲降miR-15a后,LOC112447378的mRNA表达水平显著上调;PRLR的mRNA及蛋白质水平均显著上调。噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)检测结果显示,miR-15a抑制MAC-T的增殖。Annexin V-FITC/ PI双染检测结果显示,miR-15a促进MAC-T的凋亡。这些结果表明,miR-15a可以靶向调控靶基因LOC112447378和PRLR,进而实现抑制MAC-T增殖、促进凋亡的调控作用。LOC112447378/ miR-15a/PRLR信号轴可以影响MAC-T的增殖及凋亡,进而在MAC-T的热应激应答过程中发挥重要调控作用。本研究为今后筛选耐热、高产奶牛的分子育种工作提供新的思路和理论依据。

• HDACi和RS-1提高CRISPR/Cas12i介导的HDR编辑效率

  陈秋崇, 李尚朴, 苗洱钰, 周冰倩, 王旭, 孟祥宇, 王小龙, 徐坤

  CRISPR/Cas12i是我国学者新近开发的、具有自主知识产权的CRISPR基因编辑系统,被证实具有不亚于CRISPR/Cas9系统的打靶效率。同源定向修复(homology-directed repair, HDR)是DNA双链断裂(double-stranded break, DSB)的主要修复方式之一。基于HDR机制的基因编辑可用于纠正基因组中任何形式的突变,但受限于哺乳动物细胞中普遍较低的HDR效率。本研究首先通过单链复性(single-strand annealing, SSA)报告试验、剂量梯度和浓度梯度实验分别验证CRISPR/Cas12i系统在人(Homo sapiens)胚肾细胞系HEK293T中不同靶点的活性、介导HDR编辑的单链寡核苷酸(single-stranded oligonucleotides, ssODN)供体模板剂量及添加小分子药物的适宜浓度,进而通过流式细胞分选、基因组PCR、Sanger测序和在线预测等手段,检测添加不同小分子药物对HEK293T细胞和绵羊(Ovis aries)胎儿成纤维细胞中CRISPR/Cas12i系统介导的HDR编辑效率的影响。结果显示,CRISPR/Cas12i系统在HEK293T细胞18个不同靶点均表现出较高编辑活性,除2个位点稍低外,其余均在80%左右;不同剂量及长度的ssODN对HDR效率有一定影响,且小分子药物适宜浓度在不同物种和不同类型细胞中略有不同;组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)和RS-1 (C20H16Br2N2O3S)对HEK293T细胞和绵羊胎儿成纤维细胞中CRISPR/Cas12i系统介导的HDR编辑效率均有显著提升,其中RS-1细胞毒性最小,且在提升HDR效率同时未显著降低插入/缺失突变(insertion/deletion mutation, InDel)效率;此外,Entinostat作为HDACi之一,在绵羊胎儿成纤维细胞的骨形态发生蛋白受体1B (bone morphogenetic protein receptor 1B, BMPR1B)基因相关位点提升HDR编辑效率约148倍。总之,CRISPR/Cas12i系统具有较高编辑活性,能够在模式细胞和绵羊原代细胞中介导有效的、以ssODN为供体的HDR精确编辑,且适宜浓度的HDACi和RS-1可以有效提高HDR编辑效率。本研究为CRISPR/Cas12i基因编辑系统的推广与应用提供了参考和借鉴。

• 安徽白山羊MIR206遗传变异对生长性状和启动子活性的影响

  段琴, 丁扬, 卢嘉妮, 张思欢, 凌英会

  MIR206是MIR-1家族成员之一,在脊椎动物骨骼肌中特异表达,而肌肉是机体的重要组成部分,因此MIR206基因可能对动物的生长发育具有重要调控作用。插入/缺失(Insertion/Deletion, InDel)是一种重要的遗传变异,可能通过影响基因表达水平影响基因功能。本研究探究了安徽白山羊(Capra hircus) MIR206基因InDel变异对生长性状及启动子活性的影响,以期为山羊分子育种提供参考。以431只安徽白山羊为研究对象,收集相应个体的体重、体高、体长、胸围、管围和尻宽等数据。采用PCR产物直接测序的方法鉴定MIR206基因的InDel突变。利用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定安徽白山羊个体的基因型;通过计算遗传参数分析InDel变异在安徽白山羊群体中的分布情况;利用SPSS 25.0分析突变位点基因型与山羊生长性状的相关性;通过双荧光素酶报告系统检测分析MIR206启动子区遗传变异对启动子活性的影响。PCR产物测序和序列比对结果显示,安徽白山羊MIR206转录起始位点上游389~394位置存在1个6 bp InDel变异(rs653221349)。该变异在安徽白山羊群体中有3种基因型：II (野生型)、ID (杂合型)和DD (纯合缺失型),属于中度多态(0.25<PIC<0.5),处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05)。关联分析结果显示,6 bp InDel的不同基因型与安徽白山羊的体重、体长和胸围显著相关(P<0.05)。其中ID基因型个体的体重、体长和胸围显著优于II和DD基因型个体。双荧光素酶报告系统结果显示,6 bp的缺失显著降低了基因启动子活性。综上,本研究发现安徽白山羊MIR206基因动子区存在6 bp InDel变异,该突变与安徽白山羊的部分生长性状显著相关且降低了启动子活性,可作为安徽白山羊分子标记辅助选择的候选DNA分子标记。

• 甲硫氨酸脑啡肽对猪前体脂肪细胞凋亡的调控机理

  陈齐, 刘尊海, 任泽宇, 王文涛, 吕睿, 王思蒙, 孙超

  甲硫氨酸脑啡肽(methionine enkephalin, Met-Enk)是一种阿片类神经肽,对于细胞增殖与代谢具有调控作用。为探究Met-Enk对猪(Sus scrofa)前体脂肪细胞凋亡及线粒体结构功能的影响,本研究使用Met-Enk处理猪原代前体脂肪细胞,利用细胞计数试剂盒(cell counting kit 8, CCK-8)、AV/PI (膜联蛋白V/碘化丙啶, annexin V/propidium iodide)染色技术检测细胞凋亡,通过透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)和原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)观察线粒体结构变化,并使用JC-1荧光探针等手段检测线粒体功能变化。结果表明,Met-Enk导致猪前体脂肪细胞活性下降,凋亡率升高,引起凋亡标记分子Caspase 3、Caspase 9等表达水平变化;TEM结果显示,前体脂肪细胞中线粒体数目减少、体积肿胀、线粒体嵴减少;AFM结果显示,线粒体发生形变,膜表面出现凹陷,粗糙度增加;结合免疫印迹和qPCR等方法发现,Met-Enk处理导致线粒体结构与功能的受损,并通过阿片生长因子受体(opioid growth factor receptor, Ogfr)促进Bax/Bak等凋亡因子表达,促使线粒体释放细胞色素C,促进细胞凋亡。本研究深入探讨了Met-Enk通过影响线粒体结构与功能诱导猪前体脂肪细胞凋亡的作用机理,为使用Met-Enk改善畜禽脂肪组织发育提供参考。

• 碱韭总黄酮通过m6A-IGF2BP2依赖性途径促进宫颈癌细胞凋亡的机制研究

  赵彩权, 赵鹏, 图雅, 白力格

  宫颈癌(cervical cancer, CC)是妇科恶性肿瘤,大部分黄酮类化合物具有抗宫颈癌活性,然而碱韭(Allium polyrhizum)总黄酮是否也具有抗宫颈癌活性鲜少报道。为揭示碱韭总黄酮对宫颈癌细胞的作用及机制,本研究利用CCK-8 (cell counting kit-8)实验、划痕实验、流式细胞术、实时定量PCR、免疫印迹、斑点杂交、N6-甲基腺苷(N6-methyladenine, m6A)定量、甲基化RNA免疫共沉淀(methylated RNA immunoprecipitation, MeRIP)和RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)等方法,对碱韭总黄酮处理的宫颈癌细胞生长能力进行检测,发现碱韭总黄酮对HeLa、SiHa和CaSki 3种宫颈癌细胞有不同程度的抑制作用,可有效抑制其增殖和迁移能力,同时促进HeLa细胞凋亡。碱韭总黄酮处理HeLa细胞后显著上调其促凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein, BAX)的表达,全基因组m6A修饰水平显著上升,且与m6A去甲基化酶脂肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein, FTO)表达显著下调有关;此外,m6A读取蛋白胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2 (insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 2, IGF2BP2)的表达显著上调。生物信息学预测发现,BAX mRNA上有1个极高可信度的m6A修饰位点,而IGF2BP2与此位点结合;同时,m6A抗体和IGF2BP2抗体均能够显著富集BAX mRNA。综上,本研究证明碱韭总黄酮具有良好的抗宫颈癌活性,且可能通过m6A-IGF2BP2相关分子机制促进宫颈癌细胞凋亡而发挥抗癌作用。本研究结果可为黄酮类化合物抗肿瘤机制的相关研究提供理论基础,也为新型药物的开发与应用提供一定的理论参考。

• 基于LPS炎症模型探究贝母素甲与贝母素乙对巨噬细胞Raw264.7的抗炎作用

  金泽兰, 董云哲, 李青, 董莉莉, 郭焕茹, 严灿龙, 王忠华

  贝母素甲与贝母素乙为百合科草本植物浙贝母(Fritillaria thunbergii)中的代表性生物碱类药用成分,对浙贝母抗炎功效发挥重要作用。为从细胞水平上进一步探究这两类生物碱的抗炎功效,本研究以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的小鼠(Mus musculus)单核巨噬细胞(Raw264.7细胞)为炎症模型,采用Griess法、ELISA、Western blot、qRT-PCR等方法分析贝母素甲和贝母素乙对LPS诱导的Raw264.7细胞分泌促炎因子一氧化氮(nitric oxide, NO)、肿瘤坏死因子-α (tumour necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6 (interleukin-6, IL-6)、IL-1β、一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase,iNOS)、环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)的影响。结果显示,贝母素甲与贝母素乙均能抑制Raw264.7细胞分化,减少LPS刺激产生的伪足,贝母素甲与贝母素乙中、高剂量组Raw264.7细胞上清液中NO、TNF-α、IL-6、IL-1β浓度显著降低(P<0.05, P<0.01)。贝母素甲与贝母素乙对Raw264.7细胞iNOS、COX-2蛋白表达均有抑制作用,且对于iNOS蛋白,贝母素乙的抑制作用高于贝母素甲,对于COX-2蛋白,贝母素甲的抑制作用高于贝母素乙。贝母素甲和贝母素乙均能显著降低Raw264.7细胞IL-6和IL-1β表达量。综上,贝母素甲和贝母素乙均有良好的抗炎效果。本研究为生物碱类物质对炎症的治疗提供一定的数据支持。

• 鸡TET2及截短体真核表达载体的构建及其对先天免疫反应的影响

  马克姣, 蔡清清, 王佳兴, 王强州, 白皓, 陈世豪, 常国斌

  甲基胞嘧啶双加氧酶2 (ten-eleven translocation 2, TET2)通过甲基化依赖和不依赖的两种方式调控哺乳动物的天然免疫反应,而鸡(Gallus gallus) TET2的先天免疫调控作用尚未阐明。本研究旨在克隆鸡TET2基因并构建TET2及截短体的真核表达载体,初步探讨TET2及其功能域对鸡先天免疫反应的影响。根据鸡TET2基因组(GenBank No. NM_001277794.1)信息,克隆其全长CDS序列。将TET2全长分为N端N1126和C端CD两个截短体,扩增其基因片段,将其同源重组连接至pCAGGS-Myc真核表达载体。将重组质粒pCAGGS-Myc-TET2及截短体分别转染至鸡胚成纤维细胞DF-1中,通过Western blot和免疫荧光检测鸡TET2及截短体的蛋白表达和细胞定位。通过qRT-PCR检测过表达pCAGGS-Myc-TET2及截短体基因对ploy (I:C)诱导的先天免疫反应相关基因表达的影响。PCR结果显示,成功克隆鸡TET2全长序列及其截短体N1126和CD。生物信息学分析表明,与鸡TET2亲缘关系最为相似的是鸿雁(Anser cygnoides)和绿头鸭(Anas platyrhynchos)。Western blot检测表明,Myc标签融合的TET2全长和截短体均能在DF-1细胞正常表达。免疫荧光检测表明,鸡TET2定位于细胞核。qRT-PCR结果表明,过表达鸡TET2全长及截短体均能显著促进poly(I:C)诱导的黑色素瘤分化相关基因5 (melanoma differentiation associated gene 5, MDA5)和三基序蛋白25 (tripartide motif containing 25, TRIM25)的表达(P<0.05),而对干扰素调节因子7 (interferon regulatory factor 7, IRF7)的表达无显著影响(P>0.05);与过表达截短体N1126相比,过表达TET2全长和CD功能域极显著促进poly(I:C)诱导的β干扰素(interferon-β, IFN-β)表达(P<0.05)。本研究初步探索了TET2及其截短体对鸡先天免疫反应的影响,为鸡TET2调控先天免疫反应的分子机制提供了基础信息。

• 白羽王鸽CAPN11基因SNPs鉴定及其对屠宰性状的影响

  向进, 龙霞, 庞金兰, 成敏, 张依裕, 杨阿明

  白羽王鸽(Columba livia)是重要的经济禽类,探究其钙蛋白酶11 (calpain 11, CAPN11)基因多态性与屠宰性状的关系,对其屠宰性状的遗传改良和经济性状提升具有重要意义。本研究采用PCR直接测序法对白羽王鸽CAPN11基因SNP进行筛查,并分析SNP位点与白羽王鸽屠宰性状的关联性。通过鉴定白羽王鸽的CAPN11基因的SNPs发现,在外显子6区的第636和738位发现g.3641644 C>T和g.3641746 C>T 2个同义突变,均存在3种基因型,优势基因型和优势等位基因均为CT和C,0.25<PIC<0.5均呈中度多态;χ2检验显示,2个SNPs位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);连锁不平衡分析显示,2个SNPs位点之间不满足D'>0.80,r2>0.33,表明不存在强连锁不平衡效应;关联性分析显示,g.3641644 C>T位点对宰前活重的影响达到显著水平(P<0.05);g.3641746 C>T位点对白羽王鸽的宰前活重、屠体重、全净膛重、胸肌重和腿肌重等屠宰性状的影响均达到了显著水平(P<0.05);双倍型分析发现,2个SNPs位点在实验群体中共检测到4种单倍型和10种双倍型,双倍型H2H2 (CCTT)个体的宰前活重、屠体重、全净膛重和腿肌重均显著高于其他9种双倍型(P<0.05);双倍型H2H2 (CCTT)个体的胸肌重显著高于除双倍型H3H3 (TTCC)和H3H4 (TTCT)外的其他双倍型个体(P<0.05)。通过分析单倍型mRNA二级结构发现,单倍型H1 (CC)、H2 (CT)、H3 (TC)均引起了CAPN11基因的mRNA二级结构变化,可能会影响转录和翻译效率,进而影响屠宰性能。综上,CAPN11基因能够作为潜在候选基因用于改善白羽王鸽屠宰性状,为加速白羽王鸽育种选育进程提供一定的理论依据,为提升品种屠宰性状的分子标记选育工作提供参考。

• 乙型脑炎病毒囊膜蛋白I176R位点突变株的生物学特性比较研究

  唐冕耀, 赵勤, 石艳萍, 曹玉琴, 文翼平, 伍锐, 杜森焱, 黄小波, 颜其贵, 曹三杰

  乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是一种危害严重的人畜共患病毒,囊膜蛋白(envelope protein, E)对JEV的神经毒力起关键作用。前期研究发现,重组乙型脑炎病毒(recombinant Japanese encephalitis virus, rJEV)囊膜蛋白I176R位点突变可致弱其神经毒力。为鉴定rJEV-EI176R位点突变后其生物学特性的变化,本研究克隆分析了E176位点突变重组病毒rJEV-EI176R的E基因序列和E蛋白的生物信息学特征;利用qPCR、蚀斑试验和间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)等技术测定rJEV-EI176R的生长曲线、对多种细胞的吸附差异和rJEV-EI176R诱导小鼠小胶质细胞系(mouse microglia cell line, BV-2)细胞炎性水平差异。结果显示,rJEV-EI176R的E蛋白带正电荷的残基增加1个,等电点升高0.37,不稳定指数升高0.39;E蛋白的α螺旋、β折叠、延伸链以及无规则卷曲的数量及占比均发生了改变,同时E176位点氨基酸与附近氨基酸有了不同的连接;rJEV-EI176R在BV-2细胞上的生长曲线没有显著变化且能够感染不同来源的神经细胞和肾细胞;rJEV-EI176R的吸附能力显著提高(P<0.05)但蚀斑大小变化不显著;rJEV-EI176R接种BV-2细胞后,在12和24 h均引起肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、干扰素γ诱导蛋白-10 (interferon-gamma-induced protein-10, IP-10)的水平显著低于亲本株(P<0.05)。本研究丰富了JEV毒株E蛋白的生物学特性研究,为后期深入研究JEV减毒机制和疫苗研发提供基础资料。

• 利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂提高猪体细胞核移植胚胎发育率的研究进展

  晏超, 陈指龙, 彭翠婷, 谢浩, 张才用, 赵玉兰, 齐霖, 刘永刚, 唐中林

  体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)技术在保护濒危物种、扩繁良种和治疗疾病等方面应用广泛。组蛋白乙酰化修饰是调控猪(Sus scrofa)早期胚胎发育重要的表观遗传标记,其正确的擦除与重建是胚胎正常发育的基础。随着微量细胞测序技术的发展,研究人员发现体细胞克隆胚胎重编程过程中存在多种表观遗传修饰异常,其中组蛋白乙酰化修饰异常是导致猪体细胞克隆胚胎发育阻滞的重要因素。近年来,一些组蛋白去乙酰化酶抑制剂逐渐被发掘,可用于改善胚胎发育过程中组蛋白乙酰化的异常修饰水平。本文综述了近年来利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂提高猪体细胞核移植胚胎发育及其作用机制的相关研究,为提高猪体细胞克隆效率提供参考。

• 单增李斯特菌微滴式数字PCR检测方法的建立及在标准物质研制方面的应用

  徐佳微, 辛长卫, 李铁山, 赵格, 曲志娜, 赵建梅, 高玉斌, 张喜悦, 王君玮

  单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是最严重的食源性病原菌之一。本研究以细胞壁水解酶基因(invasion associated protein, iap)为靶基因建立了微滴式数字PCR (droplet digital PCR, ddPCR)方法,优化了反应条件并测试了方法的特异性、灵敏度和重复性,并利用所建立的方法进行了临床样品的检测以及应用该方法研制其标准物质。结果显示,在10 μmol/L引物用量为1.5 μL、10 μmol/L探针用量为0.45 μL和退火温度在60 ℃时,ddPCR方法的扩增效果最好,最终成功建立了单增李斯特菌ddPCR检测方法。所建立的ddPCR检测方法具有较好的特异性,与其他非特异性菌株不发生交叉反应;重复性试验结果显示组间变异系数为1.57%~4.32%,证实该方法重复性好;该方法具有较高的灵敏度,最低检出下限为6.65 copies/μL。利用 ddPCR方法和qPCR方法检测实验室保存的47份临床阳性样本,符合度为100%;应用所建立的方法对标准物质进行均匀性和稳定性检验,并联合9家实验室对标准物质定值,定值结果为5.79×103 copies/μL,不确定度为0.47×103 copies/μL。本研究建立的ddPCR检测方法可用于实验室中单增李斯特菌的检测和标准物质的研制,可成为监测单增李斯特菌感染的一种技术手段。

• 北京地区四种百合病毒的检测及病毒序列分析

  鲁婧童, 孔祥凤, 李介文, 贾桂霞

  百合属植物(Lilium spp.)易受多种病毒复合侵染,病毒检测与序列分析有助于明确感染病毒种类、揭示病毒变异情况。本研究基于百合无症病毒(Lily symptomless virus, LSV)、百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)和车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus, PLAMV)中保守基因序列的4对引物,通过优化PCR延伸时间建立上述4种病毒的多重RT-PCR检测方法,并利用该方法抽检了北京地区田间种植百合的病毒感染情况,进一步分离4种病毒产物进行测序与比对,构建系统进化树。结果表明,在多重RT-PCR反应中,增加延伸反应时间至90 s时可扩增出全部4种病毒及18S rRNA (内参基因)条带;抽样检测结果显示,田间种植的百合多受2种及以上病毒复合侵染,其中病毒检出率由大到小依次为LSV (100%)>CMV (92.31%)>LMoV (30.77%)>PLAMV (15.38%);序列分析发现,4种病毒分离物与其各自同种病毒序列平均相似性在84.4%以上,证明检测所得4种病毒为目标病毒;4种病毒变异分析发现,CMV分离物以百合为寄主时单独聚为一个分支,具有寄主差异性;LMoV在系统发育关系上可分为2个分支,实验中的分离物属于分支Ⅱ;LSV和PLAMV未见明显分支模式。本研究为百合病毒病的常规分子诊断与研究提供技术支持,为病害防治提供基础参考。

• 鸭坦布苏病毒NS3蛋白原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

  安而立, 嵇辛勤, 阮涌, 陈泽辉, 曹伟, 王晗晗, 罗晓宇, 龙丹丹, 陈佳琪, 杨纯培, 吴宗豪, 王丽娟, 姚碧琼

  为了建立一种能够快速检测鸭坦布苏病毒病(Duck tembusu virus, DTMUV)抗体的间接ELISA检测方法,本研究构建了pET-28a-NS3的原核重组表达载体以诱导表达NS3蛋白,以NS3蛋白作为包被抗原,对试验条件进行优化,建立了一种检测DTMUV抗体的间接ELISA方法,使用所建立ELISA方法对30份攻毒试验血清样品及150份采集的血清样品进行检测。结果显示,所建立间接ELISA方法批内与批间变异系数(CV)分别为1.49%~4.31%和1.22%~6.07%,符合国标;该方法可特异性地检测出DTMUV抗体,且与禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV) H5亚型、AIV H7亚型、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)、鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)和鸭甲肝病毒1型(Duck hepatitis A virus, DHAV-1)阳性血清均无交叉反应;所建立方法对攻毒试验样品阳性、阴性检出数与商品化试剂盒检测符合率为100%,对养殖场采集样品阳性、阴性检出数与商品化试剂盒检测符合率为97.33%。综上所述,本研究所建立的DTMUV NS3蛋白抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性与重复性,为DTMUV流行病学调查提供了快速、有效的检测方法。