农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2019年第3期

• 尼罗罗非鱼TRAF4基因的克隆、表达及功能分析

  韩雪晴, 高风英, 卢迈新, 刘志刚, 曹建萌, 王淼, 衣萌萌, 张德锋

  肿瘤坏死因子受体相关因子4 (tumor necrosis factor receptor associated factors 4, TRAF4)是TRAFs家族中比较特殊的一员,生物学功能较多且较复杂。为了明确TRAF4基因在尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus)免疫过程中的作用,本研究首先通过反转录PCR和分段扩增获得尼罗罗非鱼TRAF4基因cDNA (GenBank No. MH986338)及基因组序列,并进行基因和蛋白质结构等生物信息学分析;然后利用qRT-PCR技术检测该基因在健康个体中的组织表达、受精后不同发育阶段的表达以及人工感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后的表达特征;最后构建重组真核表达载体,分析TRAF4在人胚肾细胞293T中的亚细胞定位及其在Nuclear factor κB (NF-κB)通路中的作用。结果显示,TRAF4基因的cDNA序列为4 483 bp,开放阅读框为1 413 bp,可编码470个氨基酸。基因组序列分析发现,TRAF4基因含7个外显子和6个内含子。氨基酸序列分析发现,TRAF4存在1个环指(RING-finger)结构域、3个TRAF类型的锌指(zinc-finger)结构域、1个甲基多巴和TRAF同源物(meprin and TRAF-homology, MATH)结构域。组织分析表明,TRAF4基因在所检测的11个组织/器官中均有表达,脑中表达最高,脾中表达最低;该基因在受精后不同发育阶段均有表达。人工感染无乳链球菌后,尼罗罗非鱼TRAF4基因在肠、鳃、脾、肾和血液中的表达量均发生不同程度的变化,在鳃和血液中显著升高,在肠和肾中的表达量均低于对照组(0 h组)。亚细胞定位和双荧光素酶报告分析显示,TRAF4在293T细胞中主要定位于细胞质,可增强NF-κB活性。综上所述,TRAF4基因在尼罗罗非鱼的免疫应答中发挥重要作用,本研究为深入探讨TRAF4基因在罗非鱼抗感染免疫中的作用机制提供了基础资料。

• 基于CRISPR/Cas9技术的水稻OsDUF1475突变体的创建与分析

  孔晓聪, 邳瑞雪, 石雨鹭, 王荃, 靳亚军, 梁闪闪, 张泗举, 栾维江

  未知功能结构域蛋白家族(domains of unknown function protein families, DUFs)是一大群功能未表征的蛋白家族,在生命活动中具有重要作用。为了探究水稻(Oryza sativa) DUF基因OsDUF1475的生物学功能,利用CRISPR/Cas9技术对OsDUF1475基因进行靶向编辑。针对OsDUF1475基因第1个外显子设计2个single guide RNA (sgRNA)靶位点,分别构建获得2个CRISPR/Cas9重组载体;然后通过农杆菌(Agrobacterium)介导的遗传转化法导入水稻品种日本晴(Nipponbare)中,经潮霉素抗性筛选之后获得65株T0代转基因植株。对转基因植株的靶位点进行测序分析,发现有单碱基插入、10 bp以内碱基缺失和大片段DNA序列缺失3种类型。进一步分析氨基酸序列,发现这些突变造成氨基酸移码现象,进而导致蛋白质翻译的提前终止。上述结果表明,CRISPR/Cas9重组载体成功实现了对OsDUF1475基因的定向编辑,并且通过自交获得了T1代纯合突变植株。这些突变植株为进一步开展OsDUF1475功能研究提供了基础资料。

• 不结球白菜抗病相关基因BcSGT1的克隆及表达分析

  刘东让, 侯喜林, 肖栋

  SGT1(suppressor of the G2 allele of skp1)基因作为植物抗病信号途径中的重要元件,广泛参与植物细胞周期、逆境反应和信号转导等过程。为研究不结球白菜(Brassica rapa ssp. chinensis)抗病相关基因BcSGT1的结构和表达特征,本研究通过RACE (rapid-amplification of cDNA ends)技术,以抗病品种‘苏州青’叶片为材料克隆到BcSGT1基因的全长cDNA序列;采用qRT-PCR分析该基因在霜霉病菌(Peronospora parasitica)及黑斑病菌(Alternaria brassicicola)诱导处理条件下的表达模式;用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)技术分析该基因的原核表达特征。序列分析结果表明,BcSGT1基因的cDNA全长为1 418 bp,其中开放阅读框长度为1 074 bp,共编码358个氨基酸(GenBank No. AB495003)。氨基酸同源性的系统进化分析表明,不结球白菜BcSGT1基因与同科植物的进化关系相近,其中与大白菜(Brassica rapa ssp. pekinensis)第3号染色体的基因(Bra000741)同源性最高(97%)。qRT-PCR分析表明,霜霉病菌侵染处理下,BcSGT1基因在抗病品种‘苏州青’和感病品种‘矮脚黄’中的表达量分别于24、48 h达到峰值,且在‘苏州青’中的表达量峰值约为‘矮脚黄’中的2.1倍(P<0.01);黑斑病菌侵染处理下,BcSGT1基因在抗病品种‘苏州青’和感病品种‘矮脚黄’中的表达量分别于12、24 h达到峰值,且在‘苏州青’中的表达量峰值约为‘矮脚黄’中的2.0倍(P<0.01);霜霉病菌侵染处理24和48 h后,黑斑病菌侵染处理12、24和48 h后,BcSGT1基因在抗病品种‘苏州青’中的表达量均显著高于感病品种‘矮脚黄’中的表达量(P<0.01)。原核表达载体经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达出相对分子质量约为39 kD的融合蛋白。BcSGT1基因是不结球白菜霜霉病菌及黑斑病菌抗病反应的重要组成部分,且本研究成功将BcSGT1融合表达进大肠杆菌(Escherichia coli)中。本研究为高产、优质及抗病不结球白菜新品种的选育提供重要的理论依据。

• 橄榄CaERF109和CaABR1基因的克隆及其表达特性分析

  赖瑞联, 陈瑾, 冯新, 王仲, 陈义挺, 吴如健

  橄榄(Canarium album)是我国热带亚热带地区特色名贵果树,其抗寒能力弱,常常遭受低温冻害,APETALA2/乙烯响应因子(APETALA2/ethylene responsive factor, AP2/ERF)与植物生长发育和逆境胁迫响应密切相关。为了解橄榄AP2/ERF转录因子的调控功能,本研究以福榄1号橄榄为材料,采用反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)技术克隆了2个AP2/ERF超家族成员,命名为CaERF109(GenBank登录号: MH670905)和CaABR1(abscisic acid repressor 1, GenBank登录号: MH670906),并对其进行生物信息学和qRT-PCR表达分析。结果发现,CaERF109和CaABR1开放阅读框分别为888和1 473 bp,预测可分别编码295和490个氨基酸。生物信息学分析表明,CaERF109和CaABR1密码子偏好性较弱,均编码不稳定疏水碱性蛋白,具有AP2/ERF家族转录因子中ERF亚族的典型特征,预测分别定位于线粒体基质和过氧化物酶体。qRT-PCR分析表明,CaERF109和CaABR1在不同器官中呈特异性表达,其中表达量最高的分别是根和叶;低温胁迫过程中,随着温度降低,CaERF109和CaABR1均极显著上调表达(P<0.01)。研究结果表明,CaERF109和CaABR1可能在橄榄器官发育过程中存在功能差异,并且可能参与橄榄低温胁迫响应过程。本研究结果可为橄榄低温胁迫响应的分子机制研究和抗寒育种提供理论依据。

• Artemin在牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中的表达及定位

  王靖雷, 王萌, 潘阳阳, 李秦, 何翃闳, 胡学权, 韩小红, 樊江峰, 崔燕, 余四九

  Artemin (ARTN)是胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)配体家族成员之一,在多种哺乳动物生殖道和早期胚胎发育过程中表达并参与早期胚胎的发育调节,但尚未明确其是否存在于牦牛(Bos grunniens)主要生殖器官和胚胎中。为探究正常生理条件下Artemin在牦牛发情周期及早期胚胎发育过程中的调控作用及生物学机制,本研究分别采集不同繁殖周期(卵泡期, 黄体期及妊娠期)牦牛的主要生殖器官(输卵管, 卵巢, 子宫),以及孤雌激活胚胎,利用qRT-PCR检测Artemin基因在组织和胚胎发育过程中的表达,同时利用蛋白质免疫印迹(Western blot, WB)、免疫组织化学方法以及免疫荧光染色方法,分析Artemin在各生殖器官和胚胎中的表达水平与定位。结果显示,Artemin在牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中均有表达,其中黄体期与妊娠期的输卵管和卵巢中Artemin表达均显著高于卵泡期;卵泡期和妊娠期子宫中Artemin的表达显著高于黄体期;孤雌激活胚胎中Artemin的表达在桑椹胚期最高,4~8-细胞与囊胚期次之,2-细胞期最低。免疫组织化学结果显示,Artemin在输卵管黏膜上皮、卵泡膜、卵巢生殖上皮、黄体细胞、子宫内膜和子宫腺体均有表达。免疫荧光染色结果显示,Artemin在牦牛囊胚滋养层有表达。本研究结果表明,Artemin参与牦牛发情周期和早期胚胎发育的调控作用。该研究结果为进一步探究Artemin的作用机制提供了基础资料,有助于牦牛胚胎体外培养技术的改进和牦牛繁殖能力的提高。

• 藏绵羊HMOX1基因表达及其多态性与低氧适应性的关联分析

  何建文, 张伟, 刘秀, 李少斌, 王继卿, 胡江, 罗玉柱

  血红素加氧酶1(heme oxygenase 1, HMOX1)是血红素加氧酶家族的应激诱导型酶,在机体低氧胁迫代谢调控过程中扮演着重要角色。藏绵羊(Ovis aries)在长期进化过程中形成了独特的低氧适应策略来维持自身的氧平衡。为了探讨HMOX1基因的组织表达及其第三外显子(Exon3)区域多态性与藏绵羊高原低氧适应的关系,以寻找与藏绵羊低氧适应相关的分子标记,本研究以不同海拔地区的藏绵羊和湖羊(对照组)为研究对象,利用qRT-PCR及PCR-单链构象多态性(PCR-single-strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)方法检测HMOX1基因的组织表达,以及Exon3区域多态位点,分析不同基因型及等位基因与绵羊血液指标的相关性,以及SNPs与绵羊血液指标的关联性。结果表明,HMOX1基因在藏绵羊和湖羊各组织中均有表达。其中同一品种内,HMOX1在藏绵羊脾脏中高表达(P<0.01),其次在肝、肾脏和背最长肌中表达量也较高(P<0.05);而在湖羊中,HMOX1在肺脏和脂肪中高表达(P<0.01),其次在脾脏、肾脏及肝脏中的表达量也较高(P<0.05)。2个品种间同一组织表达比较结果显示,HMOX1基因在肺、脂肪中的表达量差异极显著(P<0.01)。HMOX1基因Exon3区检测到4个SNPs位点和A、B及C 3个等位基因;通过2个品种间不同基因型比较发现,湖羊的AB型个体血红蛋白含量(hemoglobin, HGB)和红细胞压积(hematokrit, HCT)值明显低于藏绵羊的其他基因型(P<0.01),藏绵羊的AA和BB型个体的HGB和HCT值显著高于AB型(P<0.01),AC型血氧饱和度(oxygen saturation, SO2)值显著高于AA和BB型个体;而c.3775G>A位点上MM基因型个体的SO2、HGB、HCT值显著高于NN基因型(P<0.05)。由此说明AA、BB和AC基因型的c.3775G>A位点变异与血液指标存在相关性,且为G时更有利于对低氧环境的适应。因此,HMOX1基因可作为低氧适应的候选基因,为探索藏绵羊低氧适应分子机制提供基础资料。

• 乌珠穆沁羊LPL基因第3外显子多态性与肉质性状的关联分析

  高鸿蒙, 张秀英, 张慧泽, 哈斯其木格, 周旭光, 魏健民, 于中正

  肉品质性状在绵羊(Ovis aries)育种中具有重要的经济价值。脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)在动物机体内脂质及脂蛋白代谢反应中发挥了关键作用。绵羊LPL基因第3外显子上存在A384T单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,该位点已被证实与绵羊肉质性状有关。乌珠穆沁羊(Ujimqin sheep)属肉脂兼用粗毛型地方绵羊品种,以生产优质羔羊肉而著称。为探讨A384T位点多态性与乌珠穆沁羊肉质性状的关联性,本研究以420只雄性去势乌珠穆沁羔羊为实验样本,利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技术对该位点进行了基因分型,并对其多态性对肉质性状和肌肉脂肪酸含量的影响进行分析。实验结果表明：在乌珠穆沁羊中A384T位点共存在3种不同的基因型,分别为TT、TA、AA基因型。其中TA基因型频率最高(0.4714),AA基因型频率最低(0.1595),经检验该位点基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。经测定,TT基因型乌珠穆沁羊个体的pH24值极显著高于TA和AA基因型(P<0.01);滴水损失显著高于TA和AA基因型(P<0.05),TT基因型个体肌肉组织中棕榈酸和硬脂酸的含量极显著低于TA和AA基因型(P<0.01);肉豆蔻酸的含量显著低于TA和AA基因型(P<0.05)。本研究结果表明,LPL基因第3外显子A384T位点与乌珠穆沁羊的肉质性状显著关联。该研究结果可作为影响乌珠穆沁羊分子标记辅助育种的有效分子遗传标记,为乌珠穆沁羊的遗传改良提供科学依据。

• 甘加藏羊发情周期下丘脑-垂体-卵巢轴中MTR1a基因的表达分析

  杨大鹏, 何玉琴, 葛闻博, 张全伟, 华道才让, 王霞, 周凯仁, 陈卫刚

  褪黑激素(melatonin, MT)是松果体分泌的一种吲哚类激素,与其受体结合可作用于雌性动物下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamic-pituitary-ovarian, HPO),对动物的季节性繁殖起一定的调控作用。为阐明高原甘加藏羊(Ovis aries)发情周期HPO中褪黑素1a受体基因(melatonin receptor 1a, MTR1a)的表达规律,本实验选取健康空怀且处于发情周期的甘加藏羊32只,应用qRT-PCR的方法,检测其发情周期下丘脑、垂体、卵巢组织中MTR1a基因表达差异。结果显示,甘加藏羊整个发情周期MTR1a在HPO轴组织中均有表达。在甘加藏羊发情前期、发情期、发情后期、间情期下丘脑组织中MTR1a基因的相对表达量发情前期最高,极显著高于发情期和发情后期(P<0.01);在垂体组织中MTR1a基因的相对表达量间情期最高,与发情期差异显著(P<0.05);在卵巢组织中MTR1a基因的相对表达量发情前期最高,其中发情前期MTR1a基因的相对表达量极显著高于其他三个时期(P<0.01);甘加藏羊发情周期HPO轴组织中均有MTR1a的表达,且表达量具有动态变化差异性,表明MT在甘加藏羊生殖活动中具有调节作用,这一研究结果在mRNA水平上为进一步揭示MT对甘加藏羊繁殖性能调控提供了科学依据。

• 猪VRTN基因SINE转座子插入多态与生长和繁殖性状的关联分析

  陈伟, 陈才, 王宵燕, 张丽, 王伟, 沈丹, 王赛赛, 高波, 宋成义

  椎骨发育相关基因 (vertebrae development associated, VRTN)是动物椎骨发育的重要调控基因,研究表明猪(Sus scrofa domesticus)VRTN基因中存在一个短散在重复序列(short interspersed repeated sequence, SINE)的插入多态,该多态可能与猪的脊椎数关联。本研究通过PCR检测、性状关联分析和生物信息学分析等研究了SINE插入多态在不同品种间的分布及其对猪生长和繁殖性状的影响。结果表明,引入品种SINE+频率高于培育猪种和中国地方猪种,大白猪SINE+/+个体100 kg体重日龄显著高于SINE-/-个体(P<0.05),大白猪SINE+/+个体眼肌面积显著低于SINE-/-个体(P<0.05)。产活仔数等繁殖性状与SINE插入多态无显著关联。经与表达序列标签(expressed sequence tag, EST)等数据库序列比对未发现SINE与VRTN基因形成融合转录本。本研究表明VRTN基因中SINE插入多态可能与猪生长速度和瘦肉率有关联,此结果为该分子标记在猪分子育种中的应用提供了参考。

• FGF10基因真核表达载体的构建及其在从江香猪不同组织中的表达

  徐敏, 许厚强, 杨洋, 陈伟

  成纤维细胞生长因子10基因(fibroblast growth factor 10, FGF10)属于6个FGFs亚家族中的 FGF7亚家族,是特异地表达于白色脂肪组织的唯一FGF,在脂肪组织的发育和代谢过程中具有重要的作用。本实验旨在研究从江香猪(Sus scrofa)肌内前体脂肪细胞中FGF10对脂肪代谢的调控功能,实验采用qRT-PCR的方法检测了从江香猪不同组织中的表达情况,并根据克隆得到的FGF10的CDS区,构建了真核过表达载体pEGFP-C1-FGF10;分离培养从江香猪肌内前体脂肪细胞运用胶原酶消化法分离培养从江香猪肌内前体脂肪细胞,并进行了诱导培养,采用油红O染色法进行鉴定;运用qRT-PCR技术检测FGF10基因在不同诱导阶段的从江香猪肌内前体脂肪细胞中的表达;利用脂质体法将重组质粒pEGFP-C1-FGF10瞬时转染从江香猪肌内前体脂肪细胞,并检测过表达FGF10基因后脂肪相关代谢沉积的氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ)、脂联素基因(adiponectin, ADIPOQ)、脂肪酸结合蛋白4基因(fatty acid binding protein 4, FABP4)、脂肪酸合成酶基因(fatty acid synthase, FAS)、脂肪组织甘油三酯水解酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)、激素敏感脂酶基因(hormone sensitive lipase, HSL)、脂蛋白酯酶基因(lipoprotein lipase, LPL)以及乙酰辅酶A羧化酶基因(acetyl-CoA carboxylase, ACC)的表达水平。FGF10基因表达量最低是在背最长肌中,表达量最高是在胃中(P<0.05),其次是在肾脏和脂肪中;在诱导的早期阶段,FGF10基因表达量逐渐增加,在诱导分化48 h的表达量最高;经双酶切和测序鉴定,成功构建了pEGFP-C1-FGF10表达载体,且在从江香猪肌内前体脂肪细胞中成功表达;与空白对照相比,ACC、FABP4、FAS、LPL、PPARγ的表达量均增加,ADIPOQ、ATGL和HSL的表达量均减少。FGF10对脂肪的沉积具有一定的调控作用,这种作用可能是通过对相关脂肪代谢基因的调控实现的。本研究为揭示FGF10对脂肪的调控作用提供了基础数据。

• 蛋鸡骨钙素基因启动子变异及其转录活性研究

  王涵, 陈烨, 岳巧娴, 周荣艳, 陈辉, 王德贺, 锡建中

  骨钙素(osteocalcin, OCN)是由成骨细胞分泌合成的一种非胶原骨基质蛋白,在骨重建、骨矿化等骨代谢过程中发挥重要作用。本研究旨在研究蛋鸡(Gallus gallus domesticus) OCN基因表达调控机制。选取20只50周龄大午粉蛋鸡,提取血液DNA;以Ensembl基因组数据库中OCN基因序列(ENSGALG00000029494)为模板设计引物,扩增OCN基因启动子;利用Sanger测序方法在OCN基因启动子区寻找潜在的遗传变异。采用JASPAR2018在线软件进行转录因子结合位点预测,并构建启动子不同单倍型荧光素酶报告基因重组载体,转染鸡成纤维细胞系DF-1后检测双荧光素酶活性。结果表明,所扩增蛋鸡OCN基因启动子区具有转录活性,含有维生素D受体(Vitamin D receptor, VDR)、RUNX (Runt related transcription factor)1、RUNX2和RUNX3等骨代谢相关转录因子结合位点,测序结果发现在启动子区存在插入片段CCGCACTCTGCACTTTGCGGCCG和缺失片段CCACA,以及C>G和A>G突变,组成4种单倍型;双荧光素酶检测结果表明,启动子区4种单倍型均具有转录活性,但不同单倍型间转录活性存在极显著差异(P<0.01),其中单倍型Ⅳ活性最高。本研究确定了OCN基因核心启动子区,且不同变异类型启动子的转录活性存在差异,为该基因在蛋鸡骨代谢中的转录调控提供了基础资料。

• 单次重组腺病毒加强BCG初免小鼠后诱导的特异性T细胞免疫应答

  李武, 邓光存, 刘晓明, 王玉炯

  由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染引起的结核病是引起人类死亡的重要传染病之一。到目前为止,卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)仍然是在全球范围内唯一可用的抗结核疫苗,但其免疫保护效果,尤其是针对成人的保护效果不佳。因此,研制新的、更有效的疫苗来替代BCG或加强BCG的免疫效果势在必行。本研究基于课题组前期关于重组腺病毒载体Ad5-CEAB能够诱导小鼠(Mus musculus)产生抗原特异性免疫应答的研究结果,利用抗原特异性淋巴细胞增殖实验、γ-干扰素酶联免疫斑点实验(interferon-γ enzyme-linked immunospot assay, INF-γ ELISPOT)、CD4+和CD8+ T淋巴细胞流式细胞术分析以及细胞因子酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)等实验和技术对BCG初免-单次重组腺病毒Ad5-CEAB加强后诱导小鼠产生的特异性T细胞免疫应答进行评价。实验以美国费城癌症研究所(Institute of Cancer Research, ICR)选育的6~8周龄雌性ICR小鼠为动物模型,随机分为4组,对照组只接种磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)或1×106 CFU的BCG,实验组接种BCG后(初免),又经呼吸道接种1×109 PFU 的Ad5-CEAB进行加强。6周后处死小鼠并测定相关免疫学指标,结果显示,与PBS对照组相比,BCG组和BCG初免联合Ad5-CEAB加强组表现出明显的促进T细胞增殖的效应,BCG/Ad5-2组、BCG/Ad5-1组和BCG组刺激指数(stimulate index, SI)均显著高于PBS组(P<0.05),Ad5-CEAB加强2次的效果好于加强1次,但Ad5-CEAB加强1次也能取得显著的促进T细胞增殖的效果;Ad5-CEAB加强组INF-γ分泌细胞的数量显著高于对照组(P<0.05),ELISA测定结果表明,淋巴细胞培养上清液中的白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2)和α-肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)的含量均显著高于BCG对照组(P<0.05),且BCG/Ad5-2组和BCG/Ad5-1组间细胞因子的含量并没有显著的差异(P>0.05);流式细胞分析结果表明,Ad5-CEAB组中CD4+和CD8+T细胞比值显著高于对照组(P<0.05),BCG/Ad5-2组和BCG/Ad5-1组间没有显著差异(P>0.05)。本研究结果表明,BCG初免联合1次重组腺病毒加强免疫可以诱导小鼠产生较强的抗原特异性T细胞免疫应答。本研究为开发新的基于重组腺病毒的抗结核疫苗的设计和基于粘膜免疫的异源初免-加强的免疫策略的研究提供了依据。

• 棉铃虫几丁质酶的系统分类及Ⅶ型几丁质酶表达与酶学性质分析

  麦麦提艾力·阿卜杜纳斯尔, 李梦鸽, 包静, 随慧, 刘小宁

  昆虫几丁质酶(chitinase, CHT)主要参与蜕皮、围食膜的降解、细胞增殖和机体免疫防御等重要生理生长发育过程。本研究从NCBI下载棉铃虫(Helicoverpa armigera)及其他昆虫的几丁质酶氨基酸序列,分析结构域和构建系统进化树,结果表明,棉铃虫的6个几丁质酶分别属于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ型几丁质酶,1个几丁质酶属新的类型(new group)。到目前为止,Ⅶ型几丁质酶HaCHTⅦ研究较少,本研究克隆了HaCHTⅦ基因,在大肠杆菌(Escherichia coli) transetta(DE3)中表达和纯化了融合蛋白His-HaCHTⅦ,并测定了其对胶体几丁质和N-乙酰壳二糖底物的降解活性,结果表明,His-HaCHTⅦ对胶体几丁质没有降解活性,而对N-乙酰壳二糖具有降解活性,最适pH值和温度分别为7和25 ℃,动力学参数米氏常数(Km)和最大速率(Vmax)分别为0.486 2 mmol/L和2.715 1 µg/(mL·min),说明HaCHTⅦ在棉铃虫体内可能将寡聚糖降解为N-乙酰基葡糖糖,为合成新的几丁质提供起始底物而参与昆虫的生长发育。本研究结果将有助于更好地理解棉铃虫Ⅶ型几丁质酶的功能,也为害虫防治提供有益的信息。

• 西瓜噬酸菌鞭毛基因flgM的功能分析

  杨丙烨, 胡方平, 蔡学清

  西瓜(Citrullus lanatus)细菌性果斑病(bacterial fruit blotch, BFB)是世界范围内的检疫性病害,该病害的病原菌为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli, Ac),自发现以来给西瓜种植业造成严重的经济损失,为了有效控制其危害,需要弄清该病菌的致病机制。细菌的鞭毛是细菌的运动器官之一,在细菌的侵染过程中也起着重要的作用。在多种不同细菌中已经证实,反σ因子flgM是调控鞭毛基因转录的必要因子,但是其在西瓜噬酸菌中的功能仍然未知,本研究旨在探讨该基因在鞭毛形成和致病性等生物学特性中的作用。根据同源重组的原理,借助自杀质粒pK8mobsacB,构建flgM基因缺失突变菌株,并对其鞭毛的形态特征、致病性、致敏性、游动性、群体感应、菌膜形成、生长速率及细菌颤泳性等生物学特性进行测定;以谷胱酰胺合成酶基因(glutathiamide synthetase gene, glnA)为参照基因,采用qRT-PCR方法,比较野生菌株、敲除菌株和互补菌株部分鞭毛蛋白基因flhD、fliE、fliC、flgK、flgA、fliS、fliD和fliA的表达量差异。结果表明,通过庆大霉素(gentamicin, Gm)抗性基因Gm筛选和PCR验证,成功地构建了西瓜噬酸菌鞭毛蛋白基因flgM的缺失突变菌株FJAc01-flgM及其互补菌株FJAc01-flgMhb,并对所得菌株的生物学特性进行观察,结果显示,与野生菌株相比,基因flgM缺失后不形成鞭毛、菌株的游动能力和菌膜形成能力均减弱、生长速率显著加快、对西瓜果实和西瓜苗的致病力明显减弱;基因互补后恢复了鞭毛的形成能力、游动性和菌膜形成能力、菌株的生长能力和对西瓜果实和西瓜苗的致病力也基本得到恢复,如针刺接种西瓜果实和喷雾接种西瓜苗后5 d,野生菌株处理的病情指数分别为74.67和26.39,基因缺失突变体处理的病情指数分别为46.00和2.78,而互补菌株处理的病情指数分别为63.85和20.83;光学显微镜下,可观察到在肉汁胨培养基(nutrient agar medium, NA)平板上的野生菌株菌落周围有明显的由细菌颤泳形成的特殊晕圈,而缺失突变菌株在NA平板上形成晕圈能力减弱,互补后晕圈形成能力部分恢复;但是,野生菌株、缺失突变菌株和互补菌株在烟草(Nicotiana benthamiana)过敏感应、群体感应和甜瓜(Cucumis melo)苗的致病性等方面无明显变化。qRT-PCR结果显示,基因flgM缺失突变后,基因flhD、fliC和fliS的表达量上升,而基因flgK、fliA和fliE的表达量下降,互补后这些基因的表达量基本与野生菌株相同,但是基因flgA和fliD的表达量没有变化。由此可见,鞭毛蛋白基因flgM对西瓜细菌性果斑病菌鞭毛丝的形成、致病性、菌膜形成能力、生长速率、游动性、菌落形态等均有调控作用。本研究通过定点突变研究了西瓜噬酸菌鞭毛基因flgM的生物学功能,为进一步解析该基因在西瓜噬酸菌鞭毛形成和致病过程中的作用提供理论依据。

• 单链抗体对Cry1A类毒素的检测方法建立及识别差异初步研究

  曲婷婷, 张霄, 董飒, 刘贝贝, 李盼, 王耘, 张存政, 刘贤金

  为建立一种针对Cry1类毒素的经济高效的检测方法,本研究以杂交瘤细胞株2D10 cDNA为模板,通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR)技术构建单链抗体(single-chain variable fragment, scFv)基因,转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)表达并建立双抗体夹心酶联免疫吸附测定(double antibody sandwich ELISA, DAS-ELISA)检测方法,通过分子对接模拟分析影响scFv与Cry1A类毒素结合的关键因素。结果成功构建了scFv基因,表达纯化出具有较高识别活性的scFv抗体(约28 kD),所建立的DAS-ELISA方法对Cry1Ab/Cry1Ac毒素的最低检测限(limits of determination, LOD)为20 ng/mL,分子对接结果显示,毒素的三维结构决定了其结合活性,氢键和疏水作用力在scFv与毒素结合过程中起重要作用。本研究利用基因工程抗体技术构建并表达获得了scFv抗体,建立了针对Cry1Ab/Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,初步分析研究了scFv与Cry1Ac/Cry1Ab和Cry1Aa的识别差异机制,为进一步改造、研究开发新型广谱scFv提供了理论依据。

• 解淀粉芽胞杆菌对玉米秸秆的降解特性

  杨娟, 王艳, 蔡云花, 李红亚, 李术娜, 王树香, 王全

  利用微生物发酵技术降解玉米(Zea mays)秸秆,对于实现纤维素类生物质的资源化利用意义重大。本研究在课题组前期获得1株可降解纤维素的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)MN-13菌株的基础上,进一步考察了该菌株的纤维素酶活力以及对玉米秸秆纤维素的降解特性,通过气质联用色谱对秸秆纤维素类成分的降解产物进行了分析,旨在为菌株MN-13发酵玉米秸秆的过程调控提供基础数据。结果表明,解淀粉芽胞杆菌MN-13可产生纤维素酶,在纤维素—无机盐培养基中发酵60 h,其滤纸纤维素酶(总纤维素酶)的酶活力最高可到8.35 U/mL;在发酵玉米秸秆10 d时半纤维素酶活力达到最高60.46 U/g,纤维素酶活力则在发酵14 d时达到最高45.40 U/g;在发酵19 d时,可溶性糖含量达到最高并趋于稳定;发酵24 d后,菌株对秸秆的组织结构破坏显著,对秸秆纤维素和半纤维素的降解率可分别达到27.12%和40.6%,降解产物中主要包含单糖、醇类和短链脂肪酸等物质。本研究结果为解淀粉芽胞杆菌在生物质资源利用中的应用提供了实验依据。

• Lin28对哺乳动物生殖调控的研究进展

  曹贵玲, 姜运良, 储明星

  Lin28a和Lin28b是RNA结合蛋白,通过结合let-7 microRNA前体调控let-7的成熟过程,或直接与mRNA结合调控其翻译和稳定性,参与细胞多潜能性、肿瘤发生、葡萄糖代谢等多个生理过程。最近一些研究发现二者可能参与人和动物的生殖活动,但功能还不清晰。本文对Lin28a和Lin28b基因在哺乳动物初情期启动、原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)形成和配子发生中的作用相关研究进行了综述,以期为深入探索二者在动物生殖中的功能研究提供参考。

• 利用流式细胞术鉴定新疆野杏染色体倍性和DNA含量

  李雯雯, 刘立强, 帕米尔·艾尼, 王亚楠, 程功, 廖康

  分布在我国新疆伊犁河谷的野杏(Armeniaca vulgaris)是第三纪暖温带阔叶林的孑遗群落,其分布区域广阔,具有庞大的实生群体和丰富的遗传多样性。为探索适合杏属植物的流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测体系,以快速、准确的对杏属植物的倍性和DNA含量进行检测,本研究选取野杏不同供试材料(幼叶, 老叶),通过不同保存方式(新鲜, 冷藏, 液氮保存)处理,并以紫花苜蓿(Medicago sativa)为外标,利用杏流式细胞术检测体系对10种常用的解离液进行筛选与优化,并检测了野杏的细胞倍性和DNA含量。结果表明,新鲜幼嫩的叶片,使用经优化的MgSO4解离液与Lysis解离液(LB01)的混合液(MgSO4-LB01)制备样品进行检测,其变异系数(coefficient of variation, CV)最低,上样速率达150 events/μL。随着试材冷藏时间的增加,样品CV值随之增加。冷藏4 d以内的幼嫩叶片CV值在5%以内,老叶及液氮保存的叶片制备细胞核悬浮液CV值较高,呈现出分辨率差的峰,背景碎片较多。本研究检测得出供试新疆野杏均为二倍体,DNA含量范围为288~321 Mb/C。新鲜或冷藏4 d之内的幼嫩杏叶片是进行流式细胞术检测的理想材料,经优化的MgSO4-LB01混合液是最适杏的解离液,利用流式细胞术可以快速准确地检测杏属植物的倍性及DNA含量。本研究结果为杏属植物基因组学和遗传进化研究提供基础数据。

• 甘薯茎腐病菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

  沈肖玲, 易建平, 王荣洲, 钱俊婷, 李艳敏, 姚海峰, 楼兵干

  达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)引起的甘薯(Ipomoea batatas)茎腐病是严重危害甘薯的一种病害。目前该病在浙江、河北、河南等省均有发生。带菌种薯和种苗的远距离调运是病害向无病区传播的主要途径,因此准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行检疫措施的有力工具。将D. dadantii编码鞭毛蛋白基因(flagellin protein gene, fliC)序列与近缘种比对发现,该基因特异性强,适合作为分子检测的靶标。本研究以fliC基因为靶标,设计了特异性引物和TaqMan探针,建立了D. dadantii荧光定量PCR (TaqMan qRT-PCR)检测方法。结果发现,该方法对D. dadantii显示了良好的特异性,能使其与同属不同种及不同属细菌有效区分。同时研究表明,该方法具有较高的灵敏度,对菌体DNA的检测灵敏度可达280 fg/μL,是常规PCR的1 000倍;对菌液的检测灵敏度可达2 CFU/μL (CFU: 菌落形成单位, colony forming units),比常规PCR检测方法高100倍。利用NGM (nematode growth medium)培养基对疑似甘薯茎腐病样本进行分离,发现D. dadantii能够在培养基上形成深褐色至蓝色的菌落,可明显提高病原菌分离纯化的效率。采用构建的TaqMan qRT-PCR方法、常规PCR法和基于NGM培养基的分离培养法对70份甘薯和土壤样品进行实际样本的检测;结果表明,TaqMan qRT-PCR法、常规PCR法和分离培养法的阳性检出率分别为91.4%、77.1%和71.4%,TaqMan qRT-PCR检测准确性更高,且将检测时间从96 h缩短为1.5 h。本研究建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测体系能有效用于甘薯茎腐病疑似样本的快速检测,对该病害的检疫具有重要的意义。

• 鸭腺病毒3型MGB TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

  陈翠腾, 陈珍, 朱春华, 蔡国漳, 刘斌琼, 黄瑜

  鸭(Anas platyrhynchos domestica)腺病毒3型(Duck adenovirus type 3, DAdV-3)是近年来我国新发现的鸭源腺病毒。本研究根据NCBI数据库中DAdV-3代表株(CH-GD-12-2014株, GenBank No. KR135164)的22K基因特征,设计特异性引物和探针,建立检测DAdV-3的MGB TaqMan探针qRT-PCR方法。结果表明,建立的qRT-PCR方法具有如下特性：灵敏度高,最低检测限为55拷贝/μL;特异性强,和鸭群常见传染病病原均无交叉反应;重复性好,组内和组间重复实验变异系数分别为0.44%~2.10%和0.64%~2.37%。利用建立的qRT-PCR方法对临床送检的61份鸭源病料进行检测,检出DAdV-3阳性15份,阳性率为24.6%。本研究为后续开展DAdV-3感染的实验室快速诊断和流行病学调查奠定了初步基础。