农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2024年第8期

• 蝴蝶兰DREB基因家族鉴定及非生物胁迫表达分析

  胡子昂, 罗平, 辛静静, 崔永一

  脱水响应元件结合蛋白(dehydration responsive element binding, DREB)基因家族在植物响应低温、干旱和高盐等非生物胁迫过程中发挥重要作用,目前对蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.) DREB基因家族的相关研究报道较少。本研究基于阿婆蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)基因组数据库,开展了蝴蝶兰DREB家族成员的全基因组鉴定、进化关系分析、生物信息学分析、亚细胞定位和在低温、干旱、高盐3种非生物胁迫及脱落酸(abscisic acid, ABA)处理下的基因表达模式分析。结果显示,在阿婆蝴蝶兰基因组数据库中共鉴定得到了31个DREB家族成员,分为A1~A6共6个亚组;保守基序分析表明,所有PaDREB转录因子均含有1个AP2保守结构域。阿婆蝴蝶兰转录组表达模式分析结果显示,不同PaDREBs呈现组织差异性表达,且多数基因在根部高表达。分离A1亚组4个成员,将其分别命名为：PaDREB1A、PaDREB1B、PaDREB1C和PaDREB1D,亚细胞定位结果表明,其均定位于细胞核。PaDREB1A~PaDREB1D的表达模式分析结果表明,PaDREB1A主要响应干旱、高盐和ABA处理;PaDREB1B主要响应低温和高盐处理;PaDREB1C主要响应干旱和ABA处理;PaDREB1D主要响应低温、干旱和ABA处理。上述结果提示,蝴蝶兰DREB家族在响应非生物胁迫通路中具有重要作用,本研究为后续研究蝴蝶兰DREB家族响应非生物胁迫的作用机理提供理论依据。

• 水稻TFⅡB相关因子OsBRF1的功能探析

  陈歆惠, 陈广娜, 宁鹤, 陈家洛, 王思怡, 朱诚, 杨素

  在大多数真核细胞中,TFⅡB (transcription factorⅡB)是DNA转录合成RNA过程中RNA聚合酶Ⅱ的通用转录因子。TFⅡB相关因子(TFⅡB-related factor 1, BRF1)是RNA聚合酶Ⅲ的通用转录因子,负责合成tRNA和5S rRNA。拟南芥(Arabidopsis thaliana)中AtBRF1和AtBRF2以功能冗余的方式参与生殖生长。作为重要粮食作物及单子叶模式植物,水稻(Oryza sativa)中BRF1基因的功能尚未见报道。本研究构建了OsBRF1基因启动子驱动的β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase, GUS)表达载体,GUS染色结果显示,OsBRF1在根、叶、叶鞘、柱头、成熟根、成熟叶、圆锥花序、花粉、胚乳和花药中均有较高表达,在颖壳中不表达。将OsBRF1与GFP的融合表达载体经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转入本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片,发现OsBRF1蛋白主要定位于细胞核。利用CRISPR/Cas9基因编辑手段无法获得纯合移码突变植株,表明OsBRF1基因纯合致死;进一步利用RNAi植株进行表型观察,发现OsBRF1的RNAi植株花粉活性和结实率显著下降(P<0.05),表明该基因可能通过调控花粉活性而影响水稻结实率。酵母双杂交和双分子荧光互补结果显示,OsBRF1与OsTBP1~3 (TBP: TATA结合蛋白, TATA-binding protein)存在蛋白互作,表明其可能仍然作为通用转录因子行使重要功能。本研究为深入探究OsBRF1基因功能及调控机制提供基础资料。

• 谷子KNOX基因家族鉴定及组织表达模式分析

  施卫萍, 张欣, 赵媛, 刘敏, 代渴丽, 张艾英, 郭二虎, 史关燕, 郭杰

  KNOX (knotted1-like homeobox, KNOX)是植物特有的一类具有同源异型结构域的转录因子,广泛参与植物的生长发育过程。为探究谷子(Setaria italica) KONXs基因的潜在功能,本研究采用生物信息学方法,在谷子全基因组水平对SiKNOX基因家族进行了鉴定和分析,并利用RT-qPCR检测其在不同组织中的表达量。结果显示,在谷子全基因组水平上一共鉴定到11个SiKNOXs基因,系统进化分析分为classⅠ和classⅡ两组,classⅠ包含5个SiKNOXs,classⅡ包含6个SiKNOXs。亚细胞定位预测发现所有SiKNOXs蛋白均定位在细胞核。染色体定位分析发现,11个SiKNOXs基因不均等地分布在谷子的7条染色体上。基因复制分析发现,有5个SiKNOXs基因组成了4个片段复制基因对。基因结构组成分析发现,所有的SiKNOXs由5~6个外显子组成;蛋白保守结构域分析结果显示,SiKNOXs的蛋白保守结构域由10个基序组成,其中motif 2、3、5、6分别构成了KNOX1、KNOX2、ELK、HD结构域。在SiKNOXs基因的启动子区域分布着许多与生物过程密切相关的顺式作用元件。SiKNOXs基因在谷子不同组织部位(包括根, 茎, 叶, 穗, 种子)均能检测到,且大部分SiKNOXs基因具有组织特异性表达特点。本研究为深入探讨KNOX基因家族调控谷子生长发育的功能提供了基础资料。

• 甜瓜CmWRKY7基因的克隆与表达分析

  李嘉琪, 张利超, 赵望龙, 陈春林, 王吉庆, 李猛, 肖怀娟

  WRKY转录因子在植物响应生物和非生物胁迫中起着至关重要的作用。基于甜瓜(Cucumis melo)前期转录组测序得到1个强烈响应低温诱导的候选WRKY基因—CmWRKY7,本研究进一步解析其生物学信息及其在抵御非生物胁迫中的生物学功能,对CmWRKY7进行了克隆,采用生物信息学手段分析了其编码蛋白的分子特征,通过qRT-PCR检测了其在不同处理(低温, 干旱, 盐和ABA)下的表达模式。结果表明,CmWRKY7基因编码区全长732 bp,编码243个氨基酸,预测分子量为27.09 kD,理论等电点为9.50;属于亲水蛋白,脂肪族氨基酸指数为64.20,热稳定性较高。CmWRKY7蛋白序列中包含2 个高度保守的结构域：WRKYGKK和C2H2型锌指结构序列C-X4-C-X23-H-X-H,同时CmWRKY7蛋白中还包含26个可能的磷酸化修饰的位点,7个蛋白激酶C磷酸化位点,4个N-肉豆蔻酰化作用位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点。该蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占比62.14%。系统进化分析显示,CmWRKY7与黄瓜(C. sativus)、刺角瓜(C. metuliferus)的蛋白进化关系最近。启动子预测分析表明,CmWRKY7启动子上存在多种激素和胁迫相关的顺式作用元件,蛋白互作预测分析表明,CmWRKY7多与胁迫相关蛋白存在互作关系。在非生物胁迫下,CmWRKY7基因参与ABA信号转导,积极应答干旱、高盐和低温胁迫,表明其在甜瓜抵御不利环境的过程中发挥积极作用。本研究结果为进一步研究CmWRKY7基因的生物学功能及其在甜瓜抗性育种中的应用提供理论基础。

• '老秋枣' ZjABR1基因克隆及功能验证

  张鹏飞, 仇力平, 晁瑞强, 崔文静, 梁晋军, 温鹏飞

  AP2/ERF家族广泛参与植物生长发育、激素响应等过程,能够影响果实质地的变化。为了探究AP2/ERF家族成员ABR1 (abscisic acid repressor 1)在枣(Ziziphus jujuba)果实成熟过程中的表达模式和功能,本研究以'老秋枣' (Ziziphus jujuba cv. 'Laoqiu zao')为材料,克隆了ZjABR1 (LOC107409847)基因,并进行了生物信息学分析、亚细胞定位分析、表达分析,以及构建过表达载体进行瞬时转化和酵母单杂交实验。结果表明,'老秋枣' ZjABR1基因CDS区全长1 344 bp,编码447个氨基酸,含有1个AP2结合域。亚细胞定位显示,ZjABR1蛋白定位于细胞核。RT-qPCR分析发现,ZjABR1在完熟期枣果实中表达量最高。ZjABR1瞬时过表达增强了多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)活性和ZjPG表达。酵母单杂交实验证明,ZjABR1能够直接与ZjPG启动子结合。本研究为进一步阐明枣果实成熟的分子机制提供参考依据。

• 大葱MAX1基因克隆及其对高温胁迫的响应

  张宇辰, 柏咪凤, 徐欢欢, 邢嘉怡, 周旭阳, 刘乐承, 王永勤

  MAX1 (more axillary growth 1)是独脚金内酯合成途径中的关键基因,在大葱(Allium fistulosum)分蘖调节和抵御逆境胁迫中发挥重作用。本研究从大葱中克隆了AfMAX1基因(GenBank No. AfisC2G04224),并进行生物信息学分析、亚细胞定位、组织表达模式和高温胁迫响应分析。结果显示,AfMAX1的CDS长度为1 545 bp,编码514个氨基酸,蛋白分子量为58.55 kD,为亲水性蛋白,无信号肽与跨膜结构域;蛋白序列比较分析显示,MAX1在多个物种中具有保守性;亚细胞定位结果显示,AfMAX1定位于本氏烟草(Nicotiana benthamiana)原生质体的细胞质和细胞核;表达模式分析显示,AfMAX1在大葱叶鞘中表达量最高,根中次之;AfMAX1基因表达量在高温胁迫12 h后显著增加(P<0.01)。上述结果表明AfMAX1能够对高温胁迫进行响应,可能有助于增强植株分蘖调控及耐热性。本研究为深入探讨大葱株型调控和非生物胁迫抵抗的分子机制提供基础资料。

• NtCPS2基因通过调控赤霉素合成影响烟草腺毛发生

  曹可心, 杨惠娟, 刘化冰, 吴健, 陈小翔, 徐世晓

  烟草(Nicotiana tabacum)叶面腺毛的生长发育与烟叶的香气品质有关。为探讨柯巴基焦磷酸合酶(Ent-copalyl diphosphate synthase 2, NtCPS2)与烟草腺毛生长发育及腺毛分泌物合成的关系,本研究使用'8306'的野生型品系(WT)、NtCPS2纯合编辑系(KD)和过表达株系(OE)为材料,对3种株系的烟草进行腺毛表型观察、腺毛密度统计、叶面分泌物西伯三烯二醇含量测定及其关键合成基因表达量进行分析。结果表明,与WT相比,KD株系的叶片分泌型腺毛密度增加75%左右,叶面腺毛分泌物显著增多(P<0.05),OE株系的叶面腺毛分泌物显著低于WT株系(P<0.05),较WT减少50%左右。负调控腺毛基因B2-型细胞周期蛋白(cyclin B2, NtCycB2)基因表达量在KD株系中显著低于WT株系(P<0.05),OE与KD株系呈现相反趋势,NtCycB2基因表达量与腺毛表型呈相反趋势。KD烟株赤霉素含量显著高于WT株系(P<0.05);OE烟株赤霉素含量显著低于WT株系(P<0.05)。KD株系赤霉素含量升高,分泌型腺毛密度增多,叶面主要腺毛分泌物西柏烷类物质含量增多;OE株系与KD株系呈相反趋势。综上结果表明,NtCPS2基因可能通过正向调控赤霉素生物合成,促进烟草分泌性腺毛密度增多,促进叶面腺毛分泌物分泌。本研究为NtCPS2基因通过赤霉素途径调控烟草腺毛及烟草香气物质的合成提供了新的研究方向。

• 巨桉C2H2锌指蛋白基因家族EgrZFP-EARs鉴定及其在非生物逆境下的表达模式分析

  俞键烽, 洪家都, 赵爽, 李笑眉, 温丹丹, 程龙军

  桉树(Eucalyptus spp.)是我国南方栽培的重要速生用材树种,但其抗逆性较差。含有乙烯响应元件结合因子相关两亲抑制(ethylene-responsive element binding factor-associated amphiphilic repression, EAR)基序的锌指蛋白(zinc finger protein, ZPF)转录因子成员被证明广泛参与植物对低温、高温、干旱和高盐等非生物逆境响应。本研究在全基因组范围内鉴定巨桉(Eucalyptus grandis) C2H2型ZFP的基础上,进一步分析含有EAR基序的EgrZFP-EAR成员。对这些基因的进化关系,所含EAR基序类型、数量,染色体定位和基因复制情况,以及基因、蛋白序列结构,启动子上的顺式作用元件等进行了分析。并利用转录组数据及qRT-PCR分析了EgrZFP-EAR在不同组织及低温(4 ℃)、高温(42 ℃)、干旱、NaCl (300 mmol/L)、ABA (100 μmol/L)和MeJA (100 μmol/L)处理下的表达模式。结果表明,巨桉中共含有118个C2H2型ZFP,其中57个为EgrZFP-EAR成员,包括54个Q-型和3个非Q-型C2H2型ZFP;EgrZFP-EAR中所含EAR基序有3种类型：LxLxL、DLNx(x)P及二者的重叠型。其中含LxLxL类型的EAR基序数量最多,共98个。基因组复制、串联重复及区段重复在这些基因扩张过程中都发挥了作用。EgrZFP-EAR启动子上分布着如逆境响应元件(stress responsive element, STRE)、干旱响应元件(dehydration responsive element, DRE)、干旱诱导的MYB结合位点(MYB-binding site, MBS)和低温响应元件(low temperature responsive element, LTRE)等多种逆境响应元件以及ABA响应元件(ABA-responsive element, ABRE)和MeJA响应元件CGTCA-motif、TGACG-motif等激素响应元件。组织表达模式大致分为4个类型：茎尖和幼叶高表达型、韧皮部高表达型、成熟木质部高表达型以及韧皮部、未成熟和成熟木质部均高表达型。而在4 ℃不同时间(2, 6,12, 24, 48 h)处理的巨桉幼苗叶片中,EgrZFP-EAR基因的表达分为3种类型：持续诱导型、先升后降型和低温抑制型。高温、干旱、NaCl和ABA、MeJA处理的巨桉幼苗叶片中,来自于不同亚类的12个EgrZFP-EAR基因对不同逆境因子也有不同响应。总之,EgrZFP-EAR基因响应逆境的种类和模式有很大差异,表明了其在非生物逆境胁迫下功能的复杂性。本研究结果为进一步揭示桉树的抗逆分子机制,挖掘抗逆基因资源,进行分子辅助育种提供参考。

• 景宁木兰ZF-HD家族全基因组鉴定及其表达模式分析

  朱森宇, 陈小珺, 马晶晶, 任明杰, 王晶晶, 吴超, 田丰, 刘志高, 樊民亮, 申亚梅

  景宁木兰(Magnolia sinostellata)为浙江省特有极小种群,受到冠层遮荫胁迫影响,目前处于濒危状态。锌指同源结构域(zinc finger homeodomain, ZF-HD)是一类在植物发育及生物、非生物胁迫响应过程中发挥重要作用的转录因子。为了明确景宁木兰ZF-HD基因家族在弱光胁迫下的作用机制,本研究利用转录组数据对MsZF-HD家族成员进行鉴定及表达模式解析。基于景宁木兰叶片转录组数据和望春玉兰(M. biondii)基因组数据,本研究鉴定了12个MsZF-HD家族成员,均定位于细胞核,MsZF-HD2b也定位于叶绿体。系统发育分析表明,MsZF-HD家族分为4个亚族,所有成员均含有ZF-HD_dimer结构域,同一亚族成员之间的基序(motif)数量及其类型高度保守。GO分析表明,MsZF-HD家族成员广泛参与景宁木兰的生长发育。组织特异性表达分析表明,大部分MsZF-HD家族成员在景宁木兰叶芽和叶中具有较高表达量,其中MsZF-HD8在茎和叶中均高表达,而MsZF-HD13和MsZF-HD14在花和茎中高表达,说明其参与调控花发育和茎的伸长过程。此外,对遮荫胁迫下MsZF-HDs基因的表达模式进行分析,发现MsZF-HDs对弱光胁迫产生积极响应,其中MsZF-HD1a、MsZF-HD1b、MsZF-HD1c、MsZF-HD2a、MsZF-HD2b以及MsZF-HD14在受到弱光胁迫后显著下调表达(P<0.05);MsZF-HD13在弱光处理21和28 d的基因表达显著上调(P<0.05);MsZF-HD11、MsZF-HD12和MsZF-HD8在弱光处理7 d的基因表达显著上调(P<0.05),之后则呈下调趋势。本研究对景宁木兰ZF-HD家族成员进行了鉴定,并发现其在叶片、茎等组织中对弱光胁迫存在显著表达响应;筛选到MsZF-HD13与MsZF-HD8可能是景宁木兰响应遮荫,协调生殖生长、茎伸长及叶片衰老等过程的关键基因。本研究为解析景宁木兰遮荫响应机制提供理论依据。

• 布莱凯特黑牛大、小睾丸转录组分析及繁殖相关基因筛选

  王秀源, 刘瑞莉, 韩明轩, 张文琦, 陈振鹏, 梅艳芳, 苗秀萍, 肖超柱, 张任政, 董雅娟, 柏学进

  哺乳动物睾丸大小与精液品质及精子数量显著相关,根据成年时期的睾丸大小能够推测雄性繁殖力。为挖掘睾丸大小影响公牛繁殖力的关键候选基因,本研究采集12月龄布莱凯特黑牛(Bos taurus)外周血和睾丸,依据睾丸重量、长径和短径分为大睾丸和小睾丸2组,进行激素测定、睾丸组织学观察和转录组测序,以|log2 Fold Change|≥1和P-value≤0.01为阈值筛选差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),并对其进行基因本体论(Gene Ontology, GO)和KEGG富集分析;使用克隆、qPCR、Western blot和免疫组化方法对候选基因进行检测与定位。结果显示,大睾丸中间质细胞更多,生精小管发育更好;生殖激素睾酮和雌二醇浓度在大睾丸组中显著高于小睾丸组(P<0.05)。转录组结果显示,大、小睾丸中共有1 006个DEGs,在小睾丸中297个基因表达上调,709个基因表达下调。功能分析显示,DEGs富集于cAMP和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路,并在繁殖和发育过程中起作用;共筛选到双特异性蛋白磷酸酶4 (dual specificity phosphatase 4, DUSP4)、70 kD热休克蛋白1样蛋白(heat shock 70 kD protein 1-like, HSPA1L)和丝裂原激活蛋白激酶4 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4, MAP4K4)等9个繁殖相关候选基因。对MAP4K4基因及其蛋白进一步研究发现其在大睾丸中的表达量显著低于在小睾丸中(P<0.05)。免疫组化(immunohistochemistry, IHC)结果发现,MAP4K4蛋白在精子细胞和精母细胞的细胞质中高表达。抑制MAP4K4表达可能促进精母细胞增殖并有利于精子细胞存活。本研究可为深入了解牛睾丸大小与生殖功能的关系提供参考。

• 白藜芦醇对牛精子体外获能效果及早期胚胎发育的影响

  李晓霞, 曹平华, 汪豆豆, 曲培栋, 徐志谦, 禹学礼, 栗颖华

  精子体外获能过程中产生的过量活性氧(reactive oxygen species, ROS)会降低精子质量,进而影响早期胚胎发育。白藜芦醇是一种有效保护精子的抗氧化剂。为探讨白藜芦醇对牛(Bos taurus)精子体外获能效果及早期胚胎发育的影响,本研究将解冻后的荷斯坦牛冻精加入到分别含0、10、50、100和500 μmol/L白藜芦醇的获能液中,经上游法处理1 h后,评估不同浓度白藜芦醇对牛精子活力、顶体完整性、线粒体活性、质膜完整性、获能状态及体外受精后早期胚胎发育能力的影响。结果表明,与对照组(0 μmol/L)相比,在精子获能液中添加50和100 μmol/L白藜芦醇的牛精子活力、顶体完整率、线粒体高膜电位百分率和质膜完整率均显著升高(P<0.05),并显著提高了体外获能后B型精子占比率(P<0.05)。金霉素(chlortetracycline, CTC)荧光染色法与考马斯亮蓝染色法均可评估牛精子顶体完整性,两者之间无显著差异(P>0.05)。体外受精结果表明,与对照组(0 μmol/L)相比,获能液添加100 μmol/L白藜芦醇能显著提高体外受精后的卵裂率和囊胚率(P<0.05)。综上表明,在获能液中添加100 μmol/L白藜芦醇能显著改善牛精子功能,提高其获能率,使体外受精后的卵裂率和囊胚率显著提升。本研究有助于优化体外受精体系,加速体外胚胎生产效率。

• MST1和LATS1在牦牛黄体形成、维持和退化中的表达及HCG对其表达的影响

  周应聪, 张同享, 王靖雷, 赵凌, 张瑞, 姚颖, 钱文洁, 崔燕, 余四九, 樊江峰

  哺乳动物STe20样激酶1 (mammalian STE20-like kinase 1, MST1)和大肿瘤抑制蛋白1 (large tumor suppressor kinase 1, LATS1)是Hippo通路核心激酶级联反应链的关键成员,参与雌性动物生殖过程并发挥重要作用。为探究MST1和LATS1与牦牛(Bos grunniens)黄体(corpus luteum, CL)形成、维持和退化之间的关系。本研究采集雌性牦牛黄体组织,按照黄体形成(红体期和有腔黄体期)、维持(妊娠黄体期)和退化(退化黄体期)的不同阶段将材料分为4组,通过qPCR和Western blot检测MST1和LATS1 mRNA及蛋白在黄体形成、维持和退化中的表达差异性,运用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)对MST1和LATS1在黄体形成、维持和退化中进行定位分析。另外,分离培养牦牛卵巢颗粒细胞(granule cells, GC),通过添加人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)诱导颗粒细胞黄体化,采用qPCR、Western blot和免疫荧光(immunofluorescence, IF)等方法对MST1和LATS1 mRNA及蛋白在颗粒细胞黄体化前后进行定量和定位分析。结果显示,MST1和LATS1 mRNA及蛋白在牦牛黄体不同发育阶段表达量存在差异,在妊娠黄体期MST1表达量最高,而LATS1在有腔黄体期的表达最为丰富,在退化黄体期MST1和LATS1表达量均最低。IHC结果显示,在牦牛粒性黄体细胞中MST1和LATS1分布广泛,且MST1在血管内皮细胞中特征表达。添加5 IU/mL HCG诱导颗粒细胞黄体化后,MST1和LATS1 mRNA及蛋白的表达量极显著上升。通过IF染色发现,MST1和LATS1蛋白主要定位于颗粒细胞细胞质,且黄体化前后位置没有改变。研究结果表明,MST1和LATS1介导Hippo信号通路通过控制颗粒细胞分化,黄体细胞增殖和凋亡,参与雌性牦牛黄体组织的形成、维持、退化以及功能运转,并且与黄体生理过程中各类生殖激素密切相关。本研究为进一步探索Hippo信号通路对牦牛黄体组织大小调控以及调节哺乳动物生殖生理过程的作用机制提供了基础资料。

• 敲低JAK2基因表达对猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响

  罗杰, 杨酸, 毛同辉, 杨棋, 张依裕

  Janus激酶2 (Janus kinase, JAK2)是一种激素受体偶联激酶,参与母牛(Bos taurus)乳腺上皮细胞增殖、分化、凋亡等过程,而其调控猪(Sus scrofa)乳腺上皮细胞的增殖或凋亡机制尚不清楚。为探究RNA干扰JAK2基因表达对猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响,本研究根据JAK2基因序列设计并合成4对shRNA (short hairpin RNA)干扰序列和1对阴性对照序列,构建shRNA表达载体并将其转染至猪乳腺上皮细胞中,筛选干扰效果最佳的载体,采用串联质谱标记(tandem mass tags, TMT)定量蛋白质组学技术进行蛋白组测序并筛选差异蛋白,分别采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒、流式细胞术、qRT-PCR检测细胞增殖、凋亡、周期及相关基因的mRNA表达水平。结果显示,共筛选到差异表达蛋白699个,其中上调蛋白309个,下调蛋白390个。GO富集分析表明,差异蛋白主要富集在多肽生物合成过程和酰胺生物合成过程,以及碳水化合物衍生物结合、核糖体的结构组成等分子功能方面;KEGG富集分析可知,差异蛋白主要富集在核糖体、补体系统和丙型肝炎信号通路。干扰JAK2后,细胞增殖能力相较于对照组在不同时间节点均显著降低(P<0.05),在72 h时的OD450值极显著降低(P<0.01),细胞凋亡率(24.0%±3.82%)显著低于对照组(33.2%±2.55%)(P<0.05),且诱导细胞周期G1/S期阻滞;IFIT1 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1)、ISG15 (interferon-stimulated gene 15)、GRB2 (growth factor receptor-bound protein 2)和RACK1 (receptor for activated C kinase 1)基因表达水平在沉默JAK2后极显著低于对照组(P<0.01),RSAD2 (radical S-adenosyl methionine domain containing 2)基因在沉默JAK2后极显著高于对照组(P<0.01)。综上,沉默JAK2可诱导猪乳腺上皮细胞周期G1/S期阻滞,从而抑制细胞增殖,并抑制细胞凋亡,B6E241蛋白(对应基因GRB2)可作为今后研究乳腺上皮细胞增殖相关的关键蛋白。本研究为深入探讨母猪乳腺发育和泌乳调控机制提供了基础资料。

• 基于SNP芯片检测皖南花猪保种群遗传结构

  王静琳, 吴旭东, 何志兵, 刘阳光, 王小芬, 丁月云, 郑先瑞, 张晓东, 殷宗俊

  皖南花猪(Sus scrofa domesticus)是安徽省乃至中国不可或缺的宝贵猪种资源,研究皖南花猪保种群体的遗传多样性、亲缘关系和家系结构,对揭示皖南花猪目前的群体状况至关重要。本研究基于“中芯一号”芯片(Chinese Chip-1 BeadChip)检测32头皖南花猪的全基因组SNP位点,利用PLINK软件进行观察杂合度(observed heterozygosity, Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity, He)和多态信息含量(polymorphic information content, PIC)的计算及连续性纯合片段(runs of homozygosity, ROH)的检测,分析皖南花猪群体的遗传多样性。通过GCTA软件构建G矩阵,解析皖南花猪群体的亲缘关系;MEGA X软件构建群体进化树,分析皖南花猪群体的家系结构。结果显示,32头皖南花猪共检测到42 662个SNPs位点,满足质控条件的SNP位点有21 317个;群体多态性标记比例(polymorphism marker ratio, PN)为0.500,有效群体含量(effective population size, Ne)为3,群体He为0.348,Ho为0.372,平均亲缘系数为0.11。G矩阵的结果显示,大多数皖南花猪之间存在中等程度的亲缘关系。ROH片段共有884个,ROH平均长度为(12.35±2.17) Mb,个体ROH平均长度为(341.19±139.58) Mb;基于ROH的平均近交系数为0.139±0.056,保种群的近交程度较低;聚类分析结果表明,皖南花猪公猪来源于5个血统。综上所述,皖南花猪保种群群体有效含量偏低,遗传多样性中等,近交程度中等,可能含有少量外来血缘。本研究为皖南花猪遗传资源的保护及利用提供科学依据。

• 异育银鲫'中科5号'产消化酶益生菌的筛选、鉴定及生物学特性研究

  于鹏, 马晶晶, 成钰, 张成硕, 王凯, 周正海

  鱼类对饲料的低消化吸收率是造成饲料成本高昂、养殖利润低下的重要原因。异育银鲫(Carassius auratus gibelio)是我国当前最主要的鲫鱼养殖品种,本研究旨在从异育银鲫'中科5号' (CASⅤ)健康养殖体系中筛选出安全高效的产消化酶益生菌,从而改善“中科5号”对饲料的消化吸收能力,降低饲料成本。采用点种法从'中科5号'幼体及养殖水体中分离筛选出10株具有蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的菌株。对该10株菌的产酶能力进一步分析,并综合安全性(溶血性, 药敏性和腹腔注射感染)试验结果,获得2株高效、无溶血性、对多数抗生素敏感且无致病性的菌株ZKW7和ZKF17。经16S rDNA序列分析,该2株菌均与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和耐盐芽胞杆菌(B. halotolerans)具有最高的相似性。生物学特性分析结果显示,菌株ZKW7和ZKF17对氨氮(NH4+)、亚硝酸氮(NO2-)和硝酸氮(NO3-)具有较强的降解活性;2株菌生长规律相似,6~16 h为对数生长期,菌株ZKW7的最适生长pH、盐度和金属离子分别是8、15和Fe2+,而菌株ZKF17在pH 7、盐度10~30以及Mg2+存在的条件下生长最好;此外,该2株菌均具有一定的耐酸性、耐胆盐、耐肠液和耐胃液的特点。本研究筛选获得的2株安全、高效的产酶芽胞杆菌,可以作为异育银鲫“中科5号”的潜在益生菌。

• 植物激发子肽工程菌株的构建及其对棉花黄萎病的防治效果

  尹铭绅, 武国寒, 雷绳尾, 王羽, 牛秋红

  棉花黄萎病一直是限制我国棉花(Gossypium hirsutum)产业可持续发展的重要障碍。植物激发子肽(plant elicitor peptide, Pep)可增强植物对多种病原菌的免疫反应。本研究旨在构建棉花黄萎病植物激发子肽工程菌株,探究蛋白诱导肽在激活植物免疫后的抗菌作用,最终筛选出对棉花黄萎病具有良好防治效果的工程菌株。首先,对棉花黄萎病致病菌—大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的植物免疫诱导蛋白基因PEL1 (pectate lyase 1)与PevD1 (protein elicitor 1)进行克隆,并构建重组质粒pHT43-PEL1和pHT43-PevD1。经酶切与测序验证后,将质粒导入实验室前期筛选获得的拮抗棉花黄萎病菌的芽胞杆菌(Bacillus sp.) T6中,构建工程菌株。通过SDS-PAGE对PEL1和PevD1异源表达进行验证,结果显示,分别获得PEL1过表达的工程菌株V3-T和PevD1过表达的工程菌株P18-T。将工程菌株P18-T注射棉花叶片15 min,其活性氧含量较对照组显著增加(P<0.01)。在棉花盆栽试验中,工程菌株P18-T作用感病棉花植株30 d,使棉花黄萎病发病率和病情指数显著降低(P<0.05),防治效果达到78.85% (P<0.05)。本研究获得1株高效对抗棉花黄萎病的工程菌株P18-T,为拓宽棉花黄萎病综合防控技术手段提供了基础资料。

• 重组多杀性巴氏杆菌毒素介导FGFRL1诱导Hela细胞增殖研究

  林忠森, 赵勤, 袁建林, 伍锐, 颜其贵, 文翼平, 黄小波, 杜森焱, 曹三杰

  成纤维细胞生长因子受体样因子1 (fibroblast growth factor receptor-like 1, FGFRL1)作为成纤维细胞生长因子受体家族成员,在调控细胞增殖、分化上起作用。多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin, PMT)是多杀性巴氏杆菌(P. multocida, Pm)产生的重要毒力因子,属于一种促有丝分裂原蛋白,在多种细胞上引起细胞增殖,导致组织增生、占位,使其他正常组织细胞生存受限而死亡,但目前PMT引起促增殖作用的机制以及介导的因子均不清晰。前期CRISPR/Cas9全基因文库筛选发现FGFRL1提高了重组PMT (recombinant PMT, rPMT)蛋白染毒处理的Hela细胞存活率。为探究PMT在Hela细胞上的促增殖作用是否通过FGFRL1介导,本研究分别使用0、0.01、0.1、1.0 μg/mL的rPMT蛋白处理正常及FGFRL1基因缺失的Hela细胞各48 h,CCK-8 (Cell Counting Kit-8)法检测细胞增殖率、EdU-488标记法检测细胞DNA复制情况、划痕试验法检测增殖细胞的迁移率。结果显示,在rPMT浓度为0.1 μg/mL处理48 h时,缺失FGFRL1的Hela细胞增殖显著下降(P<0.05),而划痕恢复率与正常Hela细胞相比下降接近70% (P<0.05)。说明FGFRL1的缺失减弱了rPMT对Hela的促增殖作用。利用实时荧光定量PCR检测rPMT处理后Hela细胞 磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/serine-threonine protein kinase, PI3K-AKT)通路上游因子变化水平、Western blot检测该通路关键激活因子AKT的磷酸化水平进行初步验证。结果显示：rPMT处理后PI3K-AKT通路上游因子转录水平显著升高(P<0.05),缺失FGFRL1的Hela细胞AKT与磷酸化AKT水平极显著低于正常Hela细胞(P<0.01),说明PI3K-AKT通路激活受到抑制。由此可以初步确认PMT可能通过FGFRL1靶向PI3K-AKT通路引起Hela细胞增殖。本研究丰富了PMT促增殖作用的理论基础,初步探索了PMT引起细胞增殖的通路激活方式,为进一步揭示PMT的促增殖作用提供参考。

• 作物磷高效遗传改良与生物安全研究进展

  徐纪明, 陆宏, 吴忠长, 毛传澡

  磷 (phosphorus, P)是植物生长发育必需的大量营养元素之一,在植物生长发育过程中发挥着不可替代的作用。植物磷养分吸收利用的生理及分子调控机制的解析,是通过遗传改良提高作物磷吸收利用效率的基础。由于砷酸盐与磷酸盐具有相似的化学性质,在提高作物磷吸收的同时,砷酸盐的吸收也可能同时提高,因此通过遗传改良提高作物磷养分吸收效率的同时,作物砷元素含量,尤其是可食用部位的含量也需要重点关注。本文综述了植物磷吸收、转运及磷信号调控机制,磷、砷偶联吸收分子机制等的研究进展,并对目前作物磷高效遗传改良模式进行了总结,以期为作物磷高效遗传改良及生物安全评价提供参考。

• 内质网-脂滴-线粒体互作调控动物脂质代谢的研究进展

  王明宇, 庞卫军, 蔡瑞

  脂滴 (lipid droplet, LD)、内质网 (endoplasmic reticulum, ER)和线粒体是动物细胞中关键的细胞器,三者间互作对动物脂质代谢发挥着重要作用。ER与LD互作促进LD出芽、生长和脂质转移等,使LD能够有效地储存和分配,从而维持细胞能量平衡与脂质稳态。此外,LD与线粒体相互作用可促进线粒体有效摄取游离脂肪酸 (free fatty acids, FFAs),有助于维持细胞能量供应。本文以LD为中心,梳理并总结了LD与线粒体、ER、过氧化物酶体及溶酶体等细胞器的互作机制及调控动物脂质代谢的研究进展,旨在为从细胞器的角度探究动物脂质代谢提供新思路,为畜禽肉质性状形成机理解析及人类(Homo sapiens)代谢性疾病治疗提供新的方向。

• 基因编辑技术在猪分子育种中的研究进展及发展趋势

  赵娅娅, 袁利明, 华进联

  基因编辑技术为猪(Sus scrofa)分子育种提供了新的解决方案。通过基因编辑技术,可以实现精准、高效的基因编辑,为生猪育种工作提供了强大的工具。基因编辑不仅可用于快速、精准地改善生长速度、提高抗病能力,从而增强生猪的饲养效益,还能优化猪肉的质量、提升口感,甚至改善其营养成分,以满足消费者对于高品质、健康猪肉的日益增长的需求。然而,基因编辑技术的应用在技术方面仍然存在不小的挑战,例如脱靶效应。因此须加大技术创新,以解决这些制约猪基因编辑育种效率的问题,推动基因编辑技术在猪抗病育种中的广泛应用。本文综述了基因编辑技术在猪分子育种中的最新进展,包括技术进步、应用现状及面临的挑战,为我国生猪抗病育种研究提供参考。

• 云南烟草曲叶病毒LAMP快速检测体系的建立及初步应用

  赵正婷, 盖晓彤, 张俊蕾, 夏振远, 刘弟, 刘雅婷, 姜宁

  云南烟草曲叶病毒(Tobacco leaf curl Yunnan virus, TbLCYnV)是在中国云南保山烟草(Nicotiana tabacum)上发现的菜豆金色花叶病毒属新病毒,是云南烟草曲叶病的重要病原之一。为快速检测TbLCYnV,本研究根据TbLCYnV的外壳蛋白(coat protein, CP)基因保守核苷酸序列,设计了5组引物进行筛选,并采用单一变量法对环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反应温度、时间,体系中甜菜碱、dNTPs、Mg2+的体积摩尔浓度、内外引物比等进行逐一优化,同时与传统PCR平行对比以验证LAMP的特异性和灵敏度,应用田间采集样品验证LAMP体系的实用性,确立了TbLCYnV的LAMP检测最佳体系。结果表明,最佳引物组为TbL-5,最适反应温度为60 ℃,甜菜碱、dNTPs、Mg2+的最佳终浓度分别为1.0、0.4和4.0 mmol/L,最佳内外引物浓度比为4∶1,最佳反应时间60 min。检测结果显示优化后的LAMP经SYBR GreenⅠ染色可通过肉眼直接判断结果,具有高度特异性,且灵敏度是常规PCR的10 000倍。本研究为TbLCYnV的检测提供了一种便捷、高效、可靠的方法,对于TbLCYnV的早期快速诊断和防控具有重要意义。