农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2020年第2期

• 甘蓝型油菜WRKY69基因的cDNA克隆及表达特征分析

  姚玲芳, 崔醒, 梁湾湾, 高世东, 赵培玉, 陈芹芹, 燕敬利, 李翠, 江元清, 杨博

  WRKY转录因子是参与调控植物生长发育、抗逆及防御反应的一类重要蛋白质。本研究利用反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)技术,从甘蓝型油菜(Brassica napus)中克隆了WRKY69的cDNA序列(GenBank No. KC246583),其编码蛋白含有279个氨基酸残基,具有1个WRKY结构域以及C2H2型锌指结构,属于亚组Ⅱ成员。酵母转录活性分析显示,BnaWRKY69可能具有转录激活活性,该活性主要由羧基端序列决定。基于GFP的亚细胞定位结果显示,BnaWRKY69明显定位于细胞核,同时在细胞膜上也有信号。序列分析表明,BnaWRKY69可以发生豆蔻酰化和法尼基化两种翻译后修饰,可能与其特殊的质膜定位有关。通过羟胺(NH2OH)处理,在膜上的BnaWRKY69信号明显减弱甚至消失。通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)分析BnaWRKY69在多种非生物逆境、激素以及核盘菌处理下的转录水平变化,发现BnaWRKY69特异性地受到茉莉酸(jasmonic acid, JA)与核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的诱导。进一步检测发现,在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中瞬时过表达BnaWRKY69,会引起防御相关基因—病程发生相关蛋白1基因(pathogenesis-related 1a, PR1a)、PR2与NPR1 (non-expressor of PR 1)的显著上调,同时导致防御素1.2基因(plant defensin 1.2, PDF1.2)的下调。本研究初步解析了BnaWRKY69的基本特性,并探究了其在不同激素与非生物逆境处理后的的表达情况以及响应茉莉酸与核盘菌的分子机理,可为培育抗病性强的油菜品种提供参考依据。

• 小麦与叶锈菌互作过程中TabZIP3的功能研究

  刘娜, 孙天杰, 陈琰, 侯春燕, 韩胜芳, 王冬梅

  转录因子在植物对逆境胁迫的应答过程中具有重要作用,bZIP (basic domain leucine zipper)转录因子家族是参与抗病防卫反应的一类重要转录因子。本研究依据小麦(Triticum aestivum)与叶锈菌(Puccinia triticina)互作的转录组数据库,利用热图对bZIP转录因子家族unigenes的表达进行分析,筛选得到TabZIP3基因(Genbank No. BAD97365.1),利用qRT-PCR分析该基因在小麦与叶锈菌互作过程中的表达模式。结果显示,在不亲和组合中接种后8、12和16 h该基因持续高表达,且明显高于亲和组合。Plantcare软件分析该基因包含水杨酸(salicylic acid, SA)响应元件,实验中用外源SA喷施叶表面可诱导其表达;以大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaicvirus, BSMV)为载体,利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术沉默该基因,然后接种叶锈菌,发现在接种后48和96 h,单侵染点处过敏性反应(hypersensitive reaction, HR)面积及叶锈菌吸器母细胞(haustorial mother cell, HMC)数量明显高于对照。本研究结果表明,TabZIP3可能参与小麦抵抗叶锈菌侵染的基础防卫反应的诱发,在叶锈菌侵染诱发的HR反应中可能具有正调控作用,并且TabZIP3的表达受SA诱导。该结果为深入研究转录因子TabZIP3在小麦抵抗叶锈菌侵染中的作用机制提供了基础资料,也为利用分子育种手段培育抗叶锈小麦新品种提供了候选基因。

• 干旱胁迫和复水处理下玉米差异表达转录因子基因分析

  张鹏钰, 王国瑞, 曹丽茹, 袁珍, 库丽霞, 王同朝, 卫丽

  干旱是影响作物高产稳产的主要限制性因素,转录因子(transcription factor, TF)在植物对干旱胁迫的响应中起着至关重要的作用。本研究利用20% PEG6000在玉米(Zea mays)苗期模拟干旱胁迫处理60、96 h和复水3 d时,利用转录组测序(RNA-sequence, RNA-seq)技术,对转录因子基因的表达变化进行分析。结果显示,转录组测序总共检测到56类转录因子家族,共计2 270个转录因子基因,差异表达的转录因子基因有556个,占总数的24.49%。与对照相比,干旱胁迫处理96 h,差异表达转录因子基因数目最少;复水3 d时,差异表达转录因子基因数目最多,且主要呈现下调表达趋势。差异表达转录因子基因数目较多的家族有碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)、C2H2、乙烯反应元件结合蛋白(ethylene responsive factor, ERF)、禽成髓细胞性白血病病毒癌基因同源物(v-avian myeloblastosis viral oncogene homolog, MYB)、NAC和WRKY。由差异表达转录因子基因维恩图分析可知,共有37个转录因子基因在干旱胁迫及复水处理3个时间点均差异表达,分布于15个转录因子家族,其中WRKY家族数目最多。本研究结果可为进一步探讨玉米对旱胁迫转录因子家族的分子响应机制提供理论依据。

• 杜仲糖基转移酶基因的启动子克隆及表达分析

  文永, 李彪, 赵德刚, 赵懿琛

  植物的糖基转移酶(glycosyltransferase, GTs)是一大类修饰次生代谢产物进行糖基化反应的酶,GTs能将光合作用产物转变为二糖、寡糖和多糖,也可催化产生一些重要产物,包括细胞壁多糖、糖蛋白和许多不同类型的小分子物质。GTs能够促使某些激素和信号分子糖基化,进而参与信号调节。为研究杜仲糖基转移酶基因(Eucommia ulmoides glycosyltransferase gene, EuCGT1)调控模式,本研究获得杜仲EuCGT1基因5'端上游1 671 bp长度片段。通过Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测分析,发现该片段含有真核生物启动子核心元件TATA-box与CAAT-box。同时该片段还含有茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif、与干旱诱导的MYB结合位点(drought induced MYB binding site, MBS)、赤霉素响应元件(gibberelin responsive element, GARE)-motif、生长素响应元件(auxin response element, TGA-element)等多个诱导相关顺式作用元件。以不同长度启动子片段调控GUS基因表达分别构建植物表达载体,对转基因烟草中EuCGT1启动子的活性与功能进行探究。结果发现EuCGT1启动子核心区域主要位于该基因上游-268~-1 bp中。转基因烟草(Nicotiana tabacum 'Xanthi')根、茎、叶的GUS组织化学染色和杜仲中EuCGT1基因的表达量分析发现该基因的启动子更倾向于在叶片中表达。对杜仲进行激素诱导与环境胁迫后发现EuCGT1的表达受茉莉酸甲酯、生长素、赤霉素及高盐的调控。该研究结果可为进一步揭示杜仲EuCGT1启动子的功能及该启动子介导的基因表达调控模式提供参考。

• 猪PRKAA1基因相关LncRNAs的筛选及其在组织中的表达分析

  吴小敏, 倪锴, 朱晓锋, 谌颖莲, 赵佳福, 许厚强

  PRKAA1 (protein kinase, AMP activated α1)在脂肪代谢、细胞增殖和脂肪形成等过程具有重要的调控作用。为探究PRKAA1基因相关长链非编码RNAs (long noncoding RNAs, LncRNAs)的表达规律,本研究以贵州脂肪型猪种从江香猪(Sus scrofa)和商品型猪种约克夏(S. scrofa)为研究对象,根据猪PRKAA1 mRNA (GenBank No.XM_021076521)的3'UTR序列,利用NCBI和NONCODE (http://www.noncode.org/)对PRKAA1相关的LncRNAs进行筛选;对筛选的LncRNAs克隆并对序列二级结构、ORF、与PRKAA1作用的靶位点以及调控的miRNAs等进行预测;以qRT-PCR技术检测所筛选LncRNAs在从江香猪和约克夏各组织中的表达情况。选择NONSUST030689.1 (命名为ALNC1)和NONSUST004358.1 (命名为ALNC2)两条候选LncRNAs进行研究;克隆测序发现ALNC2对比原序列增加了46 bp;ALNC1具有4个ORFs,ALNC2具有5个ORFs;此外,ALNC1和ALNC2与PRKAA1作用的靶位点各1个;预测出能与LncRNA结合的miRNA (microRNA)主要有miR-1226-5p、miR-487b-5p、miR-7156-5p等;qRT-PCR检测结果显示,2条LncRNAs在从江香猪和约克夏各组织中均普遍表达,各组织间表达差异明显;ALNC1与ALNC2在从江香猪肝脏和脾脏中表达最高,背最长肌中最低;在约克夏大肠和肺脏中表达最高,背最长肌中表达最低;ALNC1在从江香猪肝脏、脾脏、小肠、脂肪和背最长肌的表达量极显著高于约克夏(P<0.01),心脏和大肠中表达量低于约克夏(P<0.01),在肺脏和肾脏中约克夏与从江香猪的表达差异不显著。ALNC2在肝脏、肾脏、背最长肌表达量极显著高于约克夏(P<0.01),心脏、肺脏、大肠、小肠中表达量极显著低于约克夏(P<0.01);脂肪中显著低于约克夏(P<0.05),脾脏中表达差异不显著。本研究结果可为深入探讨PRKAA1及相关LncRNAs在猪脂肪沉积中的调控作用提供基础资料。

• 蒙古牛无角POLLED位点的定点编辑

  谷明娟, 高丽, 周新宇, 吴迪, 魏著英, 李光鹏, 白春玲

  在养殖业中,牛角作为个体间争斗和伤人工具而成为养牛业的隐患之一。POLLED位点是目前发现控制牛(Bovidae)无角性状的主要位点,但在实际生产中,存在该位点的牛并不多见。为研制无角基因编辑牛,本研究利用CRISPR/Cas9技术,将POLLED位点P202ID基因型定点整合到有角蒙古牛(Bos taurus)胎儿成纤维细胞基因组中,建立P202ID基因型蒙古牛成纤维细胞系。首先以牛POLLED位点为靶点,设计合成4对单导向RNA (single guide RNA, sgRNA),并插入到CRISPR/Cas9系统表达载体。Surveyor酶切结果显示,由sgRNA1~4构建的载体切割效率依次是24%、26%、55%和17%,其中pCas-Guide-EF1α-GFP-sgRNA3活性最高。利用电转染法将活性最高的切割载体与含有P202ID序列的打靶载体共转染到蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过流式细胞仪分选阳性单细胞,进一步培养使其形成单克隆细胞;然后利用PCR及DNA测序技术,鉴定得到4株定点整合入细胞基因组的阳性单克隆细胞,可作为后续体细胞核移植的供体细胞。本研究可为培育无角体细胞克隆牛提供实验材料和技术支撑,为研究牛角的发生发育机制提供基础材料。

• 人工光照对初情期前母兔生殖系统发育的影响

  苏行, 任旭芳, 梁小虎, 胡馨悦, 罗刚, 王珺琦, 李彦宏, 刘哲良, 王杰, 胡深强, 赖松家

  光照是影响母兔(Oryctolagus cuniculus)繁殖性能的关键环境因素之一,为揭示人工光照对初情期前母兔生殖系统发育的影响及其潜在作用机制,本研究选取48日龄天府黑兔母兔,随机等分成光照组和对照组,采用人工光照对光照组母兔进行处理,对照组则采用自然光照;处理结束后,进行屠宰并记录生殖器官指数,采用ELISA法检测血浆褪黑素(melatonin, MLT)、雌二醇(estradiol, E2)、前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)和孕酮(progesterone, P4)含量,苏木精-伊红(hematoxylin & eosin, HE)染色观察卵巢、输卵管和子宫的组织学变化,qRT-PCR法检测MLT受体1A (MLT receptor 1A, MTNR1A)基因、P4受体(P4 receptor, PR)基因、E2受体(E2 receptor α and β, ERA and ERB)基因及PGE2受体(PGE2 receptor 1~4, EP1~4)基因在生殖系统中的相对表达量。结果显示,与对照组相比,人工光照显著增加了初情期前母兔双侧卵巢重、双侧输卵管重和双侧子宫重(P<0.05),并显著提高了双侧输卵管与双侧子宫指数(P<0.05)。组织学水平研究表明,人工光照处理后的卵巢上出现了三级卵泡和成熟卵泡,而在对照组仅存在原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡;人工光照还增加了输卵管与子宫内膜、肌层和浆膜厚度。另外,人工光照导致血浆MLT水平下降、PGE2和P4水平升高,却显著降低了血浆E2水平(P<0.05)。此外,人工光照不仅显著或极显著增加了卵巢中MTNR1A、PR、ERB和EP1~3的表达量(P<0.05或P<0.01),也显著或极显著增加了输卵管中PR和EP2~4的表达量(P<0.05或P<0.01),同时还显著或极显著增加了子宫体中MTNR1A、PR、ERB和EP3以及子宫角中PR、EP1、EP3和EP4的表达量(P<0.05或P<0.01)。以上结果表明,人工光照可能通过间接调控下丘脑-垂体轴和直接作用于生殖系统两种方式影响血浆激素水平,随后激活各自受体介导的信号转导通路,协同促进初情期前母兔卵巢、输卵管和子宫的发育成熟。本研究为母兔初情期的提前启动机制提供了理论依据和基础资料。

• 鸡Wnt5a基因慢病毒干扰载体的构建及其稳定表达的胚胎干细胞系筛选

  周静, 金晶, 何娜娜, 张晨, 王曼, 左其生, 张亚妮, 李碧春

  本课题组前期通过高通量测序发现无翅型MMTV整合位点家族成员5A (winglesstype MMTV integration site family member 5A, Wnt5a)介导的Wnt/β-catenin信号在鸡(Gallus gallus)雄性生殖细胞形成过程中被显著富集,为研究Wnt5a基因介导的Wnt/β-catenin信号通路在鸡胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的功能,本研究通过慢病毒(Lentivirus)介导的RNA干扰技术,建立稳定干扰Wnt5a基因的鸡胚胎干细胞系。针对Wnt5a基因设计3个干扰靶点序列和1个阴性对照序列,与pGMLV-SC5慢病毒载体重组;将慢病毒重组载体分别转染鸡DF-1细胞,通过qRT-PCR检测Wnt5a基因的表达,以确定各干扰载体的干扰效率,并对干扰效果最好的重组载体进行慢病毒包裹。利用包裹干扰载体的慢病毒感染鸡ESCs,采用qRT-PCR及Western blot检测不同组别Wnt5a及Wnt信号通路下游关键基因轴抑制蛋白2(axis inhibition protein 2, Axin2)、β-链蛋白(beta catenin,β-catenin),磷酯酶 C (phospholipase C, PLC)及泛素特异性肽酶54基因(ubiquitin specific peptidase 54, USP54)的表达量变化。同时构建Wnt5a过表达载体(pCDNA3.0-Wnt5a)进行Wnt5a基因的拯救实验。成功构建3条靶向Wnt5a的慢病毒干扰表达载体,分别为Wnt5a-shRNA1、Wnt5a-shRNA2和Wnt5a-shRNA3,Wnt5a-shRNA2重组质粒对Wnt5a基因的抑制效果最为明显,干扰效率可达80%,将Wnt5a-shRNA2重组质粒包裹慢病毒,病毒滴度：5×108 TU/mL;将Wnt5a-shRNA2慢病毒转染鸡ESCs后,qRT-PCR和Western blot结果表明,干扰组Wnt5a mRNA表达和蛋白表达水平较对照组显著降低(0.16±0.03 vs 1.03±0.02)(P<0.05),Wnt信号通路下游关键基因Axin2和β-catenin的表达量发生了显著下调(0.41±0.08 vs 1.03±0.05; 0.25±0.04 vs 1.03±0.05)(P<0.05);同时对干扰组转染Wnt5a过表达载体(PCDNA3.0-Wnt5a),结果发现干扰组Wnt5a的表达水平能够恢复(1.19±0.07 vs 1.03±0.02)。本研究成功构建了靶向鸡Wnt5a的shRNA慢病毒表达载体,可有效沉默Wnt5a基因在鸡DF-1细胞和胚胎干细胞中的表达,并且稳定表达Wnt5a-shRNA2的胚胎干细胞系可干扰Wnt信号转导,该结果将为进一步在细胞水平开展Wnt5a基因及其介导的Wnt信号通路的功能研究提供理论依据。

• 鸡FADS基因家族的生物信息学分析及表达调控

  张丁丁, 李转见, 韩瑞丽, 王彦彬, 李国喜, 刘小军, 田亚东, 孙桂荣, 康相涛, 李红

  脂肪酸脱氢酶(fatty acid desaturases, FADS)在多不饱和脂肪酸的生物合成过程中起着非常重要的作用,其表达受到多种因素的影响。本研究利用生物信息学软件对鸡(Gallus gallus) FADS基因家族成员的共线性关系、亲缘进化关系、基因结构、保守基序和功能结构域进行系统的分析;采用实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qRT-PCR)技术对FADS基因家族成员的组织和时空表达规律进行分析,并通过活体实验分析了雌激素和营养因子对FADS家族成员基因表达的影响。研究结果显示,家禽中FADS3基因可能不存在或者未被注释,FADS1L1和FADS1L2基因仅存在于家禽中,FADS6基因所在染色体区段物种间较保守;FADS6基因在物种间单独聚为一支,FADS基因家族其他成员聚为一支;FADS6基因在物种间外显子数及保守基序的组成上与其他成员间存在较大差异;蛋白结构域预测结果显示,除FADS6外,鸡FADS1、FADS2、FADS1L1和FADS1L2基因编码蛋白中均存在相同功能结构域。组织时空表达分析显示,FADS家族各成员在鸡不同组织中均有表达,其中FADS1、FADS2和FADS6在肝脏中相对表达水平最高,FADS1L1在胸肌相对表达水平最高,FADS2L2在胰腺相对表达水平最高;FADS家族各成员在30周龄母鸡肝脏中的表达量均显著高于20周龄(P<0.05);17β-雌二醇处理实验结果表明,雌激素可显著上调鸡肝脏FADS1、FADS2和FADS1L1基因表达(P<0.05);基础日粮添加8%大豆油能够显著提高鸡肝脏FADS2基因表达(P<0.05)。本研究分析了FADS基因家族的生物学特性,以及雌激素和大豆油对其表达的影响,可为深入研究FADS基因家族作用机制提供基础资料。

• 金定鸭卵抑制剂基因(OIH)和促性腺激素抑制激素基因(GnIH)多态性与产蛋性能的相关性研究

  操勇清, 曾涛, 刘国发, 周玮, 石放雄, 卢立志

  金定鸭(Anas platyrhynchos domestica)是我国优良蛋鸭品种,具有产蛋多、抗逆强等诸多优点,是蛋鸭新品种(配套系)选育的优秀素材。本研究以487只金定鸭为研究对象,采用DNA直接测序法,对卵抑制剂基因(ovoinhibitor, OIH)和促性腺激素抑制激素基因(gonadotropin-inhibitor hormone, GnIH)进行SNP检测及遗传学分析,并与金定鸭开产日龄、300日龄和500日龄产蛋量进行多态性关联分析。结果显示,金定鸭OIH基因外显子存在7个多态位点,GnIH基因外显子存在4个多态位点;所有位点均产生3种基因型,其中7个位点为错义突变。遗传学分析结果显示,上述11个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),其中8个位点为中度多态(0.50>PIC>0.25),3个位点为低度多态(PIC<0.25)。连锁不平衡分析结果显示,G2344A与T2363C、C2385T与C5749T位点为完全连锁不平衡,G1946A、T1949C、T2218C位点为两两完全连锁不平衡。关联分析结果显示,OIH基因C469T位点与金定鸭开产日龄和300日龄产蛋量显著相关(P<0.05),且AA基因型为优势基因型;OIH基因A517G、C2385T、C5749T、G5801A位点对金定鸭开产日龄有显著影响(P<0.05);GnIH基因C2089T位点与金定鸭500日龄产蛋量显著相关(P<0.05)。本研究筛选出对金定鸭产蛋性能有遗传效应的SNPs,可为产蛋性能候选基因的确立及分子标记辅助选育提供参考依据。

• 基于RNA-seq技术的江鳕不同组织转录组比较分析

  杨天燕, 蒋艳琳, 韩志强, 孟玮

  江鳕(Lota lota)是鳕形目鱼类中唯一淡水性分布、且具有重要经济价值的冷水性种类,也是研究鱼类温度和盐度生态适应机制的重要材料。基于Illumina Hiseq-2500高通量测序平台对江鳕脑、肾脏和肝脏组织转录组进行测序,质量控制去除raw reads之后分别得到高质量clean reads 22 254 637、22 843 364和24 168 330条,总计20.78 Gb的clean data数据。通过Trinity组装得到106 084条unigenes,平均长度为706 bp。采用生物信息学方法与相关数据库比对,得到32 745个(30.87%)有功能注释信息的unigenes,其中基因本体数据库(Gene Ontology, GO)功能注释将unigenes分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类56个分支;蛋白相邻类的聚簇数据库(Cluster of Orthologous Groups of Proteins, COG)功能注释包含了25个功能组分;KEGG代谢通路囊括6大类195小类。本研究通过对转录组测序数据组装及功能注释,为进一步深入挖掘和开发利用江鳕功能基因资源提供参考资料。

• 花椒窄吉丁化学感受蛋白AzanCSP3的cDNA克隆及原核表达

  杨平, 巩雪芳, 陈迪, 郭莉, 王延来, 吕淑杰, 谢寿安

  花椒窄吉丁(Agrilus zanthoxylumi)是花椒(Zanthoxylum bungeanum)树上的重要蛀干害虫,深入了解其嗅觉感受机制,有助于研究化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)在其化学感受系统中的作用。基于本课题组转录组测序结果,本研究克隆获得花椒窄吉丁化学感受蛋白基因(A. zanthoxylumi chemosensory protein, AzanCSP3)的cDNA,利用在线工具(Expasy; Signal P4.1; Swiss model)对其进行理化特性分析;利用BLAST进行同源性对比,并用MEGA 10.0软件Neighbor-joining法构建进化树,进而分析其与鞘翅目其他11种昆虫化学感受蛋白的亲缘关系;将原核表达载体pET28a(+)与克隆鉴定正确的重组质粒相连接,然后转入至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导后表达,用SDS-PAGE电泳分析目的融合蛋白的表达情况后,用Western blot检测所表达的蛋白是否为目标融合蛋白。结果表明,克隆获得花椒窄吉丁1条化学感受蛋白的cDNA序列,与转录组数据结果一致,其全长为846 bp,含有396 bp的完整开放阅读框,编码132个氨基酸,成熟蛋白分子质量为15.038 kD,等电点9.16,预测N末端含有28个氨基酸组成的信号肽;AzanCSP3的三维结构具有6个保守的α-螺旋,并形成1个疏水性的结合腔,具有化学感受蛋白家族的典型特征。氨基酸序列比对表示AzanCSP3与其他鞘翅目昆虫的CSP序列同源性较高,其中与苹果小吉丁(A. mali) AmalCSP4氨基酸序列同源性最高,为87.79%,系统发育结果表明,花椒窄吉丁AzanCSP3与苹果小吉丁AmalCSP4、白蜡窄吉丁(A. planipennis)的AplaCSP3以100%置信度聚为一支。Western blot检测结果表明,花椒窄吉丁AzanCSP3在大肠杆菌中成功表达。本研究明确了花椒窄吉丁化学感受蛋白AzanCSP3的结构特征,为深入研究花椒窄吉丁化学感受蛋白的功能特性、揭示花椒窄吉丁嗅觉识别机制提供了理论依据。

• 山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV-2FJ株的分离纯化和全基因组序列分析

  江锦秀, 林裕胜, 张靖鹏, 游伟, 黄丽丽, 毛坤明, 胡奇林

  近几年山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumour virus of goats, ENTV-2)引起的山羊地方性鼻内肿瘤病(enzootic nasal adenocarcinoma, ENA)在我国多省均有报道。为了丰富山羊(Capra hircus)ENTV-2的分子流行病学资料,本研究采集患病羊的鼻液,用差速离心结合蔗糖密度梯度离心纯化ENTV-2FJ株,进行电镜观察和SDS-PAGE;取纯化的病毒,用反转录(reverse transcription PCR, RT-PCR)方法分段扩增出山羊鼻内肿瘤病毒福建株(ENTV-2FJ)的7条cDNA片段,并对其全基因组序列进行了克隆测序(GenBank No. MK559457)分析。ENTV-2FJ株经过纯化后,在电镜下看到病毒粒子呈球形,直径为90~110 nm,有囊膜和纤突;经SDS-PAGE分析,ENTV-2FJ株的蛋白显示9条带,分子量分别为118、79、60、51、28、20、16、13和11 ku。ENTV-2FJ株全基因组序列长7 469 bp,与ENTV四川株(ENTV-2SC)、ENTV陕西株(ENTV-2Shaanxi)、ENTV陕西株2 (ENTV-2Shaanxi2)、ENTV陕西株3 (ENTV-2Shaanxi3)、及ENTV陕西株4 (ENTV-2Shaanxi4)的同源性分别为95.1%、95.4%、95.1%、94.9%和95.4%;经ENTV-2全基因组、群相关抗原(group associated antigen, gag)和囊膜蛋白(envelope protein, env)基因核苷酸序列构建的进化树分析发现,ENTV-2FJ株与ENTV-2SC、ENTV-2Shaanxi、ENTV-2Shaanxi2 、ENTV-2Shaanxi3和ENTV-2Shaanxi4处于同一进化分支。上述结果为ENTV-2检测方法的建立和遗传变异研究等提供了理论依据。

• 猪脂肪细胞分化及调控研究进展

  巩建飞, 刘欣, 孙金海, 王立贤

  脂肪积累与猪(Sus scrofa)的生长速度和猪肉品质密切相关。脂肪组织的发育依赖于脂肪细胞数量增加和体积增大,在两者相互协调、相互作用下导致脂肪的生成、积累。脂肪细胞分化受精密调控的转录级联控制,转录因子以一种连续的方式激活或抑制彼此的表达。本文综述了猪脂肪细胞分化的过程、脂肪细胞的研究模型、前脂肪细胞诱导分化的方法、脂肪细胞分化的标志因子以及相关的几个重要转录因子的研究现状,旨在为研究猪脂肪细胞分化及脂质代谢机制提供参考。

• 真菌漆酶：多样的生物学功能及复杂的天然底物

  刘宁, 贾慧, 申珅, 曹志艳, 董金皋

  漆酶是一种含有铜离子的多酚氧化酶,广泛存在于真菌、植物、细菌及昆虫中。在真菌中漆酶多以基因家族形式存在,编码的同工酶参与真菌形态建成、色素合成、侵染及致病等多种重要生物学过程。漆酶作用底物范围广泛,可以催化氧化包括多酚、芳香胺类及木质素等多种化合物。漆酶的研究主要集中于降解有毒有害物质、脱色等人工化合物的催化过程等方面,对其在生物体中天然催化底物及其参与的代谢途径的鉴别及分析研究较少。本文对漆酶在真菌中的生物学功能及其天然催化底物进行综述,以期为阐明漆酶发挥生物学功能的作用机制提供参考。

• 转基因大豆MON87701和MON87708双重实时荧光PCR检测技术的建立与应用

  袁俊杰, 魏霜, 龙阳, 吴希阳, 李想, 付伟

  我国是转基因大豆(Glycine max)主要消费国之一,转基因大豆安全性受到各界广泛关注,针对大豆转基因成分开展快速、准确的检测方法的研究势在必行。本研究基于TaqMan探针技术,建立了同时检测MON87701及MON87708两种转基因大豆品系的双重实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度及适用性进行了分析。结果显示,该方法能准确地从18种转基因样品和5种非转基因样品中检出靶基因,表明其具有良好的特异性;灵敏度可达0.01%;利用该方法对10批实际大豆样品进行检测,结果与欧盟标准方法一致,表明其具有良好的适用性。该方法适用于各口岸实验室对转基因大豆MON87701和MON87708品系同时进行快速、准确检测。本研究为转基因产品的监管提供了参考依据。

• 联合共检四种猪腹泻病毒的寡核苷酸芯片的构建及应用

  胡靖飞, 滑翔, 黄小波, 赵玉佳, 曹三杰, 文心田, 文翼平, 伍锐, 赵勤

  生产中常见仔猪(Sus scrofa)腹泻,造成严重经济损失。本研究建立了联合检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪轮状病毒A群(Porcine rotavirus A group, PRoV A)与猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV) 4种猪肠道病毒的寡核苷酸芯片并进行了临床应用。根据PEDV的纤突蛋白(spike, S)、囊膜蛋白(membrane, M)基因、TGEV的S、核衣壳蛋白(nucleocapsid, N)基因、PRoV A的外衣壳蛋白(outer capsid protein, VP7)、非结构蛋白(non-structural protein, NSP4)基因与PDCoV的囊膜蛋白M、N基因设计8对特异性引物,再根据每对引物扩增基因的保守区域设计寡核苷酸探针,并用Cy-3荧光直接标记下游引物5'端进行多重PCR扩增标记样品。研究确定最佳制备和反应参数：100 μmol/L探针原液与点样缓冲液比例为1∶2,水合处理10 h,杂交温度为42 ℃,杂交时间为120 min,以信噪比值(Signal-to-noise ratio, SNR)≥2或信号值>1 300判为阳性。该芯片灵敏性试验表明最低检测量为106 copies/μL;特异性实验表明对非目标病原无交叉反应,保存期试验表明制备的芯片置于4 ℃下可保存至少60 d。用该芯片检测209份临床腹泻样品,结果显示PEDV、TGEV、PoRVA、PDCoV的阳性率分别为68.42%、4.30%、0.95%和2.87%,检测结果与普通逆转录PCR (reverse transcription PCR)一致。本研究构建的寡核苷酸基因芯片为4种仔猪腹泻病原的高通量筛查提供了新技术。

• 斑石鲷肝脏细胞系的建立与鉴定

  张宏祥, 李坤明, 王娜, 翟介明, 陈松林

  鱼类细胞培养技术是一种被广泛应用于病毒学、环境毒理学、细胞生物学、基因组学以及遗传学等方面研究的重要研究手段。斑石鲷(Oplegnathus punctatus)是优良的海水养殖鱼类,在水产养殖产业中备受青睐。本研究通过组织块法,以斑石鲷肝脏组织为材料,建立了斑石鲷肝脏细胞系(O. punctatus liver cell line, OPL)。培养细胞系所用的培养基是在L-15基本培养基中添加了青链霉素混合液、胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和β-巯基乙醇(2- mercaptoethanol, 2-ME)所配成的完全培养基。培养出的OPL细胞主要由成纤维样细胞构成,生长分裂旺盛,成功传至30多代。比较不同培养基：L-15 (Leibovitz-15)、DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle medium/Ham's F-12)、DMEM和MEM对OPL细胞生长的影响,结果表明,L-15培养基最适用OPL的培养。此外,检测了温度、FBS浓度、bFGF浓度对OPL细胞生长的影响。结果表明,OPL细胞在18~30 ℃能正常生长,24 ℃是最适生长温度;OPL细胞在0%~20% FBS浓度范围内,其生长速度随血清浓度的升高而增快;在培养基中添加bFGF可以提高细胞生长速度。核型分析显示,第20代OPL细胞显示为正常二倍体核型(2n=2sm+46t),但其比例仅为68%。通过脂质体转染法将pEGFP-N3质粒转入OPL细胞中,可表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)。用斑石鲷的线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidase subunitⅠ, COⅠ)基因进行检测,确定该OPL细胞系来源于斑石鲷。OPL细胞系的建立将为斑石鲷致病性病毒的感染机制、细胞及基因的功能分析等研究提供实验材料。

• 通过SpyTag/SpyCatcher介导的自发环化提高酿酒酵母S288C中Ulp1的稳定性

  王梦珂, 郭玉堃, 郭婉莹, 贾宾, 张菡, 郭豫杰, 王江, 杨国宇, 韩莹倩

  SpyTag/SpyCatcher环化技术是一种自发迅速的共价连接反应,通过环化蛋白的骨架以实现目标蛋白的环化,从而提高目标蛋白稳定性。研究显示,SpyTag/SpyCatcher技术介导的环化过程不受环境的影响,不会影响目标蛋白原本的催化活性和功能,且一旦完成便具有极强的稳定性。小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifiers, SUMOs)是一种十分有效的促溶标签,广泛应用于重组蛋白的原核表达过程中。泛素样特异蛋白酶1 (ubiquitin-like-specific protease 1, Ulp1)是SUMO特异性蛋白酶中的一个重要成员,具有将SUMO从目标融合蛋白上切下,不残留任何氨基酸碱基的特异性酶切活性,且参与SUMO的成熟过程,但较差的稳定性限制了其应用。本研究使用截断型Ulp1 (Gly304~Lys621)代替全长Ulp1,并对其序列进行了优化,得到了重组截断型Ulp1。重组截断型Ulp1既具有Ulp1全部的酶活性,又能更好地在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达。本研究设计并表达了重组截断型(recombinant truncated Ulp1-His6, rtUlp1)、SpyTag-rtUlp1-SpyCatcher-His6 (crtUlp1)和Spy-TagΔDA-rtUlp1-SpyCatcherΔEQ-His6 (lrtUlp1)三种蛋白酶。综合比较3种蛋白酶的最适反应条件以及热稳定性,结果显示,crtUlp1的最佳反应酶切温度比lrtUlp1高10 ℃,比rtUlp1高5 ℃。crtUlp1在40 ℃条件下孵育2 h后仍保留87.3%的相对酶活,lrtUlp1在40 ℃条件下孵育2 h后仍保留43.69%的相对酶活,而rtUlp1几乎丧失了全部的酶活。且crtUlp1在广泛的酸碱范围内都能保持较高的酶活,而rtUlp1与lrtUlp1只在其最佳反应pH下表现出较高的酶切活性。本研究利用SpyTag/SpyCatcher技术获得了高稳定性的rtUlp1,评价了环化结构对rtUlp1热稳定性的影响以及SpyTag/SpyCatcher技术对rtUlp1热稳定性提高的效果,为获得具有高热稳定性的SUMOs特异性蛋白酶及促溶标签SUMOs的广泛使用提供技术基础。