农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2025年第9期

• 水稻Waxy基因第四内含子3'剪接位点邻近碱基突变影响水稻抗性淀粉含量

  罗曦, 樊佳星, 魏毅东, 魏林艳, 朱永生, 何炜, 吴方喜, 蔡秋华, 谢华安, 张建福

  近年来,随着Ⅱ型糖尿病发病率的上升,抗性淀粉(resistant starch, RS)作为一种低升糖指数的食品成分,受到了广泛关注。抗性淀粉具有降低糖尿病患者饭后血糖值、减少肠机能失调及结肠癌发病率等重要生理功能。水稻(Oryza sativa)中抗性淀粉含量与直链淀粉含量正相关,而直链淀粉的合成由Wx (Waxy) 基因控制。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,对水稻Wx基因第四内含子3'剪接位点AG附近的碱基进行编辑,获得了4种不同类型的突变株系。通过分析这些突变株系的Wx基因表达量、颗粒结合淀粉合成酶(granule-bound starch synthase, GBSS)活性、直链淀粉和抗性淀粉含量,发现3'剪接位点AG邻近的突变可以显著影响Wx基因的表达,进而调控水稻中直链淀粉和抗性淀粉的含量。相关性分析表明,Wx基因表达量与抗性淀粉含量呈显著正相关。本研究发现了可以有效调控Wx基因表达量(升高或降低)的内含子突变基因型,为今后改良水稻中抗性淀粉含量提供了新的思路。

• 水稻类病斑突变体spl52的基因定位及稻瘟病抗性分析

  李媛媛, 李兴, 黄清雄, 漆攀, 尹武中, 张杰, 陈虹, 杨国涛, 彭友林, 胡运高

  稻瘟病是影响水稻(Oryza sativa)稳产的因素之一,类病斑突变体作为是作物抗病分子机制的理想材料,解析突变体的抗病基因是培育稳产抗病水稻的基础。本研究通过对粳稻品种'武运粳21'进行甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone, EMS)诱变,获得1个稳定遗传的类病斑突变体spl52 (spotted leaf 52)。成熟期突变体植株的有效穗数、每穗粒数、千粒重和结实率相比野生型显著降低。从分蘖初期开始突变体spl52叶尖部出现病斑。通过3,3'-二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine, DAB)染色、酶活测定和二氯荧光素二乙酸酯(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, H2DCFDA) 检测表明,突变体spl52病斑叶片出现活性氧积累,通过TUNEL实验发现细胞程序性死亡激活。对野生型和突变体叶片进行透射电镜分析,结果显示,突变体叶绿体呈现较小的椭圆形,线粒体呈现空洞化。遗传分析表明,突变体的表型受1对隐性核基因控制,通过Mutmap分析,发现6个可能的候选区间,使用图位克隆技术将候选基因定位于6号染色体RM3.5~RM4.3。对候选基因进行分析,未发现已报道的类病斑及水稻抗性相关基因。对野生型和突变体植株叶片接种稻瘟病菌种(Magnaporthe oryzae),结果表明,突变植株对稻瘟病菌更敏感。qRT-PCR结果显示,突变体中正向调控水稻抗性的基因OsPR1a、OsPR1b、JIOsPR10、OsWRKY6、OsRSR1表达量均显著低于野生型。结果表明,突变基因为尚未报道的新基因,参与了水稻稻瘟调控相关途径。

• 甜菜乙酰乳酸合酶基因家族的鉴定及其对除草剂的应答

  项星淳, 王皓, 芋鑫鑫, 符晶晶, 王鑫, 刘大丽

  杂草是影响甜菜(Beta vulgaris)产量和品质的主要因素,乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase, ALS)抑制剂类除草剂因高效、低剂量、安全性较高而被广泛用于农业杂草防控。为了深入挖掘甜菜ALS基因,并解析其在ALS抑制剂类除草剂胁迫下的潜在功能,本研究通过生物信息学方法对该基因家族成员进行了全基因组鉴定,并分析了其理化性质、进化关系、顺式作用元件及染色体定位;利用qRT-PCR综合甜菜形态指标及光合指标相关性分析了其在ALS抑制类除草剂胁迫下的转录表达特性。结果显示,甜菜基因组中共有7个BvALS基因家族成员,BvALS蛋白质的相对分子质量为51. 305~81.867 kD,理论等电点为5.64~9.41,大部分成员为稳定蛋白并定位于叶绿体。系统进化树分析结果表明,甜菜ALS基因家族与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和菠菜(Spinacia oleracea)的ALSs进化关系较近。BvALSs结构中共鉴定出10个保守基序,其中大部分基因家族成员都含有Motif 7,并且BvRB_5g124450、BvRB_2g027380、BvRB_5g103060和BvRB_8g181940包含3个完整的结构域(TPP enzyme N, TPP enzyme M和TPP enzyme C)。BvALS家族成员分别位于5条染色体和2个scaffold片段上。根据顺式作用元件分析,BvALS家族成员可参与多种胁迫响应。在ALS抑制剂类除草剂胁迫下,所有家族成员均上调表达。其中,BvRB_5g103060表达最为显著,表达量是对照组的3.2倍。甜菜BvRB_5g103060基因可能在除草剂抗性机制中发挥着重要的作用。本研究为进一步解析BvALSs在甜菜抗除草剂过程中的生物学功能提供了理论依据。

• 红花WRKY基因家族全基因组鉴定及其表达分析

  秦娟, 卢蔚雯, 李斌, 李晨, 王沛雅, 王治业

  WRKY 转录因子作为植物特有且保守的一类转录因子,在植物生长发育和次生代谢过程中发挥着重要的调控作用。为发掘参与红花(Carthamus tinctorius)类黄酮代谢调控的WRKY基因,本研究开展了红花基因组水平WRKY家族基因的鉴定分析。基于红花基因组及转录组数据,本研究鉴定出了87个CtWRKY基因,分布在12条染色体上。亚细胞定位预测显示其中绝大多数(85个) CtWRKY基因定位在细胞核中。进化分析显示,87个CtWRKY基因可分为3大族：GroupⅠ/Ⅱ/Ⅲ,其中GroupⅡ又分为5个亚族(GroupⅡa/b/c/d/e),且占比最高(52.87%)。蛋白基序分析显示CtWRKY蛋白序列中均具有高度保守WRKY结构域(WRKYGQK)。共线性分析表明,红花CtWRKY基因家族成员存在39对片段重复基因。RNA-seq分析结果显示,红花CtWRKY基因家族成员在不同组织存在着明显的表达差异;进一步利用qRT-PCR对红花盛花期花瓣中高表达的9个CtWRKY 基因进行检测,发现均可不同程度响应脱落酸(abscisic acid, ABA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)的诱导。本研究为进一步阐明红花类黄酮生物合成中的WRKY转录因子功能研究奠定基础。

• 转录因子基因TwWRKY1过表达提高雷公藤吉碱和次碱含量

  杨莉莉, 惠文静, 何泽东, 陈玲, 马志卿, 张斌, 祝传书

  茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)诱导表达的转录因子TwWRKY1基因(GenBank No. GAVZ01022264.1)对雷公藤(Tripterygium wilfordii)吉碱的生物合成有明显的调控作用。为明确其具体的调控机制与关键靶标基因,本研究以雷公藤倍半萜环化酶为研究对象,通过对雷公藤倍半萜环化酶(T. wilfordii sesquiterpene cyclase, Twses-CS)基因的挖掘、启动子顺式作用元件分析并检测TwWRKY1转录因子的表达和生物碱含量变化,结果显示,WRKY转录因子可能通过调控Twses-CS表达影响雷公藤倍半萜类吡啶生物碱的生物合成。酵母单杂交试验分析表明,TwWRKY1与Twses-CS启动子有一定的结合能力。亚细胞定位分析表明,转录因子TwWRKY1定位在细胞核内,属于典型的转录因子。通过电泳迁移率变动分析体外验证结合表明,TwWRKY1和含2个W-box的30 bp探针孵育后可形成DNA-蛋白复合物,能够结合W-box序列。雷公藤吉碱的含量在TwWRKY1过表达发状根中约为对照的1.87倍,达到249.53 μg/g DW;雷公藤次碱的含量在TwWRKY1过表达发状根中为对照的1.90倍,达到638.25 μg/g DW。结果表明,TwWRKY1可能通过与Twses-CS的启动子上W-box元件结合调控雷公藤倍半萜吡啶生物碱的含量。本研究为进一步解析雷公藤倍半萜类生物碱的生物合成途径及转录因子在转录水平上调控其生物合成机制提供依据,也为利用代谢工程与合成生物学方法解决雷公藤生物碱供应不足提供理论支持。

• 茶树GRAS转录因子SHR亚家族成员的鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析

  申小华, 谢思艺, 饶佳怡, 窦祥亚, 王金波, 刘硕谦

  茶树(Camellia sinensis)作为重要经济作物,其产量与品质易受环境胁迫影响,SHR亚家族转录因子在植物发育及胁迫响应中起关键作用,但其在茶树中的功能研究仍匮乏。为解析SHR亚家族转录因子在茶树生长发育及非生物胁迫响应中的调控机制,本研究利用生物信息学对茶树CsSHR亚家族成员的理化性质、系统进化关系、蛋白结构、启动子顺式作用元件及染色体定位进行分析。结合转录组数据与qRT-PCR技术,进一步分析基因的组织特异性表达及其在遮荫、干旱、盐胁迫、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)和外源激素赤霉素(gibberellin A3, GA3)与6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine, 6-BA)处理下的表达模式。结果显示,茶树中共鉴定到8个CsSHR基因,其编码的蛋白质均为不稳定的亲水性核定位蛋白,基因分布于6条染色体且启动子区域富含光响应、激素及胁迫相关调控元件。系统进化分析表明,茶树与杨树(Populus) SHR亚家族亲缘关系较近,基因结构显示内含子数量较少。表达分析显示,CsSHR基因家族成员呈现组织特异性表达模式,其中CsSHR-1/4/7/8在根部高表达,而CsSHR-2/3/5在幼叶中优势表达。在非生物胁迫响应中,CsSHR-2和CsSHR-5在干旱和盐胁迫下显著上调。激素处理实验表明,GA3处理初期诱导CsSHR-1~CsSHR-4表达上调,却抑制CsSHR-5~CsSHR-8的表达;而6-BA处理则导致多数成员呈现先抑制后上调的双相表达模式。研究表明,CsSHR亚家族成员通过调控组织发育和胁迫应答在茶树生长及环境适应中发挥重要作用。本研究为茶树抗逆分子育种研究提供了新的理论视角。

• 核桃低温胁迫转录组解析及F-box基因抗寒功能初鉴

  姜涛, 安孝莹, 梁曼曼, 申艳红

  冬季霜冻和强寒潮等极端天气严重制约核桃(Juglans regia)产业的健康发展。F-box基因作为E3泛素连接酶复合体的关键组分,已被证实参与植物逆境响应,但其在核桃抗寒中的作用尚不明确。为探究核桃的抗寒分子机制,本研究选取抗寒性较强的'麻核桃'和抗寒性较弱的'LL29'一年生枝作为实验材料,对这些枝条进行低温胁迫处理并对其韧皮部生理指标和转录组进行分析。结果表明,在低温胁迫下'麻核桃'的可溶性糖和可溶性蛋白含量高于'LL29'。此外,'麻核桃'的一年生枝在低温胁迫下大量基因上调表达。KEGG通路富集分析显示,差异表达基因主要涉及淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导等通路。在此基础上,本研究进一步筛选出24个与抗寒性相关的候选基因,其中包括10个淀粉和蔗糖代谢途径基因以及14个转录因子。对其中4个F-box转录因子进行功能分析,结果显示,4个F-box转录因子分别属于FBL (F-box and leucine-rich repeat protein)、FBP (F-box and phloem protein 2)和FBU (F-box with unknown functional domain)亚族,转录因子基因的启动子区域含有8种不同类型的胁迫响应元件,其中JrFBU1基因含有低温响应的LTR元件。qPCR分析显示,JrFBU1和JrFBP在低温胁迫下表达量显著升高,且在'麻核桃'中的表达量始终高于'LL29',推测这2个基因可能在核桃抵御低温逆境中具有重要作用。本研究对于推动核桃抗寒性改良和栽培技术的进步具有重要的理论和实践意义。

• ARPC3/ARPC4调控奶牛乳腺上皮细胞屏障损伤与氧化应激机制的研究

  杨庭基, 包丹, 段志伟, 白文凯, 齐兴财, 赵兴绪, 贺钰烜, 董伟韬, 张勇

  肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基3 (actin-related protein 2/3 complex subunit 3, ARPC3)和ARPC4作为调控肌动蛋白细胞骨架的重要信号分子,在炎症发展过程中对于维持上皮细胞屏障功能完整发挥重要作用。为探究ARPC3/4调控奶牛(Bos taurus)乳腺上皮细胞(mammary alveolar cells-large T antigen, MAC-T)屏障损伤与氧化应激的作用机制,本研究利用细胞计数试剂盒-8 (cell counting kit-8, CCK-8)筛选脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和ARPC3/ARPC4抑制剂(CK666)的最适作用浓度,qPCR和Western blot技术检测核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)信号通路、抗氧化和紧密连接相关蛋白及基因的表达。结果显示,LPS可显著提高活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量,上调髓样分化因子88 (myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88)、Toll样受体4 (Toll-like receptor 4, TLR4)、核因子κB抑制物激酶β (inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta, IKKβ)和NF-κB的表达,下调过氧化氢酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶1 (superoxide dismutase 1, SOD1)、谷胱甘肽过氧化物酶1 (glutathione peroxidase 1, GPx1)、封闭蛋白1 (claudin 1)、闭合蛋白(occludin)和闭锁小带蛋白-1 (zonula occludens-1, ZO-1)的表达。CK666处理抑制ARPC3/ARPC4后,与LPS组相比,热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70)的表达进一步上调,同时逆转了LPS导致的NF-κB、MyD88、TLR4和IKKβ表达上调,CAT、SOD1、GPx1、Claudin1、ZO-1和Occludin的表达下调,并降低了ROS含量。结果表明,奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中ARPC3/ARPC4通过破坏紧密连接使上皮细胞屏障受损,进而激活NF-κB信号通路并抑制抗氧化基因的表达,促进炎症和氧化应激的发生,表明其具有作为乳房炎治疗靶点的潜力。本研究为奶牛乳房炎的防治提供了新的思路和理论依据。

• 牦牛卵泡颗粒细胞中Wnt/β-catenin信号通路对雌二醇和孕酮分泌的影响

  余志鹏, 杜培岩, 张贺程, 钱文洁, 姚颖, 李柳杨, 叶国荣, 喇萍, 崔燕, 余四九, 樊江峰

  Wnt/β-catenin信号通路是由配体Wnt和细胞膜受体结合激发下游一组多通道的信号转导途径,在癌症、胚胎发育和成年动物多个生理过程的调控中发挥重要作用。为了探究Wnt/β-catenin信号通路对牦牛(Bos grunniens)卵泡颗粒细胞分泌雌二醇(estradiol, E2)和孕酮(progesterone, P4)的影响。外源性使用Wnt/β-catenin信号通路激动剂SKL2001处理体外分离培养的牦牛卵泡颗粒细胞,通过细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8, CCK-8)检测细胞增殖情况,ELISA检测颗粒细胞培养上清液中雌二醇和孕酮的含量;采用qRT-PCR和Western Blot检测细胞增殖相关基因、Wnt/β-catenin信号通路相关基因和类固醇激素合成相关基因和蛋白的表达水平。结果显示,在2.5~10.0 µmol/mL范围内,外源性SKL2001能够上调牦牛卵泡颗粒细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-连环蛋白(β-catenin)、轴蛋白2相关蛋白(axin-related protein 2, Axin2)的表达,而对糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β, GSK3β)的表达无影响;SKL2001显著降低颗粒细胞中增殖相关基因增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、细胞周期蛋白D2 (cyclin D2, CCND2)和细胞分裂周期蛋白42 (cell division cycle 42, CDC42)基因的表达及颗粒细胞的增殖活性;添加SKL2001能够降低培养液中雌二醇的含量,提高孕酮含量,抑制颗粒细胞雌二醇合成关键基因—细胞色素P450家族19亚家族A成员1 (cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1, CYP19A1)和细胞色素P450 17A1 (cytochrome P450 17A1, CYP17A1)的表达,促进孕酮合成关键基因—细胞色素P450家族11亚家族A成员1 (cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1, CYP11A1)、3β-羟基-Δ⁵-类固醇脱氢酶-Δ⁵-雄烯二醇脱氢酶1型(hydroxy-Δ⁵-steroid dehydrogenase-3β-androsten-Δ⁵-diol dehydrogenase type 1, HSD3B1)和类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)的表达。研究结果表明,SKL2001激活Wnt/β-catenin信号通路后,抑制卵泡颗粒细胞增殖,并通过调控类固醇激素合成关键酶的含量,促进卵泡颗粒细胞由雌激素分泌型向孕酮分泌型转化,这可能是牦牛卵泡闭锁和黄体化的潜在机制。本研究为进一步探明牦牛卵泡颗粒细胞功能及卵泡发育调控机理积累了基础资料。

• IGF2R基因多态性与牦牛生长性状的相关性分析

  吕彩玲, 南国雄, 王登哲, 李永钦, 沈秀英, 彭巍, 徐尚荣, 张君

  胰岛素样生长因子2受体(insulin-like growth factor 2 receptor, IGF2R)在调控动物生长发育以及促进蛋白合成等生理过程中发挥着至关重要的作用,为探究IGF2R基因多态性与牦牛(Bos grunniens)生长性状的相关性,本研究以青海省的高原牦牛、环湖牦牛和雪多牦牛3个群体共336头为研究对象,运用DNA混池测序法筛选SNPs位点,直接测序法检测牦牛IGF2R基因的SNP位点,分析其与生长性状的关联性。结果表明,在牦牛IGF2R基因上筛选出2个SNPs位点,分别为：g.96261388T>C (第20内含子)和g.96292456A>G (第43外显子)。其中,g.96261388T>C位点在3个牦牛群体中只检测到TT、TC两种基因型,g.96292456A>G位点检测到AA、AG和GG三种基因型;遗传多态性分析表明,在3个牦牛群体中g.96261388T>C和g.96292456A>G位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。关联分析结果显示,雪多牦牛g.96292456A>G位点中TC基因型的体高、胸围和管围显著优于TT基因型(P<0.05);高原牦牛g.96292456A>G位点中AA基因型的体斜长和管围显著优于GG基因型(P<0.05);环湖牦牛中GG基因型的体高、体斜长、胸围和管围显著优于AG基因型(P<0.05)。因此,IGF2R基因g.96261388T>C和g.96292456A>G位点可作为牦牛生长性状选育的候选分子标记。本研究为牦牛育种工作提供理论依据。

• 军垦肉羊妊娠早期血浆外泌体miRNA的筛选和鉴定

  吕占民, 张振良, 刘昱成, 王晶晶, 刘伟俊, 唐玲, 华雨萱, 倪建宏, 万鹏程, 卢春霞, 刘长彬

  早期妊娠是影响绵羊(Ovis aries)繁殖过程的主要因素之一,精准识别未受孕绵羊,可以有效缩短空怀期,提高繁殖效率。外泌体(exosome)是细胞分泌的一种直径在30~150 nm的细胞外囊泡,几乎参与到哺乳动物妊娠的整个过程。本研究以年龄在2~3岁的军垦肉羊为研究对象,采集3只军垦肉羊母羊非妊娠(0 d)与妊娠早期(14, 30 d)血浆,通过分离血浆外泌体,构建妊娠早期不同时间点的军垦肉羊血浆外泌体miRNA文库,分析发现在妊娠早期不同时间点的军垦肉羊血浆外泌体中,存在显著差异表达的miRNA。通过文库分析和比对,共检测出248个差异表达的miRNAs,其中已知miRNAs有79个,未知miRNAs有169个;妊娠14 d与妊娠0 d相比发现40个差异表达的miRNAs,其中30个上调,10个下调,妊娠30 d与妊娠0 d相比发现72个差异表达miRNAs,其中43个上调,29个下调;妊娠30 d与妊娠14 d相比发现35个差异表达miRNAs,其中9个上调,26个下调。通过BLAST软件比对GO、KEGG等数据库信息,对军垦肉羊差异表达的外泌体miRNA进行靶基因注释与功能富集,发现富集的生物过程与早期妊娠的过程相关。其中oar-miR-27a的表达量较高且在非妊娠0 d与妊娠14 d、30 d相比差异显著,推测其在绵羊早期妊娠和早期胚胎发育过程发挥作用。为证明测序结果的可靠性,本研究随机选取5个差异表达miRNA,使用荧光定量PCR技术对表达量进行检测,检测结果与高通量测序趋势基本一致。本研究发现血浆外泌体miRNA可能参与了军垦肉羊早期妊娠的调控,对绵羊早期妊娠调控过程提供了新的见解,为探讨差异外泌体在绵羊早期妊娠中的分子调控机制提供了理论依据。

• 利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建ETS1基因敲除猪模型

  李帅鹏, 张言言, 邹国威, 冉琳, 林江维, 张瑞仙

  ETS 原癌基因 1 (E-twenty-six proto-oncogene 1, ETS1)基因在自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮, 类风湿关节炎等)中起着重要作用,其缺失会导致免疫细胞的异常分化。ETS1基因在小鼠(Mus musculus)和人类(Homo sapiens)免疫系统中进行了广泛研究,但在猪(Sus scrofa)等大型模式动物中尚未得到充分研究。为了研究ETS1基因在大型模式动物中的作用。本研究通过基因编辑技术构建ETS1基因敲除的克隆猪。首先通过生物信息学分析了ETS1基因在人和猪中的同源性,然后利用CRISPR/Cas9技术构建ETS1基因敲除细胞系,再以敲除细胞系为供体细胞,通过体细胞核移植技术构建ETS1基因缺陷的狼疮样猪模型。结果显示,猪的ETS1氨基酸序列与人类具有高度的同源性。获得14株基因缺失的单克隆细胞系,7株为单等位基因缺失细胞系,7株为双等位基因缺失细胞系。通过体细胞核移植技术成功获得1头ETS1单等位基因缺失克隆猪和3头野生型克隆猪。该模型为解析ETS1基因在猪等大型模式动物免疫系统中的功能提供了关键工具,并为自身免疫性疾病大型动物模型的构建奠定基础。

• 尼罗罗非鱼抗链球菌病全基因组关联分析及KASP标记开发

  王章, 朱伟娟, 刘洪, 唐程林, 刘志刚, 曹建萌, 王淼, 衣萌萌, 卢迈新, 可小丽

  罗非鱼(Oreochromis spp.)对链球菌病的易感性是阻碍罗非鱼养殖健康发展的重要产业问题,然而,关于罗非鱼对链球菌病的抗性机制及其相关分子标记的研究仍然相对有限。本研究以抗性和敏感表型为基础,鉴定罗非鱼抗无乳链球菌病的相关分子标记。通过无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)人工攻毒,根据攻毒后鱼体的存活和死亡情况,筛选尼罗罗非鱼(O. niloticus)群体中对无乳链球菌表现出抗性或敏感的个体。同时,对敏感和抗性个体进行基因组重测序,并以抗性和敏感为表型进行全基因组关联分析(genome-wide association analysis, GWAS)。结果表明,在该群体中,共获得9个与罗非鱼无乳链球菌病抗性相关的大效应分子标记(P<2.50×10-6),以及787个小效应分子标记(2.50×10-6<P<1.00×10-4)。这些大效应分子标记主要定位在罗非鱼连锁群13 (linkage group 13, LG13)、LG17和LG22,并注释到与肿瘤免疫微环境和免疫细胞浸润有关的基因(如WD重复域 27 (WD repeat domain 27, WDR27), 血小板反应蛋白2 (thrombospondins 2, THBS2), XIX型胶原蛋白α-1链(collagen type XIX α-1 chain, COL19A1))以及与先天性免疫相关的基因(如F10 α链(class Ⅰ histocompatibility antigen, F10 α chain-like))。同时,GO和KEGG分析表明,小效应标记注释的基因富集于免疫和炎性通路,包括尿激酶型纤溶酶原激活剂信号通路、Ras信号通路、氰氨基酸代谢、花生四烯酸代谢和牛磺酸代谢。此外,基于竞争性等位基因特异性PCR (kompetitive allele specific PCR, KASP)验证发现,LG13_20881657的GG基因型和LG13_20548718的TT基因型是罗非鱼无乳链球菌病抗性相关的优势基因型。综上,本研究初步揭示了罗非鱼无乳链球菌病抗性相关的基因和分子标记,为抗链球菌病罗非鱼的分子标记辅助选育提供了科学依据。

• 利用纳米磁珠介导的茄链格孢菌遗传转化技术的建立及其泛素化蛋白酶基因AsPR45功能研究

  赵玉娇, 付爱华, 张佳滢, 刘文雯, 杨巧梅, 姜冬美, 唐唯, 李健美

  泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是真菌细胞内一种重要的蛋白质降解途径,对于调控细胞内蛋白质稳态和维持细胞功能至关重要。前期研究中发现茄链格孢菌(Alternaria solani)在侵染马铃薯(Solanum tuberosum)早期(0~72 h),泛素-蛋白酶体途径中的茄链格孢26S蛋白酶体P45亚基(AsPR45)基因呈显著上调表达。为进一步探究AsPR45的基因功能,本研究首先探究纳米磁珠(magnetic nanoparticles, MNPs)介导的茄链格孢菌遗传转化技术,依托该转化技术,以载体pTOR-mRFP为骨架,构建AsPR45基因提前终止载体并导入野生型菌株TA-0410,并对2个阳性突变体进行功能验证。当纳米磁珠与pTOR-mRFP载体的质量比为1∶4,在37 ℃下结合30 min,室温下进一步和孢子孵育1.5 h时转化效率最高,转化率能达(36.77±2.91)%。生物学功能测定发现,AsPR45基因提前终止突变体菌丝生长速率与野生型相比无明显差异,但菌丝中黑色素减少,分生孢子产孢量较野生型显著下降,对马铃薯'Desiree'叶片的致病力显著降低,野生型和突变体对苯醚甲环唑的EC50值也呈显著差异。上述结果表明,AsPR45是茄链格孢菌泛素化通路中的关键基因,在菌株形态发育、侵染马铃薯和抗逆境方面起到重要作用。上述研究结果为茄链格孢菌的功能基因研究提供了技术基础,也有助于开发药剂靶标,加快马铃薯早疫病的防治。

• 禽腺病毒4型fiber2蛋白的可溶性表达及亚单位疫苗免疫效果评价

  王艳, 高亚东, 蒋成辉, 葛俊伟, 曾巧英

  血清4型禽腺病毒(fowl Adenovirus serotybe 4, FAdV-4)引发的高致病性肝炎-心包积液综合征(hydropericardium hepatitis syndrome, HHS)对我国养禽业造成严重威胁,其防控亟需高效疫苗。fiber2蛋白作为病毒关键保护性抗原,其截短表达策略与免疫机制尚不明确,制约了亚单位疫苗的产业化应用。为探究FAdV-4 fiber2蛋白不同结构域的免疫特性和应用潜力,开发安全、高效且更适用于养禽业的疫苗。本研究通过生物信息学软件分析确定FAdV-4 fiber2抗原性和亲水性较好的区域。选择fiber2全基因、fiber2基因184~1 440 bp序列和841~1 440 bp序列,分别构建重组质粒pET30a-FF、pET30a-FS和pET30a-FK。并利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,获得FAdV-4 fiber2蛋白的全长(FF)、截短(FS)及knob (FK) 3个重组蛋白,将其制备成亚单位疫苗,接种SPF雏鸡(Gallus gallus domesticus),评价其免疫原性。结果显示,3个蛋白均以可溶性表达为主。以30 μg/羽的免疫剂量免疫SPF鸡,攻毒后均可产生100%的保护,其中FS蛋白可以诱导比全病毒灭活疫苗更快更强的特异性抗体应答,并在低中和抗体(neutralizing antibody, NAb)水平下实现完全的攻毒保护。最小免疫剂量试验结果表明,FS重组蛋白以10 μg/羽的免疫剂量接种鸡群,即可对FAdV-4强毒株实现100%的保护。综上,本研究创新性建立了FAdV-4 fiber2高效可溶性表达体系,开发的FS蛋白抗原兼具快速免疫应答(14 d)与低剂量保护的特性(10 μg/羽),为进一步研究fiber2蛋白的免疫特性提供了基础数据,也为FAdV新型疫苗的产业化开发提供了理论参考与技术储备。

• 烟草内生菌及内生菌制剂研究进展

  赵巧玥, 李欣燕, 陈浩冉, 葛维一, 赵铭钦

  烟草(Nicotiana tabacum)内生菌作为与宿主形成稳定共生关系的特殊微生物群落,在生物防治、促生及宿主生态适应性调控等方面具有重要价值。本文综述了烟草内生菌的物种多样性及其功能研究进展,发现芽胞杆菌属(Bacillus)、镰孢菌属(Fusarium)和链霉菌属(Streptomyces)作为优势菌群,可通过生物固氮、有机磷溶解、植物激素合成以及系统抗性诱导等机制促进烟草生长发育。此外,本文还探讨了烟草内生菌功能基因解析及其在生产应用过程中所面临的挑战,为我国特色优质烟叶选育提供理论依据。

• 内生菌促进植物类中药材生产可持续发展的研究进展

  肖天瑜, 王凤茹, 玉猛, 客绍英

  植物内生菌广泛存在于植物组织和细胞内部,是一类能够分泌多种酶类和新型次级代谢产物的重要微生物资源,其在农业、医药、食品和园艺等领域均展现出巨大的应用潜力。本文综述了国内外关于内生菌在植物类中药材生长发育、活性成分累积、化感作用缓解及抗逆性提升等方面的研究进展,探讨了内生菌在提升植物类中药材产量和品质形成中的作用机制,旨在为内生菌在中药材种植中的应用提供理论依据,最终促进植物类中药材资源的保护和产业的绿色可持续发展。

• 羊源GADD45A基因过表达Vero细胞系的构建及其对PPRV复制的影响

  丁海燕, 袁莉刚, 赵竟涵, 郑海学, 尚佑军, 李丹

  小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)感染可引发机体出现一系列病理损伤,是一种严重威胁反刍动物健康的病原体。本课题组前期通过转录组测序技术对PPRV感染后的宿主细胞进行分析,发现生长阻滞和DNA损伤诱导45A (growth arrest and DNA damage-inducible 45A, GADD45A)基因的表达水平发生了显著变化。为明确GADD45A对PPRV复制的影响,本研究制备了携带山羊(Capra hircus) GADD45A基因的重组慢病毒颗粒,构建了稳定表达GADD45A蛋白的Vero细胞系,以研究其对PPRV复制的影响。并通过qPCR、Western blot以及连续传代实验,评估所建立的细胞系中GADD45A基因的表达、蛋白表达及其稳定性。结果显示,该细胞系状态良好且能够稳定传代,并表达GADD45A蛋白。稳定表达GADD45A蛋白的Vero细胞系显著促进了PPRV的复制。本研究为后续深入研究PPRV的致病机制提供了一定的生物工具和技术支持。

• 5' UTR缺失重组塞内卡病毒的构建与生物学特性分析

  张岩, 杨帆, 曹伟军, 杜晓莉, 郑海学, 包世俊

  塞内卡病毒A (Senecavirus A, SVA)是属于塞内卡病毒属的小RNA病毒,感染该病毒后可引发原发性猪(Sus scrofa)的水疱病,在临床上很难与口蹄疫、猪水泡病和水疱性口炎区分。本研究成功从临床中分离鉴定了1株SVA变异毒株,发现其5' UTR存在13个核苷酸(nucleotide, nt)缺失。为了研究该缺失对SVA生物学特性的影响,本研究利用反向遗传技术,以SVA CH/FJ/2017毒株的全长cDNA感染性克隆为基础,对其基因组5' UTR序列进行定向缺失,将重组质粒转染BHK-21细胞,拯救出1株5' UTR基因缺失的塞内卡病毒rSVA-5UTRM,利用间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay, IFA)和Western blot对重组毒株进行鉴定;并将重组病毒在BHK-21细胞上连续传代,进行遗传稳定性分析;然后通过蚀斑试验和病毒生长曲线比较重组病毒与亲本毒株在BHK-21细胞上的增殖特性。结果显示,重组病毒能够与SVA抗体及SVA VP2抗体发生特异性反应,表明重组毒株拯救成功;遗传稳定性分析结果显示,5' UTR基因缺失的重组病毒传代至20代,缺失基因仍稳定存在,表明重组毒株具有良好的遗传稳定性;生物学特性分析结果表明,重组毒株与亲本毒株SVA CH/FJ/2017在BHK-21细胞上的复制特性相近,且具有较高的病毒滴度,表明5' UTR中13 nt的核苷酸缺失并不影响病毒在BHK-21细胞上的复制。本研究成功拯救出5' UTR缺失的重组SVA毒株,研究了缺失区段的功能,为阐明SVA非编码功能提供了新的科学数据。