农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2022年第9期

• 拟南芥仅含START结构域蛋白质的生物学功能研究

  刘霞, 李晓凯, 常红娟, 刘彤彤, 王凤茹

  含START (steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer)结构域的蛋白质广泛存在于生物界,按所含结构域分为两类,其中一类是START结构域和其他结构域并存,另一类是仅含START结构域。拟南芥(Arabidopsis thaliana)中含START结构域的蛋白质共有35个,其中8个仅含START结构域,这些仅含START结构域的亚家族为明确START结构域的功能提供了理想的研究材料。本研究以仅含START结构域的8个成员为研究对象,利用生物信息学方法,结合qPCR技术分析其组织表达特性。结果显示,8个成员中有2个位于1、3、4和5号染色体上,8个成员的START结构域大小和氨基酸序列不完全一致,具有不同的组织表达特异性。为明确仅含START结构域蛋白质的生物学功能,以8个成员的过表达转基因植株和T-DNA插入突变体为材料进行表型分析,发现功能获得和缺失突变体均表现为叶片非对称性生长、卷曲和发育受阻,果荚不再轮生生长、着生次序混乱,有连续着生在茎同侧的现象。本研究结果提示,仅含START结构域的蛋白家族在植物形态建成中具有重要的调控作用。本研究为阐明仅含START结构域蛋白质在调控植物生长发育中的分子机制提供了基础资料。

• 水稻种子耐贮性全基因组关联分析

  何兮, 闫蕴韬, 桂金鑫, 李彬燕, 莫茜, 吴心成, 张海清, 贺记外

  水稻(Oryza sativa)种子耐贮性是粮食安全和用种安全的重要保障,发掘水稻种子耐贮性QTL位点并筛选优异的耐贮单倍型是水稻耐贮性遗传改良的基础。本研究以431份来自全球3 000份水稻(3K水稻)资源的核心种质为研究材料,2019和2020年分别在湖南长沙和海南三亚进行分期播种,使得各试验材料成熟期基本保持一致。收获的种子经自然贮藏和人工老化处理后进行耐贮性鉴定,结合基因型数据进行水稻种子耐贮性全基因组关联分析(genome wide association study, GWAS),以P<1×10-4为阈值,重复检测到14个耐贮性QTL位点,分布在水稻2、3、5、8、9、10、11和12号染色体上,解释的表型变异为5%~24%,qSS3-2和qSS5-2为新QTL。在这14个QTL区间内共挖掘到17个与水稻种子耐贮性相关的候选基因,对qSS5-2区间内的候选基因进行单倍型分析,鉴定到了8种水稻种子耐贮单倍型。本研究结果为水稻耐贮性遗传改良提供理论参考与重要基因资源。

• 马铃薯锌转运体基因StZnT2生物信息学及表达特性分析

  尹科, 赵婧, 唐勋, 赵贵宾, 朱永永, 党伟英, 张宁, 司怀军

  锌是植物生长发育所必需的微量元素,缺锌或过量锌都会严重影响植物生长,锌转运蛋白对调节植物体内锌稳态具有重要作用。本研究以马铃薯(Solanum tuberosum)栽培品种'大西洋'试管苗为实验材料,克隆得到马铃薯锌转运体2 (Solanum tuberosum zinc transporter 2, StZnT2)(GenBank No. XM_006358632.2)基因。结果表明,该基因全长1 294 bp,CDS长1 011 bp,编码336个氨基酸,蛋白相对分子量为36 682.78 kD,理论等电点为5.63,属于疏水性跨膜蛋白,具有典型的ZIP保守结构域;亚细胞定位结果显示该蛋白定位于细胞膜上。同源蛋白比对分析表明,StZnT2基因编码的蛋白质与潘那利番茄(S. pennellii)、番茄(S. lycopersicum)和科民茄(S. commersonii)相似度最高。马铃薯在缺乏锌和过量锌培养条件下均表现出植株矮小、根系伸长受到抑制。实时荧光定量PCR分析不同锌浓度胁迫下基因的表达模式,结果表明,StZnT2在缺锌和过量锌胁迫下表达量均上调,且在根中表达水平最高。本研究结果为进一步阐明马铃薯StZnT2基因功能提供理论依据。

• 棉花GhGGB基因互补表达载体的构建及其抗旱性分析

  胡子曜, 阿尔祖古丽·塔什, 雷建峰, 代培红, 柳建飞, 邓嘉辉, 刘超, 刘晓东, 李月

  GGB (geranyl geranyltransferase beta)基因编码Ⅰ型蛋白香叶酰基转移酶,参与蛋白异戊二烯化修饰,在植物响应逆境胁迫过程中具有重要的调控作用。为探究棉花(Gossypium hirsutum) GhGGB基因的生物学功能,本研究构建植物互补表达载体pBI101-AtGGBP-GhGGB-AtGGBT并转化拟南芥(Arabidopsis thaliana) ggb突变体,筛选获得GhGGB转基因株系。检测自然干旱胁迫下GhGGB转基因株系、拟南芥ggb突变体和野生型拟南芥Col-0的表型和生理生化指标。结果显示,以野生型拟南芥Col-0为对照,转基因GhGGB植株对干旱胁迫的敏感性显著增强,而ggb突变体植株则表现出了更强的抗旱性,各组分生理指标的测定结果与表型一致,表明GhGGB基因互补了拟南芥ggb突变体的功能缺失,降低了耐旱性。本研究结果初步表明GhGGB是一个抗旱负调控基因,为棉花抗旱种质培育提供新的基因选择。

• 木豆MYB-related亚家族基因鉴定及干旱胁迫下CcMYB-R48的功能解析

  张修齐, 董碧莹, 宋治华, 杜婷婷, 李娜, 薛婧怡, 曹红燕, 王天翼, 宋洋波, 孟冬, 杨清

  木豆(Cajanus cajan)是药食两用的木本豆科植物,含有丰富的活性物质,具有极高的经济价值。包括干旱和病害在内的非生物和生物胁迫是造成木豆减产和品质下降的重要因素,因此,挖掘木豆抗逆关键基因并分析其功能是木豆育种研究的重点。作为MYB (v-myb avian myeloblastosis viral)家族转录因子中的重要成员,MYB-related (MYB-R)亚家族基因被认为在逆境胁迫中发挥着重要作用。本研究通过生物信息学方法,利用拟南芥(Arabidopsis thaliana) MYB-R亚家族基因在木豆基因组中进行序列比对,筛选出48个CcMYB-R家族基因(CcMYB-R1~CcMYB-R48)。转录组数据分析发现,CcMYB-R48基因在脱落酸(abscisic acid, ABA)与茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)胁迫处理下都显著上调表达且表达量较高,说明其可能在木豆的抗逆应答和激素诱导下发挥重要功能。克隆并分析CcMYB-R48基因发现,其具有1个典型的MYB功能域,与拟南芥AT1G19000、AT1G74840同源性较高。实时半定量PCR (semi-quantitative RT-PCR, SqRT-PCR)检测发现,CcMYB-R48在干旱胁迫6和12 h的条件下均显著上调表达,而在高温胁迫6和12 h的条件下则无差异,说明其可能参与木豆抵御干旱的过程。构建CcMYB-R48过表达载体,并利用木豆瞬时转化系统在木豆植株中过表达CcMYB-R48,结果显示,在干旱条件下,过表达植株具有较低的死亡率(19.44%),其电导率、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和过氧化物酶(peroxidase, POD)含量均显著低于对照植株,表明CcMYB-R48能够增强木豆的抗旱能力。本研究对进一步探究木豆CcMYB-R亚家族基因及其抗旱机制,开展分子抗逆育种工作都具有重要意义。

• 葡萄G2-like转录因子家族的鉴定及在穗梗褐变过程中的表达分析

  李志谦, 邹东方, 李靖雯, 叶霞, 冯建灿

  Golden2-like (G2-like)转录因子在植物叶绿体发育、叶绿素积累、光合作用和衰老过程中发挥着重要作用。为探究G2-like转录因子在葡萄(Vitis vinifra)生长发育过程中的功能,本研究利用生物信息学方法鉴定了葡萄中G2-like转录因子家族,在聚类、保守结构域和共线性分析基础上,对其在葡萄不同组织及穗梗褐变过程中的表达量进行了测定。结果显示,在葡萄基因组中共鉴定到43个G2-like转录因子基因,分为6个亚家族,不均匀地分布在葡萄的17条染色体上。葡萄和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中存在34对同线基因,5个片段复制和1个随机复制,且存在Myb DNA-binding保守结构域。qPCR结果显示,在葡萄穗梗褐变过程中,VvG1、VvG28、VvG43、VvG2、VvG14、VvG6和VvG24基因的表达与叶绿素含量的变化呈正相关,而VvG27基因的表达与叶绿素含量的变化呈负相关。研究结果表明,G2-like基因可能参与葡萄的器官发育和穗梗褐变过程。本研究为进一步探讨研究G2-like基因功能提供了参考依据。

• 刺梨CaM基因的鉴定及其在果实中的表达特点

  赵熳秋, 南红, 鲁敏, 安华明

  钙调蛋白(calmodulin, CaMs)是植物主要的钙结合蛋白,在植物体内参与广泛的生理过程。本研究从刺梨(Rosa roxburghii)全基因组水平鉴定出2个编码CaM蛋白的基因,分别命名为RrCaM1 (GenBank No. ON886228)和RrCaM2 (GenBank No. ON886229),均含有4个典型的EF-hand功能域。其中RrCaM1基因含有3个内含子,而RrCaM2基因无内含子,分别定位于3号和4号染色体上。系统发育及共线性分析表明,刺梨CaM与白梨(Pyrus bretschneideri)、草莓(Fragaria vesca)之间的亲缘关系较近,RrCaM1和RrCaM2可分别聚于2个不同的亚类,且RrCaM1和RrCaM2分别与草莓有1个直系同源基因,而RrCaM1与白梨有2个直系同源基因。RNA-Seq与qPCR结果均表明,RrCaM2基因表达量随刺梨果实发育显著下降(P<0.05),RrCaM1则相反。顺式作用元件预测RrCaM1的启动子区包含激素、光等8类响应元件,而RrCaM2缺少响应赤霉素、低温、干旱等的顺式作用元件;外源激素处理的结果证实,2个成员对水杨酸(salicylic acid, SA)、脱落酸(abscisic acid, ABA)和赤霉素(gibberellin, GA3)等外源激素处理呈现不同的表达模式。钙调蛋白抑制剂(chlorpromazine, CPZ)处理显著抑制RrCaM表达并降低了刺梨果实维生素C (ascorbate, AsA)的合成,且与AsA合成相关基因(L-galactose phosphatase, RrGPP)和AsA循环基因(dehydroascorbate reductase, RrDHAR)的表达量呈显著正相关(P<0.05),提示其可能参与了刺梨果实AsA积累的调控。本研究发现,RrCaMs基因家族在刺梨果实发育、AsA积累与激素响应中具有潜在的重要作用,为该基因家族的功能研究提供了参考。

• 钩藤不同部位总RNA提取及UrSTR基因的克隆与表达分析

  穆德添, 万凌云, 韦树根, 吴长桥, 潘丽梅, 柳亦松, 田艺, 付金娥, 唐其

  钩藤(Uncaria rhynchophylla)为我国常用大宗中药材之一,主治头痛眩晕、阿尔茨海默和高血压等症,其有效成分主要为萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids, TIAs)。异胡豆苷合酶(strictosidine synthase, STR)是TIAs生物合成途径中的关键酶,目前在钩藤中还未见报道。为了寻找参与钩藤TIAs生物合成的STR基因,本研究采用LC-MS法测定钩藤的根、叶片、茎钩、蒴果等不同部位中钩藤碱和异钩藤碱的含量,比较筛选4种总RNA提取方法。全长克隆了1条可能参与钩藤TIAs生物合成的候选基因UrSTR,并进行了生物信息学分析,利用qPCR分析了UrSTR在钩藤不同部位中的表达模式。结果表明：(1)通过LC-MS法测定,钩藤碱与异钩藤碱在钩藤蒴果中含量最高,根中含量最低。(2)改良CTAB法为钩藤不同部位总RNA的最佳提取方法。(3) UrSTR基因全长为1 122 bp,编码一条374个氨基酸的肽链,具有跨膜螺旋结构,理论分子量为41.446 kD,理论等电点为7.549,在进化分析中发现,其与阿拉比卡咖啡(Coffea arabica)和中果咖啡(C. canephora)的STR基因聚为一类,亲缘关系较近。(4) qPCR结果显示,UrSTR基因主要在钩藤蒴果中表达,根中的表达量最低。通过分析发现,UrSTR基因的表达量与钩藤碱/异钩藤碱含量的趋势一致,提示UrSTR基因可能是钩藤STR候选基因之一,参与了TIAs的生物合成。本研究为UrSTR基因的功能验证和钩藤生物碱合成途径的解析提供了参考。

• 基于蛋白组学鉴定猪精子中的性染色体基因表达及其生物学功能

  石咏, 刘怡冰, 刘华涛, 王楚端, 邢凯

  动物的性别控制在畜牧生产中有着重要意义,性控精液在生产中是控制家畜后代性别比例常用的商品,现有性控精液的商用多集中用于奶牛(Bos taurus),其在奶牛良种扩繁中有重要作用;流式细胞仪分选是主流的性控精液的分选方法,但分选过程中对精子的机械损伤和分选后精子活率降低都不可避免,因此利用免疫学方法分选X/Y精子是理想的方法;随着蛋白质组学技术进步,探索猪精子中的蛋白质组成也成为可能。本研究为了明确猪(Sus scrofa)精子中性染色体上蛋白编码基因并分析其生物学功能,寻找猪精子中可能用于性别控制的抗原,收集10只健康种公猪的精液,利用流式细胞仪去除精浆并把精子分离成X/Y精子,通过Label-free蛋白组学技术对分离的猪精子中的蛋白质表达进行定性、定量分析,将其中分布于性染色体上的表达基因提取出来,并进行生物学功能分析,同时将得到的性染色体上表达的蛋白质通过TMHMM 2.0进行跨膜区预测,利用WoLF PSORT进行亚细胞定位预测,利用SignalP 5.0进行信号肽预测,并对筛选得到的部分抗原进行验证。蛋白质组测序共得到蛋白1 925个,肽段13 558个,蛋白质对应的基因有2 976个,其中有67个性染色体基因表达蛋白质,包括65个X染色体基因和2个Y染色体基因。将性染色体上表达的基因进行GO和KEGG分析发现,其主要参与了精子运动相关的能量产生通路。预测到45个蛋白含跨膜结构,47个蛋白位于细胞质膜上或细胞外,28个蛋白能产生信号肽(secretory signal peptides /signal peptides, Sec/SPI),筛选出脱氧核糖核酸酶1 (deoxyribonuclease like 1, DNASE1L1)、 ATP酶H+运输辅助蛋白1 (ATPase H+ transporting accessory protein 1, ATP6AP1)、四跨膜蛋白6 (tetraspanin 6, TSPAN6)、NADH：泛醌氧化还原酶亚基A1 (NADH: ubiquinone oxidoreductase subunit A1, NDUFA1)、磷酸核糖焦磷酸合成酶2 (phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2, PRPS2)、NADPH氧化酶重链亚基(NADPH oxidase heavy chain subunit, GP91-PHOX)、B细胞受体相关蛋白31 (B cell receptor associated protein 31, BCA31)、精子顶体相关5 (sperm acrosome associated 5, SPACA5)、TIMP金属肽酶抑制剂1 (TIMP metallopeptidase inhibitor 1, TIMP1)、过氧化蛋白4 (peroxiredoxin 4, PRDX4)和载脂蛋白O样(apolipoprotein O like, APOOL)作为候选抗原,选取ATP6AP1、NDUFA1、PRPS2、GP91-PHOX和TIMP1进行Western blot验证。本研究为探讨猪精子中性染色体上表达的基因和猪精液性别控制的方法提供了参考。

• 基于转录组测序的ITGAD基因InDel位点鉴定及其与山羊生长性状的关联性分析

  吴贤锋, 王金宝, 刘远, 池春梅, 黄勤楼, 李文杨

  β2整合素αD (β2 integrins αD, ITGAD)是一种异二聚体细胞表面受体的亚基,在调控脂肪新陈代谢和血糖平衡中发挥重要作用。为了加快山羊(Capra hircus)生长性状选育的遗传进展,为山羊生长性状的标记辅助选择(marker assisted selection, MAS)提供理论依据,本研究利用DNA池技术和高分辨率熔解曲线(high resolution melting, HRM)分析技术,检测了ITGAD基因在3个山羊品种(共355只)的插入/缺失(Insertion/Deletion, InDel)多态性,并分析其与山羊生长性状之间的关联效应。结果表明,检测到1个山羊ITGAD基因第15个内含子的新InDel位点(NC_030832.1: g.15243_15244 ins C),其多态信息含量(PIC)为0.289~0.369,并且该位点在3个品种中都处于哈迪-温伯格平衡状态;在与生长性状的关联分析中,该位点与福清山羊的尻宽和简阳大耳羊的体高、体长和胸围均显著相关(P<0.05),与简阳大耳羊的胸深、胸宽、管围、尻宽和管围指数极显著相关(P<0.01),并且II基因型个体显著优于DD基因型。本研究发现ITGAD基因InDel位点与山羊生长性状有显著的关联效应,为山羊生产性状的分子遗传标记选择提供参考依据。

• 瓦氏雅罗鱼Commd9基因的克隆及其在碱度胁迫下的表达分析

  罗亮, 常玉梅, 孙博, 张立民, 陈炯, 梁利群

  铜转运Murr1结构域(copper metabolism Murr1 domain, COMMD)蛋白家族在生物体中广泛存在,参与机体核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)活性调节、钠转运、铜代谢以及缺氧的适应性调节等生物学过程。为研究Commd9在碱度胁迫下的作用,本研究采用cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术,首次对具有耐高碱特性的瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii) Commd9基因cDNA全长进行了克隆,命名为LwCommd9基因(GenBank No. MT013199)。该序列全长为938 bp,5'和3'非编码区分别为5和339 bp,开放阅读框为594 bp,编码蛋白含197个氨基酸,预测分子量为21.79 kD,理论等电点为5.63。系统发育分析显示,瓦氏雅罗鱼COMMD9氨基酸序列与鲤科鱼类的相似性较高,其中与鱇浪白鱼(Anabarilius grahami)相似性高达93.37%。qPCR发现,LwCommd9基因在各组织中均有分布,在肝和肾组织中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。高碳酸盐碱度胁迫下,LwCommd9基因在碱水种群瓦氏雅罗鱼肝组织中的表达量极显著下调(P<0.01),而在淡水种群瓦氏雅罗鱼肝组织中的表达量极显著上调(P<0.01),在肾组织中也有相同变化趋势。综上所述,LwCommd9基因在瓦氏雅罗鱼高碱适应过程中可能起到了关键作用,这将为后续鱼类耐高碱机制研究提供参考。

• 转录组测序揭示棘胸蛙棘刺季节性变化的分子机制

  胡一斌, 蒋泽元, 周奕言, 赵晓蕊, 章书声, 郑荣泉

  棘胸蛙(Quasipaa spinosa)作为我国特有的经济两栖动物,兼具食用和药用价值。雄性棘胸蛙胸部的棘刺作为蛙类的性二态特征,对于提高抱对成功率有着重要意义,同时也是棘蛙类群的重要鉴别特征,对其产生和变化的分子机制研究,有助于阐明两栖动物棘蛙类群的系统进化关系。为了探究棘胸蛙棘刺季节性变化的分子机制,并挖掘棘刺形成的相关功能基因,本研究对雄性棘胸蛙繁殖期和繁殖后期胸部皮肤以及繁殖期腹部皮肤3组样本进行了高通量转录组测序,结果共获得100 312条Unigenes,进行注释后发现多种角质化蛋白基因在繁殖期雄性棘胸蛙的胸部皮肤中表达量显著升高。在繁殖期与繁殖后期胸部棘刺皮肤的差异表达基因(differentially expressd genes, DEGs)中含有与细胞凋亡、细胞增殖、性激素合成等相关的基因,KEGG通路富集分析显示,多个差异表达基因富集于皮肤角质层胞间脂质代谢相关通路中。推测繁殖期角蛋白基因表达增加是棘刺形成的主要原因之一,皮肤角质层中的脂类物质合成减少以及细胞增殖减慢会促使棘刺形态变小。另外,性激素合成相关的基因在繁殖期到繁殖后期中表达减少,说明棘胸蛙棘刺的季节性变化可能受激素变化的调节。通过qPCR技术验证15个差异表达基因,结果表明转录组结果可靠。本研究阐明了棘胸蛙棘刺形成和季节性变化的分子机制,研究结果为棘蛙类群分类提供依据,相关候选基因和代谢通路为其他脊椎动物皮肤衍生物的季节性变化和性二态特征的分子机制研究提供参考。

• GST-pull Down和免疫共沉淀联合质谱鉴定埃及伊蚊中肠的Cry4Ba和Cry11Aa互作蛋白

  王焌翔, 杨小祯, 何欢, 张灵玲, 关雄

  晶体蛋白(crystal protein, Cry)毒素是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)分泌的主要杀虫蛋白,其中Cry4Ba和Cry11Aa对埃及伊蚊(Aedes aegypti)幼虫具有特异的毒杀活性。Cry毒素作用于昆虫肠道上皮细胞需要细胞膜受体的介导,而昆虫肠道的免疫应答因子通过识别Cry毒素,进而驱动免疫系统抵御毒素的侵染。为了系统探究Cry4Ba和Cry11Aa毒素与埃及伊蚊的分子互作机制,本研究通过制备GST-Cry4Ba和GST-Cry11Aa融合蛋白,提取Cry4Ba和Cry11Aa晶体蛋白,利用GST-pull down和免疫共沉淀技术挖掘埃及伊蚊中肠刷状缘膜泡囊蛋白中与Cry4Ba和Cry11Aa互作的结合蛋白。通过液相色谱串联质谱鉴定和数据库比对,发现133个与Cry4Ba互作蛋白和237个与Cry11Aa互作蛋白。通过生物信息学分析,从中筛选到16个膜结合或跨膜蛋白,包括5个氨肽酶N、1个碱性磷酸酶、1个钙黏蛋白、2个α-淀粉酶、1个B型清道夫受体、2个电压依赖性阴离子通道以及4个肌动蛋白。此外,筛选到7个与免疫或维持细胞稳态相关蛋白,包括1个肽聚糖识别蛋白、1个载脂蛋白、1个血粘蛋白、1个丝氨酸蛋白酶抑制剂以及3个热激蛋白。本研究为后续埃及伊蚊Bt受体的功能验证以及免疫应答机制的研究提供必要的靶标参考。

• 植物病原真菌RNA甲基转移酶的筛选与分析

  贾明轩, 周贺, 王茂存, 孙菡笛, 程圳, 范永山, 巩校东, 谷守芹, 刘玉卫, 董金皋

  RNA甲基化是最主要的RNA修饰方式,而N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物mRNA最常见的一种转录后修饰,在生物生长发育过程中发挥重要的调控作用。作为RNA甲基化修饰的重要蛋白,RNA甲基转移酶在植物病原真菌中的功能尚未见报道。本研究利用生物信息学方法,对植物病原真菌RNA甲基转移酶的结构及功能进行了初步探究。结果表明,在106种植物病原真菌中,共鉴定到159个RNA甲基转移酶基因,通过理化性质分析可知,159个植物病原真菌RNA甲基转移酶编码氨基酸的平均长度约为470 aa (变化范围: 179~1206 aa),平均相对分子量约为52.64 kD (变化范围: 20.04~134.35 kD),平均等电点约为7.26 (变化范围: 4.90~10.28)。植物病原真菌RNA甲基转移酶的进化关系较为保守,相同门的植物病原真菌RNA甲基转移酶大体聚集在同一进化枝,且同一进化枝中蛋白保守基序的相似性较高。利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)方法对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)中编码RNA甲基转移酶(S. turcica RNA methyltransferases 1, StMETTL1)的基因在病菌不同发育时期的表达量进行分析发现,StMETTL1在侵染钉时期的表达量显著升高(P<0.05),推测StMETTL1可能在玉米大斑病菌侵染宿主过程中发挥了重要的作用。本研究为进一步了解m6A在植物病原真菌中的作用提供了数据支持。

• 鸭源鸡杆菌tolC基因序列特征分析、原核表达及免疫原性分析

  史姿聪, 刘盼盼, 王新卫, 翟雪滢, 陈桦源, 刘红英, 马立静, 杨霞, 陈陆

  tolC基因广泛存在于革兰氏阴性菌中,其表达的TolC蛋白(TolC family protein, TolC)是一种外膜通道蛋白,介导多种不同类型化合物的胞外转运过程,在细菌的生物学功能中发挥着重要作用。解析鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis) tolC基因特征及TolC蛋白的特性对于该病防控具有重要意义。为研究鸭源鸡杆菌tolC基因及其编码蛋白的结构特征和其作为抗原的潜能,本研究对28株鸭源鸡杆菌分离株tolC基因序列进行测定及系统发育分析;以PDS-RZ-1-SLG菌株为研究对象,利用生物信息学方法对TolC蛋白的理化性质及结构进行预测,并进行克隆、表达及抗原特性分析。结果表明,tolC基因在鸭源鸡杆菌中国分离株中普遍存在,全长1 371 bp,核苷酸序列高度保守,同源性为92.1%~100%,与鸡杆菌复合群(Gallibacterium genomosp) 1和2亲缘关系最近;TolC蛋白由456个氨基酸编码,理论分子质量为51.1 kD,是一个稳定的、亲水的α型分泌性膜蛋白,无跨膜结构域,但有1个信号肽序列和10个主要B细胞表位。SDS-PAGE和Western blot结果表明获得了约45 kD的重组蛋白,且该重组蛋白与鸭源鸡杆菌阳性血清可发生特异性反应,且能与TolC多克隆抗体兔血清发生特异性结合,证实了TolC的反应原性与免疫原性。本研究为进一步研究TolC蛋白生物功能提供基础信息,同时为鸭源鸡杆菌新型疫苗的开发提供理论依据。

• 基因编辑在家禽转基因研究中的应用进展

  张宛玉, 郑喜邦

  家禽是重要的模式生物,在农业和生物医学研究领域发挥重要作用。近年来基因编辑工具TALEN和CRISPR/Cas9在家禽转基因领域得以成功应用。这些基因编辑技术可望用于提高家禽生产性能、研究病毒与受体之间的相互作用、研发病毒载体疫苗、改善动物福利、改善禽蛋消费的安全性、在卵白中生产药用蛋白和抗体等。本文综述了家禽基因编辑的途径及CRISPR/Cas9在家禽生产与育种以及基础研究领域的应用现状,并展望了未来家禽基因编辑的应用前景。本综述对利用基因编辑手段提高家禽生产性能和预防禽类病毒性疾病具有指导意义。

• 侵染西番莲的三种马铃薯Y病毒属病毒的广谱单克隆抗体制备及检测应用

  李雪, 李晋海, 王兰花, 戚朵, 郭萌萌, 周雪平, 吴建祥

  马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus, TelMV)、东亚西番莲病毒(East Asian passiflora virus, EAPV)和西番莲重型斑驳相关病毒(Passion fruit severe mottle-associated virus, PFSMaV)严重危害我国西番莲(Passiflora edulis)产业。迄今植物病毒没有有效的防治药剂,而病毒检测技术是植物病毒防控手段建立的关键。本研究利用田间采集的TelMV、EAPV和PFSMaV三种病毒复合侵染的西番莲,从病叶提纯病毒粒子,以混合病毒粒子作为BALB/c小鼠(Mus musculus)的免疫原,通过杂交瘤技术获得能特异、广谱检测这3种病毒的单克隆抗体。Western blot检测发现,研制的4株单克隆抗体能同时识别TelMV、EAPV和PFSMaV的衣壳蛋白。进一步以制备的病毒单抗为检测抗体,建立用于快速检测这3种病毒的血清学检测方法,即斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)和组织印迹酶联免疫吸附试验(Tissue print-ELISA)。特异性和广谱性测定结果表明,建立的2种血清学方法均能简单快速、特异灵敏、广谱高效地检测西番莲中的TelMV、EAPV和PFSMaV,而检测感染同属的李痘病毒(Plumpox virus, PPV)、马铃薯Y病毒(Potato Virus Y, PVY)、马铃薯A病毒(Potato Virus A, PVA)和芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)病叶、感染黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)和西番莲潜隐病毒（Passiflora latent virus, PLV)的病叶及健康西番莲叶片均呈阴性反应。灵敏度测定结果表明,Dot-ELISA方法检测病叶粗提液的灵敏度高达1∶20 480(W/V, g/mL)倍稀释,即绝对检出量为0.097 6 ng感病植物组织。田间样品的检测结果表明,建立的2种血清学方法能准确、广谱、灵敏地用于检测侵染西番莲的3种马铃薯Y病毒属病毒,其结果与RT-PCR的符合率达到100%。本研究为TelMV、EAPV和PFSMaV三种病毒的检测诊断、无毒种子种苗生产及其科学防控提供技术支持。