农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2025年第4期

• 小麦TaPM19-B1基因的克隆与表达分析

  黄丽丹, 汪德州, 王小燕, 唐益苗

  近年来,通过对控制小麦(Triticum aestivum)籽粒大小和休眠的遗传基础研究发现了许多与其性状相关的基因。本研究以前期鉴定到的脱落酸(abscisic acid, ABA)诱导的小麦质膜19 (ABA-induced wheat plasma membrane 19, AWPM19)基因家族成员TaPM19-B1 (TraesCS5B02G566400)为基础,利用'中国春'的cDNA为模板克隆出全长为543 bp的TaPM19-B1基因,编码180个氨基酸。小麦原生质体亚细胞定位预测表明,TaPM19-B1蛋白定位于细胞膜。对TaPM19-B1启动子区域的顺式作用元件进行分析,结果显示,该区域存在多个与种子发育、逆境响应以及植物激素响应相关的调控元件。结合小麦RNA-Seq转录组数据和qPCR验证显示,TaPM19-B1基因在小麦根、茎、叶和穗中基本不表达,但在小麦籽粒发育后期显著表达,尤其在10和25 DAA (开花后天数, days after anthesis)籽粒中的表达量最高。此外,该基因在干旱、盐、热和ABA胁迫下表达量均上调。对2个大粒品种(千粒重超过50 g)和2个小粒品种(千粒重小于21 g)籽粒发育不同阶段的TaPM19-B1基因表达进行分析,结果发现,大粒品种中TaPM19-B1的表达量显著高于小粒品种(P<0.05)。本研究为进一步揭示TaPM19-B1基因在小麦生长发育及逆境胁迫响应中的分子调控机制提供了理论依据。

• 谷子不育系柱头外露基因鉴定及分析

  王娟菲, 麻慧芳, 薛红丽, 赵雄伟, 郭杰, 史关燕

  不育系柱头外露是谷子(Setarial italica)杂交种制种的关键因素之一,其外露可显著提高杂交种的制种产量。本研究测定了'晋汾系21A'、'晋汾系92A'、'8116A'、'EMS-1A'和'汾33A'谷子不育系柱头外露长度,其中'晋汾系92A'的柱头外露最长(0.66 mm),而'晋汾系21A'柱头外露最短(0.06 mm)。通过同源序列比对,在谷子基因组中共鉴定到12个柱头外露同源基因。蛋白质特性分析结果显示,基因编码蛋白长度为461~127 2 aa,分子量为50.173 90~138.045 10 kD,等电点为5.05~9.13,不稳定系数为30.80~50.92。通过系统发育分析将柱头外露基因划分为4个亚组,同亚组成员具有相似的保守基序和结构域。进化树结果表明,谷子Seita.2G100300与水稻(Oryza sativa)柱头外露基因亲缘关系最近。进一步对Seita.2G100300的转录水平分析得出,在抽穗期该基因的表达量显著低于对照(P<0.05),在开花期表达量显著升高(P<0.05),相关性分析表明,Seita.2G100300的表达量与不育系'晋汾系92A'和'8116A'的柱头外露长度呈显著正相关(P<0.05)。本研究将柱头外露长度表型与相关基因转录水平进行了联合分析,研究结果为深入解析谷子不育系柱头外露分子机理提供参考。

• 马铃薯StDHN-2基因的克隆与表达分析

  魏晶晶, 马丽丽, 张宁, 司怀军

  植物脱水蛋白(dehydrins, DHN)是一类在植物遭受干旱、盐碱等逆境时表达的特异性蛋白。为探究马铃薯(Solanum tuberosum)脱水蛋白(StDHN-2)基因在植株抗旱方面的功能,本研究以马铃薯品种'Atlantic'为材料,克隆了StDHN-2基因的CDS序列,通过同源重组法构建了融合蛋白表达载体,亚细胞定位结果表明,StDHN-2蛋白可能定位于细胞核上。对StDHN-2基因进行基础的生物信息学分析,发现StDHN-2基因组全长931 bp,其中编码区序列为474 bp,可编码157个氨基酸;蛋白分子量为16 659.06 D,理论等电点为7.23,为亲水蛋白,无跨膜结构域。该蛋白二级结构以无规则卷曲为主,没有β-转角结构。通过构建系统发育树,发现StDHN-2在进化关系上和多疣茄(Solanum verrucosum)的亲缘关系最近;顺式作用元件分析表明,StDHN-2基因启动子区包含ABRE、DRE、P-box和LTR等多个与逆境响应相关的元件;利用qRT-PCR技术分析了StDHN-2基因在PEG、NaCl和脱落酸(abscisic acid, ABA) 3种胁迫处理下的表达模式发现,该基因在3种胁迫处理下都会出现一定程度的上调表达。研究结果初步说明StDHN-2基因可作为马铃薯抗旱的优良候选基因,参与植物抗旱的生物学过程。本研究为解析马铃薯StDHN-2基因的抗旱响应机制提供了基础资料。

• 枣HMGR基因家族鉴定及表达分析

  李娜, 韩红艳, 宋宇琴, 冯新新, 李六林, 李洁, 化延斌

  萜类化合物是枣(Ziziphus jujuba)发挥药用功能的主要物质,3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMGR)对植物萜类化合物生物合成具有重要作用。为了深入研究枣HMGR基因功能,本研究利用隐马尔可夫模型(HMM)对枣HMGR基因家族进行鉴定,采用生物信息学分析软件分析ZjHMGR基因家族成员的理化特征、基因结构和进化关系,采用qRT-PCR分析HMGR基因表达模式。结果表明,枣基因组中有21个HMGR基因成员,根据基因在染色体上的位置将其命名为ZjHMGR1~ZjHMGR21。21个ZjHMGR基因位于10条固定染色体和2条未放置的基因组支架上。ZjHMGR基因的CDS长度为271~3 425 bp,编码88~1 122个氨基酸,且分子量为9 827.05~124 950.93 kD。将枣与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、苹果(Malus pumila)、白梨(Pyrus bretschneideri)、烟草(Nicotiana tabacum)和西瓜(Citrullus lanatus)的HMGR家族成员蛋白全长序列进行比对并构建系统发育树发现,ZjHMGR1单独为一类,ZjHMGR11和ZjHMGR12、ZjHMGR5和ZjHMGR10被分别划分为一类,且这5个基因家族成员与拟南芥、苹果、白梨和西瓜HMGR基因存在共线性关系;ZjHMGR基因2.0 kb启动子区域存在与激素相关的顺式元件,其中11个基因有赤霉素、茉莉酸甲酯和脱落酸响应顺式元件,8个基因有生长素响应顺式元件,12个基因有水杨酸响应顺式元件。与幼果相比,成熟果实ZjHMGR基因表达量显著升高(P<0.05),且'临黄1号'和'木枣'果实ZjHMGR基因的表达量与叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和花青苷的含量显著负相关,而与类胡萝卜素含量正相关。ZjHMGR基因家族在果实成熟过程中发挥重要作用。本研究为枣萜类物质合成的遗传改良提供参考。

• 茶树醛脱氢酶(ALDH)超家族的鉴定与表达分析

  刘丹丹, 王雷刚, 孙明慧, 焦小雨, 阮旭, 吴琼, 王文杰

  醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenases, ALDHs)在植物非生物胁迫下的醛稳态中发挥着重要作用。本研究利用生物信息学方法鉴定茶树(Camellia sinensis) ALDH超家族成员,分析其编码的蛋白理化特性、染色体定位、基因结构、启动子顺式作用元件和系统进化关系等生物学信息;利用qRT-PCR技术分析CsALDH超家族成员在干旱、盐和低温胁迫下的表达模式。结果显示,在茶树基因组中鉴定到27个ALDH超家族成员,系统发育分析将其划分为10个家族。同一家族的成员具有相似的基序组成和基因结构。共线性与进化分析表明,CsALDHs基因在茶树基因组内发生基因复制事件,且在进化过程中经历了纯化选择作用。qRT-PCR结果显示,分别有8、10和9个候选CsALDHs基因被PEG、NaCl和低温诱导表达,尤其是CsALDH2B4和CsALDH3H2显著上调表达。本研究为深入研究茶树ALDH基因的功能提供了理论基础。

• 梅花GATA基因家族鉴定及PmGATA12在耐寒性调控中的作用分析

  刘钊良, 张军, 金小军, 金松恒, 董彬

  梅花(Prunus mume)是我国的传统名花,具有重要的观赏价值。GATA转录因子在植物生长发育以及非生物胁迫调控过程中发挥重要的作用。本研究对梅花GATA基因家族进行全基因组鉴定,并对低温处理后PmGATA12的表达模式及功能进行了解析。研究结果表明,通过全基因组分析鉴定出20个PmGATA基因,分布在7条染色体上;系统进化分析发现,PmGATA蛋白可分为3个亚家族,同一亚族成员具有相似的保守基序和基因结构。结合转录组和qRT-PCR表达分析,获得了4个差异表达的PmGATA基因(PmGATA6, PmGATA11, PmGATA12和PmGATA14)。选择差异表达的PmGATA12基因异源转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),结果显示,过表达PmGATA12显著增强了转基因株系的耐寒性。本研究为梅花的耐寒育种提供了重要的基因资源,也为深入理解梅花耐寒性的分子机制提供了新的线索。

• 猪PLAG1基因过表达对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响

  吴姿仪, 白利瑶, 吴嘉浩, 窦腾飞, 李新建, 韩雪蕾, 乔瑞敏, 王克君, 杨峰, 李秀领

  多形性腺瘤基因1 (plemorphic adenoma gene 1, PLAG1)在调控畜禽生长发育中具有重要作用。本课题组前期通过全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)方法筛选到该基因与猪(Sus scrofa)的背膘厚(backfat thickness, BF)有关,其可能对脂肪细胞有潜在的调控作用。为进一步探究PLAG1基因与脂肪细胞的关系,本实验以3T3-L1前脂肪细胞为研究对象,并对PLAG1基因进行保守性分析,通过qRT-PCR、CCK-8、流式细胞术和油红O染色等技术探究过表达PLAG1基因对脂肪细胞增殖分化的影响。结果表明,PLAG1基因的保守性较高,在不同物种间的相似度为80%~92%;qRT-PCR结果显示,过表达PLAG1基因后,3T3-L1细胞增殖相关基因的表达极显著高于对照组(P<0.01);CCK-8结果表明过表达PLAG1基因后极显著提高了细胞活性(P<0.01);流式细胞术发现过表达PLAG1基因后S期的细胞数显著增加(P<0.05)。油红O染色结果显示,过表达PLAG1基因后显著降低成脂分化相关基因的表达(P<0.05),细胞脂滴数量也极显著降低(P<0.01)。综上,过表达PLAG1基因促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,抑制其分化,说明PLAG1基因可能在脂肪细胞增殖和分化过程中发挥作用。本研究为进一步探究猪PLAG1基因调控脂肪沉积分子机制提供理论参考。

• 一氧化氮合酶在奶牛临床型乳房炎乳腺组织中的表达、定位及功能分析

  李建富, 张博皓, 陈文丽, 袁宝, 张勇, 赵兴绪, 张全伟

  一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)是机体内源性一氧化氮(nitric oxide, NO)生成的关键酶,其催化生成的NO具有抗炎或促炎等多重作用。为了探究健康与患临床型乳房炎奶牛(Bos taurus)乳腺组织中NOS表达规律及其潜在功能,本研究以处于健康(control, Con)和临床型乳房炎(clinical mastitis, CM)状态的泌乳期荷斯坦奶牛乳腺组织为研究对象,利用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)、免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色和实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)分析奶牛乳腺组织中NOS分布及表达规律;通过生物信息学方法分析奶牛乳腺组织中NOS潜在作用。HE染色显示,CM组乳腺组织腺泡塌陷,伴随炎性细胞浸润;IHC染色显示,奶牛乳腺上皮细胞胞质中神经型一氧化氮合酶(neuronal NOS, nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS, iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS, eNOS)呈阳性表达;qRT-PCR结果显示,与Con组相比,CM组奶牛乳腺组织nNOS和eNOS mRNA表达水平极显著下调(P<0.01),iNOS mRNA表达水平极显著上调(P<0.01);生物信息学分析显示,NOS可能通过调控NO与氨基酸合成代谢过程及离子转运过程参与CM发生。综上表明,NOS可能通过奶牛乳腺上皮细胞中NO生成调控乳腺炎症反应。本研究为深入揭示奶牛CM中NOS功能及调控机制提供参考。

• 麦洼牦牛毛色候选基因STX17的克隆及组织表达分析

  石琳, 郭子玄, 李小伟, 马士龙, 何小强, 江明锋, 刘益丽

  麦洼牦牛(Bos grunniens)是青藏高原型牦牛的地方良种,前期研究表明,麦洼牦牛的毛色与其生产性能相关,可作为育种依据,其灰毛性状与突触融合蛋白17 (syntaxin-17, STX17)基因的表达水平相关,STX17蛋白参与溶酶体和自噬体融合过程,在黑色素的合成、运输及黑色素瘤的生成中起重要作用。为研究STX17基因与麦洼牦牛毛色形成的相关性,本研究选取3岁龄的健康成年雄性黑色和灰色麦洼牦牛各3头,以其心、脾、肺、肾和皮肤组织作为实验材料,通过PCR克隆STX17基因编码区序列,利用在线软件对其进行生物信息学分析,用qRT-PCR技术检测STX17基因在麦洼牦牛不同组织及不同毛色种群中的表达情况。结果表明,麦洼牦牛STX17基因CDS区全长909 bp,编码的蛋白质含302个氨基酸,等电点(pI)理论值为5.82,为酸性蛋白;STX17蛋白无信号肽序列,存在1个靶膜相关的可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors, SNARE) 结构域和2个串联的跨膜结构域;亚细胞定位预测STX17蛋白主要存在于细胞质中;核苷酸序列比对显示,麦洼牦牛STX17基因与黄牛(Bos taurus)亲缘性最近,其次是水牛(Bubalis bubalus);STX17蛋白与自噬相关蛋白14 (autophagy-related protein 14, ATG14)、突触体相关蛋白29 (synaptosome associated protein of 29, SNAP29)、囊泡相关膜蛋白7 (vesicle associated membrane protein 7, VAMP7)、囊泡相关膜蛋白8 (vesicle associated membrane protein 8, VAMP8)和突触素同源物(synaptobrevin homolog, YKT6)等蛋白存在相互作用;qRT-PCR结果显示,STX17基因在皮肤组织中表达量最高,且在灰毛麦洼牦牛皮肤中的表达量高于黑毛麦洼牦牛,推测STX17基因与麦洼牦牛灰色和黑色毛色的形成有关。本研究为后续麦洼牦牛毛色的调控机制等研究提供理论依据。

• 大通牦牛和阿什旦牦牛生长性状相关遗传标记的验证

  马万浩, 马晓玲, 孙武, 殷满财, 景建武, 胡广卫, 李鸿康, 赵寿保, 马海福, 韩鹏, 张有柱, 张君

  结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、CREB调节转录辅激活因子3 (CREB regulated transcription coactivator 3, CRTC3)和跨膜蛋白18 (transmembrane protein 18, TMEM18)在哺乳动物生长发育中发挥着重要作用。为了确定大通牦牛(Bos grunniens)和阿什旦牦牛群体中与生长性状相关的遗传标记及其基因多态性，本研究采用DNA一代测序技术对CTGF、CRTC3和TMEM18基因的5个位点进行了SNP检测及基因分型，并对多态位点的基因型与牦牛生长性状进行关联分析。结果显示，在大通牦牛和阿什旦牦牛群体中，CTGF基因的G2511A位点存在2种基因型，CRTC3基因的C86041T、G86075A位点和TMEM18基因的C1267T、C4447T位点各存在3种基因型；CRTC3基因C86041T位点和TMEM18基因C4447T位点均显示中度多态性(0.25＜PIC＜0.50)。但是，在χ2检验中发现，上述5个SNP位点在2个牦牛群体内均未达到Hardy-Weinberg平衡状态，提示2个群体经历了长期人工选择。生长性状的关联分析显示，CTGF基因G2511A位点与体高显著相关(P＜0.05)；CRTC3基因的2个SNP与体重显著相关(P＜0.05)，且G86075A位点与体高和胸围显著相关(P＜0.05)；TMEM18基因的2个SNP与体重显著相关(P＜0.05)。因此，上述生长性状相关SNP位点与大通牦牛和阿什旦牦牛的生长性状具有相关性，可作为分子标记辅助选择的候选基因。本研究为牦牛育种改良提供了潜在的遗传标记。

• 迷迭香酸对奶山羊精液冷冻保存作用的研究

  张佩, 徐刚刚, 袁媛, 张建永, 严天荣, 彭忠宏, 李宗儒, 侯金星, 安小鹏

  精液冷冻保存的过程中精子细胞极易遭受损伤,其中过多的自由基会引起氧化应激,通过增加活性氧的产生对细胞系统产生负面影响。因此,精液冷冻保存中抗氧化剂的使用至关重要。迷迭香酸(rosmarinic acid, RA)是一种天然多酚类抗氧化剂,具有较强的抗氧化活性。本研究在奶山羊(Capra hircus)精液冷冻保存稀释液中添加0、20、40、80及120 μmol/L迷迭香酸,检测精液质量及精子抗氧化能力,并通过LC-MS非靶向代谢组学技术分析了奶山羊精子冷冻后的精浆代谢特征。结果表明,迷迭香酸能够改善冷冻保存奶山羊精液的质量、提高精子抗氧化能力,在对照组与迷迭香酸处理组中检测到309种差异代谢物质,且迷迭香酸通过腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)信号通路调控精子的能量代谢,通过PI3K-Akt信号通路,激活或抑制B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)等凋亡相关蛋白。研究表明,添加40 μmol/L迷迭香酸能够改善奶山羊精液冷冻保存效果。本研究为优化奶山羊精液冷冻保存技术提供了新的思路与理论依据。

• NRAMP1基因过表达山羊的生产及血液生理生化和生长性能测定

  王聪亮, 陈文博, 万仕成, 李剑南, 任赵飞, 韩斌, 李娜, 雷安民, 杜晓敏, 屈雷, 朱海鲸, 华进联

  天然抗性相关性巨噬细胞蛋白1 (natural resistance-associated macrophage protein 1, NRAMP1)与结核病、布鲁氏菌病等多种胞内菌感染抗性相关。本研究旨在制备NRAMP1基因过表达山羊(Capra hircus),并对基因过表达山羊的血液生理生化和生长发育指标进行比较分析,为抗布鲁氏菌病模型建立和转基因动物遗传育种提供研究模型与平台。基于本实验室前期构建的山羊NRAMP1基因慢病毒表达载体,利用山羊超数排卵和原核胚胎显微注射技术进行NRAMP1基因过表达山羊的生产,监测评估NRAMP1基因过表达对山羊血液生理生化变化和生长发育的影响。结果显示,成年陕北白绒山羊以210 IU 促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)剂量进行超数排卵的原核胚胎回收率显著高于270 IU(P<0.05);原核胚胎显微注射后移植共获得15只山羊,经PCR鉴定,3只为阳性基因过表达山羊;qRT-PCR和Western blot鉴定结果表明,NRAMP1在基因过表达山羊睾丸组织中的mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05);血液生理与生化测定结果表明,NRAMP1基因过表达山羊与野生型山羊的各项血液生理与生化指标差异不显著(P>0.05);生长性能测定结果表明,NRAMP1基因过表达山羊与野生型山羊初生重、1~6月龄体重和3~6月龄体高、体长等生长性状差异不显著(P>0.05)。本研究成功构建NRAMP1基因过表达山羊模型,且NRAMP1基因过表达不影响山羊自身健康。本研究为培育抗布鲁氏菌病山羊及其抗病机制研究提供了科学依据。

• srsf3基因在中国大鲵组织及性腺发育时期表达特征分析

  孟方, 方俊超, 田海峰, 邵蓬, 胡乔木

  大鲵(Andrias davidianus)雌雄生长差异大,在性别分化过程中丝氨酸和精氨酸富集的剪接因子3(serine/arginine-rich splicing factor 3, srsf3)基因被证实参与大鲵性别分化相关基因—核受体亚家族5 组A成员2 (nuclear receptor subfamily 5 group A member 2, Nr5a2)选择性剪接。为探究srsf3基因在中国大鲵性别分化中的作用机制,本研究采用qPCR技术分析大鲵不同组织,不同发育时期性腺与性激素诱导后性腺中srsf3表达量的变化;通过荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)确定srsf3基因在大鲵精巢与卵巢中的表达定位。通过前期对大鲵性腺转录组测序结果分析,srsf3基因全长为1 478 bp,开放阅读框为504 bp,编码167个氨基酸。系统进化分析表明,大鲵SRSF3氨基酸序列与两栖纲热带爪蟾(Xenopus tropicalis)亲缘关系密切。qPCR结果表明,srsf3基因在大鲵卵巢中表达水平最高,垂体组织中次之,肌肉与心脏组织中表达稍低;在肝脏、脾脏、肺、胃组织中低表达。srsf3基因在大鲵性腺各时期中的表达显示,2~5年龄卵巢均显著高于精巢(P<0.05);2龄时期卵巢中表达量达最高,随后srsf3基因表达量在卵巢中呈逐年下降趋势,于4~6龄卵巢中表达量趋于稳定态势。srsf3基因表达量在性逆转雄性中最高,其次为性逆转雌性;在性逆转雌鱼卵巢中显著性高于普通雌鱼卵巢(P<0.05),性逆转雄鱼精巢中表达量显著高于普通雄鱼精巢(P<0.05)。FISH结果显示,srsf3基因在大鲵卵巢、精巢中均有表达。以上研究表明,srsf3基因参与大鲵性腺发育过程,且在大鲵性逆转过程中发挥重要作用。本研究对srsf3基因的功能解析有助于加深对两栖类性别分化机制的理解。

• 拮抗白术疫病病原菌的木霉菌的分离鉴定及其防效

  王娇, 刘晓宁, 焦甜甜, 沈凤英, 刘大群, 李亚宁

  近年来由于连作,白术(Atractylodes macrocephala)的病虫害问题严重,导致白术产量减少,品质下降,其中疫霉引起的白术疫病给白术生产造成了严重的损失。木霉菌(Trichoderma spp.)对多种植物病原菌具有较好的抑制作用,并可产生多种具有拮抗作用的活性物质,是最主要的生防真菌之一。本研究以白术连作地的健株根际土及其地下根茎为材料,以白术疫病病原菌桑瑟姆氏疫霉菌(Phytophthora sansomeana) AMPH-1为指示菌进行拮抗木霉菌的筛选,根据抑制效果和拮抗等级,筛选出3株抑菌效果较好的木霉菌株,即TPS-87、TPS-90和TPS-99,抑菌率分别达到77.19%、80.04%和78.49%。结合形态学和分子鉴定,确定菌株TPS-87为非洲哈茨木霉菌(T. afroharzianum),菌株TPS-90和TPS-99均为深绿木霉菌(T. atroviride)。分别施用TPS-87、TPS-90和TPS-99拮抗菌孢子悬浮液浓度为1×106 cfu/mL,接菌量为150 mL时,这3株木霉菌对白术幼苗的促生效果较好,对白术疫病的温室防效分别为61.54%、53.85%和50%。本研究为白术疫病绿色防控措施提供生防菌资源,为进一步开发防治中药材疫病的生防制剂提供重要依据。

• 瘤胃微生物来源碱性果胶酸裂解酶IDSPL1-20的表达与性质研究

  白书宁, 李锘, 邓倩, 李诗棋, 徐晓锋, 王佳堃, 张慧恩, 王谦

  果胶酸裂解酶(pectate lyases, Pel)在果胶降解中发挥重要作用,广泛应用于食品工业、纺织品加工等领域。本研究克隆并异源表达了1个来源于湖羊(Ovis aries)瘤胃微生物的果胶酸裂解酶基因IDSPL1-20 (GenBank No. PP975428),并对重组蛋白rIDSPL1-20的活性和酶学性质进行研究。结果表明,rIDSPL1-20的最适温度、pH分别为50 ℃、pH 10.0。该酶的热稳定性较差,但具有较强的耐碱能力,在pH 9.0~11.0下处理1 h残余活性仍大于80%。反应体系中添加0.25~2 mmol/L Ca2+能显著提升rIDSPL1-20的催化活性(P<0.05)。多底物分析显示,rIDSPL1-20降解聚半乳糖醛酸(polygalacturonic acid, PGA)和60%酯化果胶(60% DE pectin)的最大反应速度Vmax分别为(316.25±34.09)和(105.55±3.72) µmol/(min·mg),降解产物主要为不饱和三聚半乳糖醛酸(unsaturated trigalacturonate, uG3)与不饱和二聚半乳糖醛酸(unsaturated digalacturonate, uG2),属于内切果胶酸裂解酶(endo-pectate lyase, EC 4.2.2.2)。此外,rIDSPL1-20能有效提升Cellic® CTec3 HS对于花生(Arachis hypogaea)秸秆的降解效率,协同催化2和4 h后,总还原糖产量分别为(0.50±0.07)和(0.57±0.14) mg/mL。本研究为研发新型生物质降解酶建立基础。

• 新城疫病毒基因Ⅶ型血凝素-神经氨酸酶蛋白在水稻细胞中的表达及免疫原性

  史倩倩, 陈金炫, 陈恒耀, 寇少康, 楚红燕, 张磊, 潘世源, 张二芹, 张改平

  新城疫是新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,其中基因Ⅶ型病毒流行广泛。血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase protein, HN)是病毒的结构蛋白,也是宿主细胞受体识别和促进细胞膜融合的重要免疫原性蛋白。水稻(Oryza sativa)细胞是生产生物药物的一个有前景的经济有效的生物反应器平台,水稻α-淀粉酶3D系统包含一个诱导启动子,在糖饥饿条件下具有很强的激活活性,可以高效、高水平地表达外源蛋白。本研究从NCBI上筛选NDV基因Ⅶ型HN氨基酸序列,根据水稻密码子偏爱性对HN基因进行优化,构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HN;利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将HN基因转入到水稻愈伤组织中,经潮霉素筛选和PCR鉴定阳性愈伤,在阳性愈伤中诱导表达HN蛋白,通过Western blot鉴定。利用SP阳离子层析和Hiloard 75 pg凝胶层析纯化HN蛋白,并以5和10 μg剂量分别与Al(OH)3和50V佐剂乳化,免疫6周龄BALB/c雌鼠(Mus musculus),通过血凝抑制(hemagglutination inhibition, HI)实验和中和实验(neutralizing test, NT)检测抗体的效价,并检测二次免疫6周后白细胞介素-2 (interleukin-2, IL-2)水平。结果显示,成功构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HN,并鉴定出85个阳性愈伤,HN蛋白在水稻细胞中成功表达和纯化。免疫小鼠后,除PBS组,每组产生的抗体水平达到免疫保护效果(HI≥24),能够产生中和抗体,具有病毒中和作用。本研究在水稻细胞中表达了新城疫HN蛋白,建立了HN蛋白纯化方法,低剂量HN蛋白免疫动物后,具有良好的免疫效果,为今后新城疫亚单位疫苗的研究提供了参考依据。

• 独脚金内酯合成、信号途径与生理功能研究进展

  陈静雯, 张俊民, 李妍妍, 纪军

  独脚金内酯(strigolactones, SLs)是一类新鉴定的能够强烈抑制植物分枝/分蘖形成的激素,在植物生长发育过程和抗逆过程中发挥重要作用。随着对SLs合成和信号途径的深入研究,鉴定了一系列可用于调控植物株型建成的基因。本文综述了独脚金内酯的发现过程、化学结构、合成途径、代谢途径、分布和运输、信号途径以及其在调控植物生长发育过程中的功能等。预测独脚金内酯在调控作物株型、抗逆、寄生等方面将成为未来的研究重点。本文为作物理想株型的建成和培育高产抗逆的新品种提供了思路和理论基础。

• 灵芝基因组学及其功能基因研究进展

  谢欣, 贺黎铭, 蔡凌, 刘林秋, 罗霞

  灵芝(Ganoderma lingzhi)是一种名贵的食、药用真菌,目前,从其各种组织中分离得到的次级代谢产物种类有200多种,其中灵芝三萜类化合物和灵芝多糖是其主要活性成分;药理学作用主要包括：抗高血压、抗肿瘤、抗衰老、免疫调节作用和对心血管系统疾病的缓解作用等;随着灵芝基因组测序的完成和遗传转化体系的建立,使其逐渐成为研究药用真菌次级代谢产物合成和调控的模式真菌;对灵芝的分子生物学研究涉及种质资源鉴定、遗传多样性、品种育种和功能基因克隆等方面,本文从灵芝的基因组学研究、参与调控灵芝生长发育、代谢产物合成、非生物胁迫以及信号转导的功能基因研究进展等方面进行了总结,为灵芝的进一步开发应用提供参考,也为阐明灵芝疗效的分子机理提供科学依据。

• 基于X、Y精子差异的家畜精子分选技术研究进展

  曹超越, 胡冰艳, 李孟轩, 庞卫军

  家畜性别控制是通过人为干预使动物生产出预期性别的后代的繁殖技术,包括授精前X、Y精子分离和受精后胚胎鉴定。其中,授精前将X、Y精子分离是最直接、有效的方法。家畜X、Y精子存在多种固有差异,利用上述差异建立简便、价廉和高效的精子分选技术对提高畜牧业经济效益具有重要意义。本文综述了家畜X、Y精子多维度生物学差异,包含运动性能、蛋白组成、DNA含量及表面膜电荷等。并基于此阐述3类主流分选技术：1)基于X、Y精子运动差异的上游法、pH值法、Toll样受体7/8 (Toll-like receptors 7/8, TLR7/8)激活法;2)基于蛋白组成差异的磁珠偶联抗体法、聚乳酸薄膜偶联抗体法;3)基于DNA含量差异和表面膜电荷差异的流式细胞分选法和电泳法。此外,本文还对每种方法的优点与局限性进行了分析评价,并对未来家畜X、Y精子分选技术的研究方向进行展望,为家畜性别控制新技术的研发提供理论依据。

• 发根农杆菌介导的甜瓜转化体系的建立及对CRISPR/Cas9靶位点的快速检测

  舒铫, 杨嵩涵, 孔可心, 吕若涵, 吕桂云, 张春秋, 宋士清

  利用 CRISPR/Cas9 系统进行基因编辑是研究甜瓜(Cucumis melo)基因功能和进行遗传改良的有效方法,但目前缺少在遗传转化前能够快速检测 CRISPR/Cas9 载体靶位点的方法。本研究以甜瓜 八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)基因 CmPDS为靶标,构建CRISPR/Cas9系统双靶点的基因敲除载体,通过发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) K599 侵染厚皮甜瓜'K7-2'和薄皮甜瓜'LB'的子叶外植体,利用 Bar 试纸条对诱导出的毛状根进行鉴定,并对毛状根进行测序分析以明确基因编辑类型。结果显示靶点 1 的编辑效率为 100%,靶点 2 的编辑效率为 76.5%,存在多种编辑类型,包括单碱基和多碱基的插入、缺失,以及2靶点间大片段缺失。本研究成功建立了发根农杆菌介导的甜瓜遗传转化体系,实现了对 CRISPR/Cas9 载体靶位点的快速检测,验证了 CRISPR/Cas9 在甜瓜基因编辑中的有效性,为甜瓜基因功能研究和遗传改良提供了技术支持。

• 奶牛ARPC3多克隆抗体制备及ARPC3在乳腺组织中的表达

  白文凯, 刘佩雯, 陈艳, 王安, 方博, 杨庭基, 张全伟, 王琪, 赵兴绪, 董伟韬, 张勇

  肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基3 (actin associated protein 2/3 complex subunit 3, ARPC3)是肌动蛋白骨架组织的重要组成部分,对细菌的侵袭、炎症发展和细胞凋亡具有重要作用。为了研究ARPC3蛋白对奶牛(Bos taurus)乳房炎的作用,本研究利用在线软件对奶牛ARPC3进行生物学特性分析,构建pQE-80L-ARPC3重组质粒,通过原核表达系统诱导表达蛋白,并对异丙基-β-D-硫代半乳糖(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)浓度和诱导时间进行优化。将表达的蛋白经亲和层析法纯化,通过SDS-PAGE和质谱鉴定后免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备多克隆抗体,采用ELISA和Western blot分别鉴定多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,成功构建了重组质粒pQE-80L-ARPC3,最佳诱导表达条件为IPTG浓度1 mmol/L诱导8 h,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白(大小约为20.5 kD)。ARPC3多克隆抗体血清效价为1∶128 000。天然蛋白Western blot鉴定表明,ARPC3多克隆抗体血清能特异性识别目的蛋白和乳腺组织中的ARPC3。免疫组织化学(immunohistochemical, IHC)结果表明,ARPC3蛋白的表达与相关凋亡蛋白的表达呈正相关,所制备多克隆抗体能很好地应用于奶牛乳房炎的检测。本研究成功制备出特异性良好的奶牛ARPC3多克隆抗体,可以用于奶牛乳房炎快速检测新技术的建立及应用。