农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2023年第12期

• 玉米氯酸盐抗性全基因组关联分析

  王孜慧, 吉伟东, 魏杰, 王芸芸, 王后苗, 杨泽峰, 徐辰武, 李鹏程

  氯酸盐抗性是评价作物氮效率的重要指标。为了挖掘玉米(Zea mays)氯酸盐抗性的QTL和候选基因,本研究以283份玉米自交系为材料,分别在正常和氯酸盐处理下测定7个性状,计算各性状的氯酸盐抗性。结果表明,氯酸盐处理后叶绿素相对含量、株高、叶长、地上部干重均显著降低;全基因组关联分析(genome wide association study, GWAS)共定位到133个显著SNP位点,正常条件、氯酸盐处理及不同性状的氯酸盐抗性分别定位到51、53、29个显著SNPs;结合关联分析和转录组分析筛选到13个候选基因,包括剪切和多聚腺苷酸化特异性因子、N-乙酰基-5-羟色胺-O-甲基转移酶、MYB转录因子等。本研究为解析玉米氯酸盐抗性的遗传机制提供了候选基因,对于挖掘玉米氮高效关键基因位点和氮高效遗传改良具有一定的参考意义。

• 陆地棉HD-ZIP_N基因家族的全基因组分析

  叶泗洪, 季美君, 陈奇, 冯群, 王冬梅, 孙萌, 邓小楠, 汪睿, 韩文兵, 汪保华

  本课题组在前期研究中结合转录组测序和QTL定位鉴定到1个棉花(Gossypium)纤维强度候选基因Gh_D09G1210,该基因属于同源异型域-亮氨酸拉链(homeodomain-leucine zipper, HD-ZIP)_N基因家族。为了鉴定陆地棉(G. hirsutum) HD-ZIP_N基因家族成员并分析其在棉花纤维强度形成中的作用,本研究利用生物信息学方法对陆地棉HD-ZIP_N基因家族进行了全基因组分析;利用qPCR方法分析了开花后不同时期棉纤维中HD-ZIP_N基因的表达模式。在陆地棉基因组中鉴定到了18个HD-ZIP_N基因家族成员。保守基序(motif)分析及启动子序列分析表明,该基因家族成员具有高度相似的特征序列和结构域。基因进化树结果表明,该基因家族的成员可被分为3个亚类。根据染色体位置信息,HD-ZIP_N基因家族的成员分别定位在10条不同染色体上。非同义替换率/同义替换率(nonsynonymous substitution rate/synonymous substitution rate, Ka/Ks)值表明大部分同源基因都经过了纯化选择。基因共线性分析表明,分布于同源染色体上的HD-ZIP_N基因家族成员间具有较强的连锁关系。取开花后17和21 d的棉花纤维进行qPCR验证实验,结果表明,Gh_D11G0809、Gh_D04G0859和Gh_A11G0693这3个基因在纤维品质普通的'PD94042'和纤维品质优异的'IL9'中具有显著下调的趋势 (P<0.05),而在'IL9'中Gh_A09G1204有着显著上调的趋势(P<0.05),表明HD-ZIP_N基因家族成员在纤维强度发育过程中具有调节作用。本研究发现,HD-ZIP_N基因家族成员在陆地棉纤维强度发育过程中有一定的调节作用,可为分子育种改良棉花纤维强度提供基因资源。

• 连作对芹菜根际土壤微生物群落结构及多样性的影响

  卢雨欣, 冯志珍, 贾俊超, 梁建强, 赵文娟, 白亚妮

  土壤微生物群落的变化是影响连作障碍的主要因素之一。芹菜(Apium graveolens)在栽培中存在连作障碍问题,但连作模式下的芹菜根际土壤微生物群落变化情况尚不清楚。本研究利用Illumina MiSeq方法研究连作后芹菜根际细菌和真菌群落的变化。结果表明,连续单一栽培后,芹菜根际土壤细菌丰富度增加,但多样性无显著变化;真菌丰富度及多样性显著降低。分类学分析进一步表明,在所有芹菜根际土壤样品中,变形菌门、放线菌门、酸杆菌门和绿弯菌门是优势细菌菌门,子囊菌门是绝对优势真菌门。连作后,生病植株的根际土壤真菌群落丰富度与健康植株相比显著下降(P<0.05),与未种植芹菜土壤相比下降达到极显著水平(P<0.01)。线性判别分析结果显示,连作健康芹菜、连作生病芹菜和同一块地未种植芹菜的3种土壤样品显著富集的细菌均为有益菌。而病原真菌匍柄霉属(Stemphylium sp.)丰度在生病植株根际显著增加(P<0.05),这可能是引起芹菜连作障碍发生的重要因素。本研究揭示了连作条件下芹菜根际土壤细菌和真菌群落多样性及组成变化,有助于明确连作模式下芹菜根际土壤的微生态环境。

• 番茄病程相关蛋白SlPR1b基因的克隆、表达及其在青枯菌胁迫下的功能分析

  陈娜, 李晓鹏, 刘进法, 邵勤

  病程相关蛋白1 (pathogenesis-related protein 1, PR1)基因在植物抗生物和非生物胁迫中起着重要作用。基于本课题组前期青枯菌(Ralstonia solanacearum)胁迫的转录组数据,本研究利用反转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)技术从番茄(Solanum lycopersicum)中克隆到1个青枯菌胁迫相关的PR1基因,并将其命名为SlPR1b (Solyc00g174340.2);利用qPCR方法,研究了SlPR1b基因的组织表达特异性和在青枯菌侵染、水杨酸(salicylic acid, SA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonic, MeJA)处理条件下的表达特性,并构建了SlPR1b基因病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)载体,并将其转化番茄抗病材料,分析沉默SlPR1b基因番茄在青枯菌胁迫条件下的抗病能力。结果显示,克隆的SlPR1b基因cDNA全长序列为807 bp,其ORF为480 bp,编码159个氨基酸,包含1个保守的CAP-PR-1结构域(cd05381),属于CAP超家族。SlPR1b分子量为17 519.73 D,等电点为8.86,属于具有跨膜结构的分泌蛋白。同源序列比对和系统发育分析表明,SlPR1b与潘那利番茄(Solanum pennellii) SpPR4蛋白的亲缘关系最近,其次为马铃薯(Solanum tuberosum)和辣椒(Capsicum baccatum)。组织特异性表达结果表明,SlPR1b基因在番茄叶片中的表达量最高。此外,SlPR1b基因的表达可被青枯菌、SA和MeJA所诱导。沉默SlPR1b基因会降低番茄植株对青枯病的抗性,该结果表明SlPR1b在番茄抗青枯病中起着正调控作用。本研究为后续进一步研究SlPR1b基因在番茄抗青枯病响应中的调控功能提供理论依据。

• 不同砧木对'阳光玫瑰'葡萄果实品质及糖异生相关基因表达的影响

  沈乐意, 王立如, 徐悦, 陈天池, 徐涛, 郭雁飞, 房聪玲, 范林洁, 吴月燕

  葡萄(Vitis vinfera)是世界四大水果之一,其优良栽培很大程度上取决于嫁接。嫁接不仅能提高果树的抗性,而且也影响着果实品质。为探究不同砧木对'阳光玫瑰'葡萄果实品质及糖异生(gluconeogenesis)相关基因表达的影响,筛选出江浙地区综合品质优良的砧穗组合。本研究以嫁接在12种砧木上的'阳光玫瑰'为样本,测定其果实的品质指标,并对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)、丙酮酸磷酸二激酶(pyruvate phosphate dikinase, PPDK)、果糖-1,6-二磷酸酶(fructose-1,6-bisphosphatase, FBP)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因的表达进行实时荧光定量PCR分析。结果表明,12种砧木嫁接均不同程度地影响了'阳光玫瑰'果实品质,特别是氨基酸、可溶性糖和有机酸含量。在12种砧穗组合中,'8B'砧嫁接'阳光玫瑰'后其果实的大小和硬度最大,'1103P'、'5BB'砧嫁接后果实固酸比最大,'贝达'砧嫁接后果肉中各种氨基酸含量均最高;'101-14'、'5BB'砧嫁接'阳光玫瑰'后果实中的葡萄糖、果糖含量最高,而'3309C'砧木嫁接'阳光玫瑰'后,果实中葡萄糖、果糖含量在12种砧穗组合中较低,但酒石酸、苹果酸、柠檬酸等酸类物质的含量较高。砧木嫁接对糖异生相关基因的表达均有影响,但对PEPCK基因表达的影响最大,'101-14'砧嫁接'阳光玫瑰'后果实中PEPCK、PPDK、FBP和GAPDH的表达水平最高。同时,不同砧穗组合的葡萄糖、果糖含量与PEPCK的表达量呈显著正相关,推测不同砧木影响葡萄果实中PEPCK基因的调控,从而影响糖分的积累。主成分分析法综合排名前三的砧穗组合依次是8B/SM、Beda/SM和K3/SM。本研究为优质砧木筛选提供理论依据。

• 芸豆CBF基因家族鉴定及低温胁迫下的表达分析

  龙子轩, 刘伟, 王玉萍, 张晓旭, 罗新锐, 王智

  CBF (C-repeat binding factor)是在植物响应低温胁迫中发挥重要作用的一种可被快速诱导的关键信号转录因子。本研究对芸豆(Phaseolus vulgaris) CBF基因家族进行了生物信息学分析并利用转录组数据(RNA-seq)和qRT-PCR对芸豆CBF基因在低温胁迫下的表达进行了检测。结果表明,在芸豆中共鉴定出7个PvCBFs,不均匀分布在5条染色体上;系统进化分析发现,芸豆CBF成员被分为4个亚组(Ⅰ~Ⅳ),与基因结构和保守基序分析结果相同;共线性分析发现,芸豆和拟南芥(Arabidopsis thaliana) CBF基因家族之间存在5对直系同源基因对,PvCBFs基因之间存在6对旁系同源基因对;启动子分析发现,PvCBFs含有多种参与植物生长发育、激素以及逆境响应的顺式元件;组织表达分析发现,PvCBFs基因具有明显的组织表达特异性;qRT-PCR结果显示,3个PvCBFs在低温胁迫下显著上调表达(P<0.05)。本研究可为后续PvCBFs耐低温功能分析提供参考依据。

• 蓖麻NAC基因家族鉴定及表达分析

  李艳肖, 向殿军, 满丽莉, 刘鹏

  NAC转录因子作为陆生植物特有转录调控因子,在植物适应环境和抗逆境胁迫过程中发挥着积极的作用。本研究利用生物信息学手段在蓖麻(Ricinus communis)的全基因组中共鉴定到了不均匀分布在10条染色体上的74个NAC转录因子,并且发生了13次基因间的复制。系统进化分析显示,RcNACs与拟南芥(Arabidopsis thaliana) NACs共被分为8个亚簇,每一亚簇中的成员均含有NAM结构域和保守的motif 2,并且基因组成结构类似。在RcNACs的启动子区域共鉴定到了15种胁迫类、激素响应类和生长发育相关的顺式作用元件。组织表达谱表明,被检测到的54个RcNACs在蓖麻中拥有明显的组织表达特异性,且有39.8%的成员在蓖麻的雄花中高表达;胁迫表达谱表明,被检测到的61个RcNACs中除了6个基因不响应干旱胁迫和盐胁迫,其余分别有47.3%和49.1%的基因在盐和干旱胁迫的早期上调表达;低温表达谱显示,39个RcNACs中有64.1%的基因在胁迫早期上调表达。低温胁迫下的qRT-RCR检测结果显示,10个RcNACs对低温应答时间响应持久,多数基因有着双峰表达模式且在胁迫72 h出现表达峰值,表明RcNACs是蓖麻的逆境胁迫响应基因。本研究可为RcNACs在蓖麻非生物胁迫的调控作用中提供理论参考。

• CYP17A1基因敲低对山羊睾丸间质细胞睾酮合成和睾丸发育相关基因表达的影响

  张远, 陈祥, 张艳, 付开斌, 唐文, 陈家靖, 嵇桃桃, 杨沛方

  细胞色素P450c17 (cytochrome P450c17, CYP17A1)是胆固醇合成雄激素途径中的限速酶,在雄激素生物合成中具有关键作用。明确CYP17A1对山羊(Capra hircus)睾酮合成和睾丸发育的影响,对于提高公羊繁殖力具有重要意义。本研究以黔北麻羊为研究对象,构建CYP17A1的RNA干扰载体并转染至睾丸间质细胞,以qRT-PCR和Western blot技术检测CYP17A1基因敲低效果,以CCK-8 (Cell Counting Kit-8)检测CYP17A1敲低对睾丸间质细胞增殖的影响;利用qRT-PCR检测增殖相关基因、睾酮合成相关基因以及睾丸发育相关基因的表达水平。结果显示,CYP17A1在各月龄的睾丸和附睾组织中均有表达,其基因敲低效果明显,CYP17A1基因和蛋白表达均极显著下调(P<0.01),睾丸间质细胞的增殖受到极显著抑制(P<0.01);CYP17A1基因敲低使间质细胞增殖相关基因增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和细胞周期蛋白E (cyclin E),睾酮合成相关基因CYP11A1、3β-羟基类固醇脱氢酶1型(3β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1, HSD3B1)、HSD17B3和CYP19A1以及睾丸发育相关基因—类无精症缺失基因 (deleted in azoospermia like, DAZL)和胰岛素样生长因子2 (insulin like growth factor 2, IGF2)均发生显著的下调表达(P<0.01)。本研究为深入探讨CYP17A1基因对黔北麻羊繁殖性状的影响提供基础资料。

• 鹿茸成骨过程中骨保护素作用机制的研究

  邢宝瑞, 刘振, 赵海平, 李光玉, 孙红梅, 李勋胜, 周珏, 姚程杰, 马泽芳

  骨保护素(osteoprotegerin, OPG)在调控骨发育和动态平衡中发挥着关键作用。本研究旨在探索梅花鹿(Cervus nippon)外周血OPG水平变化与鹿茸成骨的相关性,以及OPG在鹿茸间充质干细胞(reserve mesenchyme cells, RMCs)成骨过程中的可能机制。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和免疫组化检测梅花鹿外周血和鹿茸尖部OPG水平变化,通过对鹿茸RMCs成骨诱导,使用qRT-PCR和Western blot方法检测OPG在RMCs成骨过程中的表达水平。结果显示,梅花鹿外周血OPG水平于5月起递增,8月达到顶峰,12月达全年最低水平,并一直维持到第二年5月;OPG蛋白表达于RMCs的细胞膜和细胞质,在鹿茸尖端自上而下表达量递增并广泛表达于血管壁和骨腔隙周围;加入成骨诱导液,RMCs中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性3 d起开始升高;诱导至21 d,RMCs被诱导为成骨细胞,并出现红染的钙结节;在成骨诱导过程中RUNX家族转录因子2 (RUNX family transcription factor 2, RUNX2)、Sp7转录因子(Sp7 transcription factor, Sp7)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine, SPARC)、BGN (Biglycan)、肿瘤坏死因子受体超家族成员11a (TNF receptor superfamily member 11a, RANK)基因表达水平均显著上调(P<0.05),OPG/RANKL (TNF superfamily member 11)比值逆转;OPG蛋白水平在成骨过程中呈上升趋势。综上,梅花鹿外周血OPG水平与鹿茸的成骨过程呈正相关,鹿茸尖部表达的OPG蛋白可能通过OPG/RANKL比值的逆转,调节RMCs分化来促进成骨。本研究为鹿茸成骨机制研究提供新见解,为人类(Homo sapiens)骨质疏松的治疗提供新思路。

• 褐飞虱核糖体结合蛋白Ⅱ基因的功能分析

  王赛男, 张传溪, 鲁嘉宝

  核糖体结合蛋白Ⅱ (ribophorin Ⅱ, RⅡ)是寡糖转移酶的一个重要亚基,研究表明RⅡ在人体中与癌症发生相关,但目前对RⅡ在昆虫中的功能研究还较少。本研究在水稻(Oryza sativa)害虫褐飞虱(Nilaparvata lugens, BPH)中鉴定到1个RⅡ编码基因NlRⅡ (GenBank No. XP_022202517.1)。为探究该基因在褐飞虱中的功能,首先利用转录组数据获得NlRⅡ的时序表达模式,结果表明,NlRⅡ随昆虫蜕皮呈现周期性的变化,并且在每龄中期表达量达到高峰。利用qRT-PCR技术分析NlRⅡ在褐飞虱中的组织表达模式,结果显示,NlRⅡ在卵巢中的表达量最高。通过RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术发现,在二龄褐飞虱中沉默NlRⅡ后,对褐飞虱本身的存活没有显著影响;但在五龄褐飞虱中沉默NlRⅡ,结果导致雌成虫腹部膨胀,卵巢发育畸形,几乎无法产卵;雄成虫精巢侧输精管明显缢缩,与其交配的野生型雌成虫产卵量和卵的孵化率均极显著下降(P<0.01)。本研究表明NlRⅡ会影响褐飞虱的繁殖,此结果为基于RNAi技术防治褐飞虱提供了潜在的新靶标基因。

• 水体外源钙补充对罗氏沼虾蜕皮周期的影响

  都婷婷, 丁丽, 潘玺方, 唐琼英, 夏正龙, 杨国梁, 易少奎

  钙离子在甲壳动物蜕皮通路中发挥着重要作用,也是甲壳动物蜕皮后期新表皮矿化过程中的必需元素。为探究水体中外源钙的补充对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)蜕皮周期的影响,本研究开展了水体钙离子浓度25 (对照组)、85、145和205 mg/L的养殖实验,统计了不同水体钙离子浓度下罗氏沼虾蜕皮率,测定了罗氏沼虾蜕皮周期内血淋巴组织钙离子浓度变化,并通过扫描电镜分析了“补钙”对罗氏沼虾钙吸收与外骨骼矿化的影响。同时,获得了罗氏沼虾蜕皮通路中钙调蛋白(calmodulin, MrCaM, GenBank No. OQ411017)和钙网蛋白(calreticulin, MrCRT, GenBank No. OQ411018)基因CDS全长序列,通过qPCR分析了MrCaM和MrCRT基因在罗氏沼虾蜕皮各个阶段的表达情况。结果表明,罗氏沼虾在145 mg/L实验组的蜕皮率最高,当钙离子浓度为205 mg/L时蜕皮率显著低于对照组(25 mg/L)(P<0.05)。在不同的蜕皮时期,罗氏沼虾血淋巴钙离子含量随着水体钙浓度的增加呈现先上升后下降的趋势,均在145 mg/L实验组达到最大值,随后下降。扫描电镜结果表明,水体外源钙补充对蜕皮后期的外骨骼矿化具有促进作用。qPCR结果显示,MrCaM和MrCRT基因在不同的蜕皮阶段均在145 mg/L实验组表达量最高(P<0.05),205 mg/L实验组显著低于145 mg/L实验组(P<0.05)。不同蜕皮时期MrCaM和MrCRT基因与血淋巴钙离子含量的相关性分析结果表明,MrCaM在蜕皮期(E期)与其呈强相关性(r=0.8854),MrCRT基因在不同蜕皮时期都与血淋巴钙离子含量呈极显著相关(P<0.01)。综上所述,水体中的Ca2+浓度在适宜范围内增加,可促进罗氏沼虾的蜕皮和外骨骼矿化。本研究为罗氏沼虾高密度养殖池塘水体的“补钙”提供了科学依据。

• 猪圆环病毒2d型Cap蛋白猪源化抗体的表达

  吴昊, 刘星雨, 甘诗琪, 周小杰, 周莹珊, 宋厚辉, 周兴东, 王晓杜

  猪圆环病毒2d型(Porcine circovirus type 2d, PCV2d)是猪圆环病毒的一个主流亚型,是引起断奶仔猪(Sus scrofa)多系统衰竭综合征等猪免疫抑制相关疾病的重要病原,严重危害着我国养猪业的健康发展。目前报道的PCV2d中和表位均位于衣壳蛋白(capsid protein, Cap)上,Cap是产生中和抗体的关键蛋白,其中和抗体能够与病毒结合,从而阻止PCV2d的感染。本研究首先通过原核表达、纯化获得PCV2d Cap重组蛋白,并免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),筛选得到了2株鼠源抗PCV2d Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B3和1B4,其中1B3具有中和活性且不与其他病毒发生交叉反应。将1B3抗体可变区基因与猪源恒定区基因嵌合后克隆至真核表达载体中,利用中国仓鼠(Cricetulus griseus)卵巢CHO-S细胞制备1株PCV2d Cap蛋白重组猪源化嵌合抗体r1B3swine稳定表达细胞系。抗体功能验证和Western blot结果显示,r1B3swine与PCV2d病毒结合反应良好,并且不与抗鼠二抗发生交叉反应。综上所述,本研究构建的猪源化抗PCV2d Cap蛋白的单克隆抗体r1B3swine的真核表达体系,为研究PCV2d Cap蛋白的结构、功能及为PCV2研发新的治疗和诊断制剂提供物质基础。

• 柑橘酵母双杂交文库构建及黄龙病菌SDE34的寄主靶标筛选

  胡衍铵, 曾丽华, 李竹, 李凤瑶, 黄玉林, 李瑞民, 黄桂艳

  黄龙病是柑橘产业中最具毁灭性的病害,主要由韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas)引发,其致病机理尚不清楚。Sec依赖型效应蛋白(sec-dependent effectors, SDE34)(CLIBASIA_04055)是黄龙病菌的核心SDE效应蛋白之一,为了筛选黄龙病菌SDE34在柑橘中的寄主靶标,本研究以感染黄龙病的纽荷尔脐橙(Citrus sinensis)叶片为材料构建酵母双杂交(yeast two hybrid, Y2H) cDNA文库,通过Y2H技术筛选与SDE34互作的柑橘蛋白,并利用双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)对其互作进行验证。结果表明,本研究构建的酵母双杂交cDNA文库滴度为2.3×108 CFU/mL,插入片段长度为300~2 000 bp。通过Y2H筛选到3个柑橘蛋白与SDE34互作,其中重金属相关的异戊二烯化植物蛋白(heavy metal-associated isoprenylated plant protein, HIPP7)的筛选频率高达83.33%,BiFC结果表明,HIPP7与SDE34在植物细胞中互作。亚细胞定位结果表明,HIPP7在植物细胞质和细胞核中均有分布。实时荧光定量PCR分析发现,感染黄龙病后,HIPP7基因极其显著下调表达(P<0.001)。HIPP7同源基因在多种植物-病原菌互作体系中作为感病基因发挥功能,提示SDE34可能通过靶向柑橘感病基因HIPP7促进黄龙病菌侵染。本研究为解析黄龙病的致病机理以及柑橘抗病育种提供理论依据。

• 过表达天麻GS1基因促进蜜环菌在低温条件下的生长

  陈必连, 周春艳, 蔡金龙, 胥鹏, 徐慧妮, 李昆志

  天麻(Gastrodia elata)是中国传统大宗药材,是一种药食兼用植物。天麻无根无叶,只能通过消化侵染的蜜环菌(Armillaria mellea)获取营养。氮素营养是天麻和蜜环菌生长所必需的,谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)在氮素代谢方面起着重要作用。天麻自然生长周期长,常受到冬天和早春低温胁迫。研究表明,过表达细胞质GS1基因能提高植物氮素利用、植物发育和盐胁迫耐性,但GS1基因对低温胁迫的抗性作用还不清楚。本研究从天麻转录组数据库中筛选到GS1基因5'端CDS序列,通过巢式PCR技术克隆其全长,并构建其过表达载体pH2GW7.0-35s-GS1和原核表达载体pET-32a-GS1。pET-32a-GS1转化大肠杆菌(Escherichia coli) Bl21进行蛋白表达纯化获得GS1酶蛋白。该酶的最适pH为4,最适温度为50 ℃。低浓度5 mmol/L Ca2+、Mg2+和K+条件下对GS1酶活性有促进作用,9 mmol/L高浓度金属离子对GS1酶活性有抑制作用。过表达GS1蜜环菌与野生蜜环菌相比,在低温13 ℃条件下能显著提高与谷氨酸和谷胱甘肽合成有关的GS、谷氨酸合成酶(glutamate synthase, GoGAT)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)基因表达水平,提高脯氨酸、谷胱甘肽和可溶性糖含量,降低H2O2和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,明显促进蜜环菌生长。研究结果表明,过表达天麻GS1基因能够提高蜜环菌在低温条件下的生长能力,本研究为进一步提高天麻产量提供了参考。

• 解淀粉芽胞杆菌M1-1鉴定及其抑菌和植物促生作用

  王世伟, 王卿惠

  白酒大曲蕴含着丰富的微生物,其中解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)可抑制植物的病原菌,应用于生防,促进植物生长,在农业生产上具有潜在的应用价值。本研究从北大仓白酒大曲中,利用LB培养基分离,并采用菌落、菌体观察、芽孢染色和16S rRNA基因测序和比对技术,对一株解淀粉芽胞杆菌进行形态和分子生物学鉴定;该菌与解淀粉芽胞杆菌(GenBank No. MG593943.1)最为相似,一致性为100%,覆盖率为95%,属于解淀粉芽胞杆菌,命名为M1-1,提交NCBI网,获得GenBank No. OM321552。分别采用平板对峙和牛津杯法研究该菌菌体及其抑菌蛋白对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) M1、苹果果腐病菌(Phacidiopycnis washingtonensis)、赤霉菌(Gibberella)和水稻立枯菌(Rhizoctonia solani)的抑制作用。结果表明,解淀粉芽胞杆菌M1-1发酵液对上述4种植物病原菌均具有较强抑菌作用,抑菌率在43%~61%之间;该菌除能产生蛋白酶以外,还能产生多种抑菌蛋白,对尖孢镰刀菌M1抑菌圈直径的大小在1.8~3.0 cm之间;采用盆栽实验法研究解淀粉芽胞杆菌M1-1对落地生根(Bryophyllum pinnatum)的促生作用,结果表明,该菌对落地生根的生长具有明显的促进作用。综上,解淀粉芽胞杆菌M1-1对多种植物病原菌都具有较好的抑制作用,可应用于生防制剂的开发利用;同时对增加农作物产量具有潜在的应用价值。

• 枣组学研究进展和展望

  李斌, 韩露, 张书峰, 刘孟军, 杨猛

  组学研究是当前果树研究的前沿热点。通过基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等多组学联合研究,可深入揭示果树的起源和驯化、快速阐明重要性状的形成机制、高效挖掘重要功能基因和分子标记、以及科学指导分子育种和生长发育调控等工作。枣(Ziziphus jujuba)是我国原产特色优势果树和较早完成全基因组de novo测序的果树之一。自2014年枣基因组发表以来,枣组学研究蓬勃发展,取得了重要进展。本文系统总结了目前枣组学研究主要涉及的基因组、转录组、和代谢组等相关研究工作,并在此基础上提出了枣组学研究的发展方向和重点任务,为以组学为基础的枣的育种及重要性状形成原因的深入挖掘提供借鉴。

• 白背飞虱传播南方水稻黑条矮缩病毒的研究进展

  陈思齐, 谭银银, 曾铭, 吴建祥, 刘隽怡

  南方水稻黑条矮缩病是由南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)引起的亚洲重要水稻(Oryza sativa)病毒病,其由典型长距离迁飞昆虫白背飞虱(Sogatella furcifera)传播,目前在我国南方稻区发生流行并严重危害水稻。至今,对于南方水稻黑条矮缩病毒基因组结构和功能、流行史和传播规律,及其与水稻、白背飞虱间的互作机制的研究已取得了一些突破性的进展。本文综述了该病毒的危害症状、地理分布、基因组结构与功能,重点综述了白背飞虱传播南方水稻黑条矮缩病毒的生物学过程及南方水稻黑条矮缩病毒与白背飞虱间的互作,并提出了深入研究该病害的可能方向,以期为该病毒及同科其他病毒的后续研究与防治提供参考。

• 永生化猪乳腺上皮细胞系的建立

  曹家铭, 阚尧, 李志远, 钟友刚, 李秋艳

  猪乳腺上皮细胞(porcine mammary epithelial cells, PMECs)在体外培养条件下依然具有高度分化的特性,可以维持其特有的形态特征及合成和分泌乳蛋白的功能。因此,建立可以维持猪乳腺上皮细胞特性的稳定的永生化细胞系对猪乳腺发育、分化及泌乳机制研究有着重要意义。本研究采用组织块培养法和酶消化法分离纯化妊娠末期母猪(Sus scrofa)乳腺上皮细胞,并对细胞培养方法进行优化。将人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)电转染导入原代培养的猪乳腺上皮细胞,通过PCR检测获得永生化猪乳腺上皮细胞系hTERT-PMECs。对连续传代培养60代的hTERT-PMECs进行细胞形态学观察,初步证明永生化后细胞类型没有发生改变;免疫荧光细胞染色结果表明,hTERT-PMECs可表达角蛋白;经催乳素、氢化可的松和胰岛素-转铁蛋白-硒(Insulin-Transferrin-Selenium,ITS)的诱导,反转录-PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)鉴定结果显示,hTERT-PMECs仍具有分泌乳蛋白的功能。综上所述,本研究成功获得了永生化的猪乳腺上皮细胞系hTERT-PMECs,且永生化细胞维持了与原代细胞相同的特性。本研究为猪乳腺发育以及泌乳机制的研究提供了基础资料。

• 基于农杆菌真空渗透法的菊花瞬时表达系统的优化

  俞瑶, 程华, 陈素梅, 陈发棣, 蒋甲福

  菊花(Chrysanthemum morifolium)多是六倍体,遗传背景复杂,稳定遗传转化效率低。本研究旨在优化菊花中的瞬时表达系统,提高瞬转效率、目的基因表达活性,为开展菊花相关基因的功能研究提供有效手段。利用真空渗透法对'神马' ('Jinba')菊花插穗进行瞬时转化,通过选择不同种类的悬浮液、不同悬浮液pH、是否添加乙酰丁香酮、不同悬浮终浓度、农杆菌(Agrobacterium)菌液暗培养时间以及植物暗培养温度6个方面进行研究,对所得侵染效率进行统计分析,同时通过测定分析荧光素酶(luciferase, LUC)平均荧光强度进一步判断表达效率,探索这6种条件对菊花瞬时转化效率及目标基因表达活性的影响程度。结果表明,侵染菊花时,2-(N-吗啡啉)乙磺酸(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate, MES)缓冲液为最适宜的悬浮液;且悬浮液pH=6.0时,荧光值表达水平最高;其次,加入乙酰丁香酮(100 μmol/L)能够提高瞬时侵染的转化效率和荧光值的表达水平;当悬浮菌液的OD600值为1.8时,荧光值表达量显著上升(P<0.05);菌液悬浮后置于28 ℃暗培养4 h更有利于荧光值的表达;另外,10 ℃低温暗培养植物时侵染效率和荧光值表达量均有所提升。本研究通过更改悬浮液的成分、悬浮菌液的浓度、悬浮菌液和瞬时转化后植株的培养条件显著提高了菊花荧光值表达量,在较短的实验周期内做到了有效的瞬时表达,可为菊花基因功能研究提供有效手段。

• 弓形虫半巢式PCR实时荧光检测方法的建立

  陈梦陶, 朱龙佼, 刘海燕, 许文涛

  弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种全世界分布的人畜共患寄生虫,在猪(Sus scrofa)和小型家畜中的慢性感染率较高,能够经食源性传播感染人类,对免疫功能较弱的个体会造成极大的危害。本研究根据GenBank公布的弓形虫529 bp基因序列(DQ779191.1)设计了一组特异性引物,基于SYBR GreenⅠ染料建立了半巢式PCR实时荧光法对弓形虫进行检测。第一轮扩增利用外引物扩增弓形虫529 bp重复序列,第二轮则结合SYBR GreenⅠ染料利用内引物对529 bp基因片段进行实时荧光扩增,其最终产物片段长度为260 bp。在优化后的最佳反应条件下,该方法的检测限为18.4 fg/μL,灵敏度较高;与细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、猪肉绦虫(Taenia solium)基因组均无交叉反应,特异性较强。因此,本研究成功建立了灵敏度高、特异性强的半巢式PCR实时荧光检测方法,为监测家畜及肉类食品中弓形虫感染情况提供了有效的技术手段。

• 梅花花色合成基因的qPCR内参基因筛选及验证

  叶勇, Henry Lusekelo INGWE, 郑子飞, 陈樱之, 赵宏波, 董彬

  梅花(Prunus mume)是中国十大传统名花之一,园林应用广泛。随着梅花分子生物学研究的不断深入,筛选出适用于梅花花色合成基因qPCR分析的内参基因至关重要。本研究选择3个不同色系的共计6个梅花栽培品种,进行花色表型分析和花青素含量测定,发现花青素含量与梅花花瓣的颜色呈正相关。同时,利用qPCR技术,在梅花不同色系品种间对14个候选内参基因的表达进行检测,使用3种软件geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt方法进行表达稳定性分析,最后用RefFinder程序综合分析,得出最佳内参基因,并利用花青素合成相关基因进行验证。实验结果表明,3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)和肌动蛋白1 (actin 1, ACT1)表达最为稳定,ACT3表达最不稳定。验证结果表明,以GAPDH和ACT1为内参基因时,花青素合成相关基因的表达模式相近,较多基因呈现显著的差异表达;当以ACT3作为内参基因时,花青素合成相关基因的表达模式与GAPDH和ACT1为内参基因的结果不同,而且只有少数基因呈现显著的差异表达。本研究为深入开展梅花花色合成相关基因的表达模式分析提供基础资料。