农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2025年第2期

• 玉米性别决定基因tasselseed10的精细定位及候选基因分析

  朱思颖, 朱婷婷, 李婷, 邓屏, 向晓芹, 王久光, 王国强, 刘朝显

  玉米(Zea mays)是研究性别决定分子机制的重要模式植物,雄穗和雌穗性别决定研究对改良玉米花序结构、提高产量具有重要意义。本研究利用甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)处理玉米自交系'B73'花粉鉴定到了1个玉米性别决定相关的雄穗结实突变体tasselseed10 (ts10)。在田间,ts10突变体营养生长正常,抽雄后雄穗主穗、侧枝中上部小穗的性别发生反转,产生大量花丝,而顶端小穗可正常散粉。扫描电镜观察发现,当雄穗花序分生组织长约12 mm时,小花呈现心皮化的结构。利用图位克隆的方法,把ts10基因定位于玉米1号染色体SSR标记PL4和PR5之间约600 kb的区间内;该区间有7个注释基因,通过测序发现仅有髓细胞组织增生7 (myelocytomatosis 7, ZmMyc7)基因序列产生了突变,其编码序列中的第1 594个碱基G转换为碱基A,导致编码蛋白的第532个氨基酸谷氨酸被替换为赖氨酸,进一步分析发现该突变位点位于ZmMyc7保守结构域HLH中。表达分析结果显示,ZmMyc7在玉米的根、茎、叶、雄穗、雌穗和籽粒中均有表达,其中在雌穗中表达量最高,其次是雄穗;除了叶,ZmMyc7在ts10和正常植株中根、茎、雄穗、雌穗、胚和胚乳中的表达无显著差异。亚细胞定位结果表明ZmMyc7在细胞核内发挥功能。本研究为丰富玉米性别决定分子机制提供了进一步的理论支持和基因资源。

• 玉米PRX基因家族的鉴定与表达分析

  郝立冬, 徐磊, 闫治斌, 李世风, 石运强

  Ⅲ类过氧化物酶(class Ⅲ peroxidases, PRXs)家族是高等植物特有的基因家族,广泛参与过氧化氢、酚类化合物和活性氧的催化过程。迄今为止,在玉米(Zea mays)全基因组水平对PRX基因家族的研究仍未见报道。本研究利用生物信息学方法在玉米全基因组水平对PRX基因家族进行分析,同时检测其在不同组织和胁迫条件下的表达模式。结果显示,玉米的90个ZmPRX基因不均匀地分布在10条染色体上,其中有12个基因组成了6个片段复制事件,15个基因组成了6个串联复制事件。系统进化分析可将该家族基因分为8个分支,同一分支的基因具有相似的基因结构和保守基序。顺式作用元件分析显示,在ZmPRX基因启动子区分布有激素响应、胁迫应答、生长发育、光响应以及通用元件等5大类元件。表达模式分析发现,ZmPRX基因的表达具有组织特异性,且在不同非生物胁迫条件下表达被显著诱导。此外,在干旱胁迫条件下,耐旱性较强的自交系54358中的ZmPRX基因表达量显著上升,提示该品种在抵抗干旱胁迫方面具备较强的能力。本研究为进一步研究玉米PRX基因的功能特点提供了理论基础。

• 叶面施硫对大蒜中大蒜素积累及其合成相关基因表达的影响

  张灯, 周蓉, 蒋芳玲, 白云赫, 陈敏涵, 吴震

  大蒜素是大蒜(Allium sativium)中重要的次生代谢产物,对大蒜的风味品质有着重要的影响。硫是植物生长所必需的大量元素之一,参与了大蒜素的合成。为明确叶面施硫对大蒜素积累及其合成相关基因表达的影响,本研究以大蒜品种'正月早' (大蒜素含量低)和'四六瓣' (大蒜素含量高)为材料,叶面喷施6 g/L硫酸钾溶液,测定大蒜素的含量并分析大蒜素合成相关基因的表达。结果显示,施硫后,2个品种大蒜鳞茎的鲜重显著提高,表明施硫促进了鳞茎的膨大;在鳞茎膨大期,2个品种大蒜鳞茎的大蒜素含量持续提高,表明施硫促进了鳞茎中大蒜素的积累。同时,施硫上调了鳞茎和叶片中大部分大蒜素合成相关基因的表达量。2个品种鳞茎大蒜素含量与大蒜素合成相关的谷胱甘肽合成酶1 (glutathione synthase 1,GSH1)基因AsGSH1a、AsGSH1b、AsGSH1c、AsGSH1d及蒜氨酸酶(alliinase, Aly)基因AsAly的表达水平呈正相关,其中大蒜素含量与AsGSH1d表达水平呈显著正相关,表明AsGSH1d可能在大蒜素合成过程中发挥重要作用。本研究为提高大蒜素的含量提供了理论依据。

• 辣椒CNGC基因家族鉴定及表达分析

  王田田, 常雪瑞, 王静

  环核苷酸门控离子通道(cyclic nucleotide-gated ion channel, CNGC)在植物生长发育及逆境胁迫响应中发挥着重要作用。为深入探究CNGC基因家族在辣椒(Capsicum annuum)中的功能，本研究对辣椒CNGC家族成员进行鉴定，并进行理化性质、亚细胞定位、系统进化发育、结构特征、启动子顺式作用元件及基因表达模式的分析。结果表明，在辣椒全基因组中，共鉴定出14个CaCNGC基因家族成员，在各条染色体上非均匀分布；CaCNGC家族蛋白理论等电点为8.64~9.61，分子量为72.87~91.49 kD，14个成员的不稳定系数均在40以上，总平均亲水性均为负值，表明其均为不稳定的亲水蛋白；所有成员均定位于质膜，具有跨膜结构；CaCNGC上游序列的各种顺式调控元件显示了其在响应激素变化和非生物胁迫等多种刺激中的可能功能；转录组数据分析显示，大多数CaCNGC基因家族成员在辣椒叶、花、果等组织中的表达量都很低甚至不表达，在低温、高温、脱落酸、赤霉素、过氧化氢、吲哚乙酸、茉莉酸和盐胁迫下都有表达；qRT-PCR分析显示，CaCNGC2、CaCNGC7和CaCNGC10基因在低温和高温胁迫下的表达持续上调，可能参与辣椒对温度胁迫的响应。本研究为进一步了解CaCNGC基因家族的功能提供了理论参考，为解析辣椒温度耐受性机制提供新的见解。

• 新疆野苹果PYL基因家族的全基因组鉴定与表达分析

  房震, 李静, 张凯, 马娟, 叶春秀

  植物激素脱落酸(abscisic, ABA)是调控植物生长和胁迫响应的关键激素,在调控种子休眠与萌发和生长发育中起关键作用,ABA受体PYR/PYL/RCAR (pyrabactin resistance / PYR1-like proteins / regulatory components of ABA receptor)蛋白作为ABA信号通路的核心组分之一,在ABA信号通路中发挥重要功能。本研究采用生物信息学方法和转录组测序对新疆野苹果(Malus sieversii) PYL家族成员进行全基因组鉴定,分析了PYL成员的染色体定位、进化关系、基因结构、蛋白基序、共线性、顺式调控元件以及在新疆野苹果不同器官中的表达模式和种子低温层积过程中的表达特征。结果显示,在新疆野苹果全基因组中共鉴定出14个PYL基因,分布在7条染色体上,且基因分布有成簇现象。系统发育分析将其分为A~E 5个亚组。家族成员含有0~4个内含子,这14个PYL基因编码蛋白均存在PYR_PYL_RCAR_like保守结构。顺式作用元件分析表明,在新疆野苹果PYL基因上游2 000 bp序列中,普遍存在数目不等、种类不同的参与激素响应、生长发育响应、非生物和生物胁迫响应的顺式作用元件。基因本体富集表明,MsiPYLs基因主要在脱落酸激活信号通路、调节磷酸酶活性和磷蛋白磷酸酶活性等方面起作用。KEGG通路分析显示,MsiPYL主要参与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路-植物和植物激素信号转导。MsiPYL基因家族在新疆野苹果6个不同器官中均呈组成型表达,生殖器官(花和果实)的表达水平显著高于营养器官(根和茎);RNA-seq和qRT-PCR检测结果显示,MsiPYL8 (MsiPYR1)在种子中的表达量最低,在种子低温层积下呈显著下调的趋势(P<0.05),可能是新疆野苹果响应种子萌发的重要候选基因。本研究为揭示MsiPYL基因家族在新疆野苹果种子休眠解除中的作用提供依据。

• 葡萄响应灰霉菌侵染的差异microRNA分析及抗灰霉菌相关基因的筛选

  牛丽丽, 周慧, 武云龙, 韩泽云, 曹红燕, 杜婷婷, 刘丽媛, 郗琳, 孟冬, 杨清, 宋洋波, 何坤祖

  MicroRNA (miRNA)介导的转录后调控在植物对病原体的反应中起着至关重要的作用。为筛选响应灰霉菌(Botrytis cinerea)感染的葡萄(Vitis vinifera) miRNAs,本研究使用灰霉菌孢子悬浮液侵染葡萄叶片,以此构建小RNA文库并进行高通量测序。结果表明,共获得响应灰霉菌的171个已知miRNA和251个新miRNA,其中53个miRNA接菌后表达具有差异,特别是miRNA399家族的miRNA399a、miRNA399b和miRNA399h,表达显著下调。对灰霉菌侵染后的叶片进行表型、病斑面积及致病率分析,明确了葡萄对灰霉菌的易感性。对上述3个关键miRNAs的下游靶基因进行预测,共获得了8个靶标基因。qPCR分析显示,miRNA399b和miRNA399h的靶基因在受到灰霉菌感染时均显著上调表达。本研究为进一步了解果树驯化过程中的灰霉病抗性反应以及选育抗病葡萄品种提供理论参考。

• 颠茄AbWRKY1基因的克隆与功能研究

  潘航, 穆德会, 杨嘉, 谭艾娟, 马炳南, 许国菊, 杨立航, 强玮

  颠茄(Atropa belladonna)是《中国药典》收录的托品烷生物碱(tropane alkaloids, TAs)商业药源植物,WRKY转录因子可能调控TAs的生物合成。本研究对颠茄中WRKY转录因子基因家族进行了组织表达、系统进化和诱导表达分析,筛选出正调控TAs生物合成的基因AbWRKY1,并鉴定了其功能。AbWRKY1具有和TAs合成途径基因相同的组织和诱导表达特征,特异性地在颠茄不定根中表达,并且受到钙通道抑制剂维拉帕米(verapamil)的诱导。AbWRKY1和其他物种具有次生代谢调控功能的WRKY聚在同一簇。AbWRKY1蛋白包含326个氨基酸,定位于细胞核。酵母单杂交显示,AbWRKY1能够和莨菪碱6β-羟化酶(hyoscyamine 6β-hydroxylase, H6H)基因启动子上W-box富集区发生相互作用。在颠茄中通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术抑制AbWRKY1表达使东莨菪碱和莨菪碱含量分别降低了44.91%和79.33%。超表达AbWRKY1显著提高了颠茄发根中东莨菪碱、山莨菪碱和莨菪碱3种药用TAs的含量,同时上调了4个TAs合成途径基因腐胺N-甲基转移酶(putrescine N-methyltransferase, PMT)、托品酮还原酶Ⅰ(tropinone reductaseⅠ, TRⅠ)、莨菪碱脱氢酶(hyoscyamine dehydrogenase, HDH)和H6H的表达量。本研究为阐明TAs生物合成的转录调控和颠茄分子育种提供了理论基础。

• 香猪CD2AP基因第1内含子282 bp插入/缺失结构变异介导的表达调控研究

  王丹, 冉雪琴, 王维, 牛熙, 李升, 黄世会, 王嘉福

  结构变异(structural variation, SV)可以通过影响相关基因的稳定性和表达调控来影响基因表型。为探究CD2相关蛋白(CD2-associated protein, CD2AP)基因内含子1中的282 bp结构变异在香猪(Xiang pig) (Sus scrofa)群体中的多态分布以及对CD2AP基因表达的影响,本研究以香猪、大白猪(Large White)为研究对象,采用PCR测序方法对该SV位点进行鉴定和基因分型,研究群体分布规律以及CD2AP基因结构变异与疾病的关联;采用生物信息学方法检测CD2AP基因内含子1中SV区间所包含的重复元件和转录因子结合位点;用qPCR和Western blot检测SV对CD2AP基因和蛋白表达的影响;通过构建pEGFP荧光表达载体检验CD2AP基因SV中功能元件短散在核元件(short interspersed nuclear element, SINE)对基因转录活性的影响。结果显示, CD2AP-I1-sv282结构变异片段长度为282 bp,区间存在1个260 bp的SINE元件,属于tRNA家族,位于猪基因组Chr7：42249739~42249998 bp,含有8个转录因子结合位点;在SINE元件序列片段中具有RNA聚合酶Ⅲ启动子和2个AluⅠ限制性内切酶识别位点。PCR扩增和测序分析表明,该SV在香猪和大白猪基因组中均呈现多态性,有II (纯合插入型)、ID (杂合型)和DD (纯合缺失型) 3个基因型,χ2检验表明,该SV在香猪和大白猪群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),香猪和大白猪群体之间的基因型频率差异极显著(P<0.01),D等位基因频率极显著高于I等位基因频率(P<0.001)。在肺部患病样本中,D基因型为优势等位基因;在肺部健康样本中,I基因型为优势等位基因;Kendall's tau-b相关性分析表明,该结构变异与猪的肺部疾病具有相关性,患病群体与DD基因型显著正相关。qPCR和Western blot检测发现,DD基因型的香猪脾脏中CD2AP基因的mRNA和蛋白的表达量极显著高于ID基因型(P<0.01)。针对SINE元件所在序列构建了pEGFP荧光报告载体,转染细胞后检测其荧光强度及蛋白表达量,结果显示,含SINE序列的表达载体细胞与不含SINE序列相比,荧光强度和EGFP蛋白的表达量均降低。上述结果表明,CD2AP基因内含子1中282 bp结构变异在猪群中存在,且均以缺失型为主,可以导致基因的表达发生上调,结构变异区域存在的SINE元件影响基因转录活性,CD2AP基因的结构变异与香猪易感肺部疾病存在相关性。研究结果对解析香猪疾病易感分子机制具有重要意义。

• 鸡PGC-1α基因真核表达载体的构建及其对脂类代谢的作用

  周博, 魏志恒, 刘世昊, 刘书鸣, 夏磊, 徐璐, 郁建锋, 顾志良

  过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α (peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1 alpha, PGC-1α)是一种转录共激活因子,参与调控体内各类能量代谢过程,对脂肪沉积起着关键作用。为探讨PGC-1α基因在鸡(Gallus gallus)脂质代谢中的作用和机制,本研究检测了PGC-1α基因在鸡12种组织中的表达情况,通过RT-PCR的方法,扩增并获得鸡PGC-1α基因CDS片段,构建真核表达载体,Western blot检测表达载体转染鸡肝癌细胞系(leghorn male hepatoma, LMH)后能否表达PGC-1α蛋白;过表达和敲低LMH细胞中PGC-1α基因后,油红O染色检测脂滴沉积变化,比色法测定总甘油三酯(total triglyceride, TG)含量的变化,qPCR检测对脂质代谢相关基因表达的影响。结果显示,PGC-1α基因在心脏组织中表达量最高,在腿肌、肾和脑组织中表达量较高;Western blot检测发现构建的过表达载体转染LMH细胞能成功表达融合蛋白;LMH细胞中过表达PGC-1α基因会使脂质沉积和TG含量极显著下降(P<0.01),而PGC-1α基因敲低后脂质沉积有增加趋势,且TG含量显著增加(P<0.05)。LMH细胞中PGC-1α基因过表达使得脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase, FASN)基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ)基因的表达极显著下调(P<0.01),乙酰辅酶A羧化酶α(acetyl-CoA carboxylase alpha, ACACA)基因的表达显著下调(P<0.05),磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1 (phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, PCK1)基因表达极显著上调(P<0.01);PGC-1α基因敲低使PCK1基因表达极显著下降(P<0.01)。上述结果表明,鸡PGC-1α基因可能是通过调节上述功能基因表达而发挥作用。本研究通过构建PGC-1α基因的过表达和敲低模型,揭示了该基因在鸡脂质代谢中的关键调控作用,尤其是通过调节FASN、PPARγ、ACACA和PCK1等基因的表达,影响脂质沉积和甘油三酯含量,表明PGC-1α基因可能在调控鸡体内脂肪代谢中扮演重要角色。本研究为深入理解PGC-1α在鸡脂质代谢中的功能机制提供了参考依据。

• 脂肪酸氧化参与鸡原始生殖细胞形成的功能研究

  王哲, 武嵘峰, 耿晴晴, 赵梓多, 吴一凡, 程富富, 席一凡, 陈欣雨, 王春慧子, 牛英杰, 左其生, 张亚妮

  禽类原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)具有能够从血液迁移而定植于生殖嵴的特点,因此PGCs不仅能替代受精卵开展遗传修饰,而且在禽类的种质资源保护和濒危物种的复原方面都具有重要的应用前景。现有的PGCs体外培养体系对于支持雌雄PGCs生长之间存在差异,满足不了PGCs在种质资源保护中的需求。针对这一问题,本研究以鸡(Gallus gallus domesticus) PGCs为研究对象,探究脂肪酸氧化(fatty acid oxidation, FAO)在PGCs形成中的功能,旨在为后续建立完善的PGCs体外培养体系提供理论参考。基于转录组学分析FAO在胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)向PGCs分化过程中的作用,通过CCK8与EdU实验探究FAO激活剂BMS-687453 (BMS)和抑制剂马来酸哌克昔林(perhexiline maleate, Per)的最适添加浓度;分别通过观察细胞形态、qRT-PCR检测FAO关键基因和PGCs特异标记基因的表达、间接免疫荧光和流式细胞分析等检测FAO在ESCs向PGCs分化过程中的作用。转录组学分析显示,参与FAO的相关基因在ESCs与PGCs中差异表达,且富集于生殖细胞分化相关通路(MAPK signaling pathway, GnRH signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway);qRT-PCR结果表明,乙酰辅酶A酰基转移酶2 (acetyl-Coacyltransferase 2, ACAA2)和烯酰辅酶A水合酶1 (enoyl-CoA hydratase 1, ECH1)在PGCs高表达。CCK8与EdU实验确定了BMS和Per的最适添加浓度分别为80和160 nmol/L。细胞形态观察结果显示,BMS组在培养6 d的细胞中,类胚体数目显著高于Per组(P<0.05);BMS组中鸡核糖核酸同源蛋白(chicken VASA Homolog, CVH)和酪氨酸激酶受体蛋白(c-Kit proto-oncogene receptor tyrosine kinase, C-KIT)的表达量显著高于Per组(P<0.05);间接免疫荧光和流式细胞分析结果显示,BMS组的DDX4阳性细胞数显著高于Per组(P<0.05)。以上结果表明,高水平FAO能够促进PGCs的形成。本研究为建立完善的体外培养家禽PGCs体系提供理论依据,有助于从细胞能量代谢的角度系统地阐明PGCs的发生机理。

• 大口黑鲈MyD88基因的克隆及其对NF-κB的激活作用

  高风英, 董浚键, 张赫桐, 李佳鑫, 朱芷琳, 孙成飞, 叶星

  接头蛋白髓细胞分化因子88 (myeloid differentiation factor 88, MyD88)通常参与白介素-1受体(interleukin-1 receptor, IL-1R)和Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)介导的核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)激活,在先天免疫中发挥重要作用。在本研究中,克隆了大口黑鲈(Micropterus salmoides) MyD88的全长cDNA,包含一个867 bp的ORF,编码288个氨基酸残基的肽。大口黑鲈MyD88的推测蛋白具有N末端死亡结构域和C末端TIR (Toll-like/IL-1)结构域,已知这些结构域是哺乳动物MyD88的重要功能结构域。大口黑鲈MyD88蛋白与其他脊椎动物具有较高的同源性(58.5%~99.3%)。系统发育分析显示,大口黑鲈MyD88与其他鱼类MyD88聚为一支。MyD88 mRNA在健康大口黑鲈的所有被检测组织中均有表达,在肝脏中表达量最高。为了探索大口黑鲈MyD88的先天免疫作用,研究了其在肠、鳃、脾、肾中,对聚胞肌酸(polyinosinic-polycytidylic acid, PolyI:C)和诺卡氏菌(Nocardia seriolae)刺激的基因表达谱。结果显示,在所有4种检测的组织中,2种免疫刺激剂均上调了大口黑鲈MyD88转录水平,其中受诺卡氏菌的诱导最强。肾组织中,MyD88在感染后9 d出现了最大上调,感染组表达量为对照组的8.5倍(P<0.05);在鳃组织中PolyI:C诱导启动最早,刺激后8 h,在鳃组织中实验组相对表达量为对照组的5.6倍。大口黑鲈MyD88分布于HeLa细胞质中。大口黑鲈MyD88的过表达可以激活NF-κB。这些结果为阐明MyD88在大口鲈鱼先天免疫中的作用提供了基础数据。

• 不同添加因子对杂交瘤细胞生长和抗体分泌的影响

  张松雨, 曾馨仪, 朱源涛, 李志远, 苏俊, 李秋艳

  杂交瘤细胞培养是单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)生产的重要方法之一。本课题组前期制备出猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的杂交瘤细胞单克隆抗体,本研究对杂交瘤细胞培养体系进行优化,在杂交瘤细胞培养体系中加入不同浓度的添加因子,包括谷氨酰胺(0~10 mmol/L)、抗菌肽(0~20 μg/mL)、人表皮生长因子(human epidermal growth factor, hEGF)(0~20 ng/mL)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)(0~20 ng/mL)和维生素C (vitamin C, VitC)(0~20 ng/mL),采用生长曲线绘制和ELISA方法探究添加因子对杂交瘤细胞生长和抗体分泌的影响。结果显示,谷氨酰胺和抗菌肽添加在第5天达到细胞密度的峰值,其中细胞密度最大的添加浓度为6 mmol/L谷氨酰胺和10 μg/mL抗菌肽;hEGF、bFGF和VitC添加在第4天达到细胞密度的峰值,其中细胞密度最大的添加浓度为10 ng/mL hEGF、20 ng/mL bFGF和20 ng/mL VitC。抗体效价检测结果显示,谷氨酰胺添加组在6 mmol/L浓度获得最高的抗体效价(1∶8000),抗菌肽添加组在10 μg/mL浓度获得最高的抗体效价(1∶16000),hEGF和bFGF添加组在5和10 ng/mL浓度均具有最高的抗体效价(1∶16000),VitC在10 ng/mL浓度获得最高的抗体效价(1∶8000)。本研究通过改变培养基成分提高杂交瘤细胞增殖能力和抗体分泌能力,为研发生产用杂交瘤细胞培养基提供技术支持。

• 层出镰刀菌分泌蛋白阿魏酸酯酶(FpESD)的鉴定及功能研究

  王艺潼, 李海博, 王雨晴, 吴志宏, 高贻宙

  层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)寄主范围广泛、为害严重,但对于其致病机制的认识尚不清晰。效应蛋白在病原真菌侵染过程中发挥重要作用,其预测、筛选及鉴定对探究病原真菌与寄主的互作机理具有重要意义。本研究基于层出镰刀菌的转录组测序结果,通过信号肽鉴定、跨膜域筛选、半胱氨酸数量分析及病原宿主互作数据库(Pathogen Host Interactions database, PHI-base)分析等流程,筛选出43个候选效应蛋白。针对其中1个候选效应蛋白阿魏酸酯酶FpESD (esterase D)展开了功能研究,通过酵母系统验证FpESD的分泌特性,结果显示,其N端20个氨基酸编码的信号肽具有分泌活性。通过同源重组法构建FpESD基因敲除突变体(ΔFpESD),并利用回补实验获得回补菌株(ΔFpESD-C),对其生长速率、产孢量和孢子长度进行测定,结果表明FpESD基因的缺失显著降低了菌株的生长速率和产孢量(P<0.05),敲除突变体分生孢子的长度明显变短。此外,在环境胁迫实验中,ΔFpESD菌株对CaCl2、MgCl2及刚果红的敏感性显著降低(P<0.05),表明FpESD参与调控层出镰刀菌对环境胁迫的响应。通过平板接种法测定ΔFpESD菌株对苜蓿(Medicago sativa)的致病力,结果显示,ΔFpESD菌株侵染后,苜蓿幼苗的病情指数显著低于野生型(P<0.05),表明FpESD正调控层出镰刀菌的致病性。本研究结果有助于解析层出镰刀菌的致病性分子机制,同时为层出镰刀菌效应蛋白的深入研究提供了思路。

• 抗革兰氏阴性菌抗菌肽PC的分子设计及其生物学活性分析

  赵璐, 方禹鑫, 李毓雯, 董娜

  随着饲料端禁抗令的颁布,在畜禽养殖过程中迫切需要一种可抑制革兰氏阴性菌的饲料添加剂,以减少此类细菌引起的疾病发生。本研究旨在设计一种能够专门抑制革兰氏阴性菌生长,而对革兰氏阳性菌生长无明显抑制作用的抗菌肽PC。以(RP)3WW(RP)3为抗菌肽的基本单元(其中P为脯氨酸, R为精氨酸, W为色氨酸),将衍生自向日葵(Helianthus annuus)的胰蛋白酶抑制剂(SFTI-1)结合环(CTKSIPPIC)添加到抗菌肽的氨基端。通过圆二色谱(circular dichroism, CD)检测了抗菌肽PC的二级结构,并进一步检测了抗菌肽PC的抑菌活性、溶血性、细胞毒性以及稳定性。在模拟膜疏水环境(trifluoroethano, TFE)下,抗菌肽PC呈现出α-螺旋结构。结果表明,抗菌肽PC对大肠杆菌(Escherichia coli)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等革兰氏阴性菌具有高效抑制活性。相反,对于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)等革兰氏阳性菌,抗菌肽PC并未展现出抑制活性,可促使细菌产生活性氧(reactive oxygen species, ROS),并具有较低的溶血活性和细胞毒性;抗菌肽PC在不同的盐离子浓度、血清浓度、不同温度和蛋白酶处理下仍保持较高的抗菌活性。本研究获得的抗菌肽PC具有抗革兰氏阴性菌的特性和较好的生物安全性及稳定性,具有成为饲用抗生素替代物的发展潜力。本研究为抗革兰氏菌的抗菌肽的设计和开发提供了参考。

• 猪抗病育种候选基因研究进展

  杨松柏, 黄菁, 段星, 汪涵, 周晓龙, 赵阿勇

  抗病育种是提高猪(Sus scrofa)对病原体感染抵抗力的重要手段,成功应用依赖于对宿主抗病候选基因的深入挖掘和研究。因此,鉴定优质抗病候选基因对抗病育种至关重要。本文总结了由几种重要病毒引发的猪传染性疾病的抗病候选基因研究进展,包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)、经典猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)和猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)。本文还讨论了抗病候选基因研究及其在育种实践中应用所面临的挑战,为我国猪抗病育种研究与实践提供参考。

• 植酸酶微胶囊酶制剂的研发及其植物促生作用研究

  张俐敏, 刘天一, 刘文佳, 徐畅, 莫继先

  土壤中磷元素多以植酸等络合形式存在,难以被植物吸收利用。通过植酸酶降解土壤植酸从而释放磷元素可有效解决这一难题。本研究从土壤中筛选出高产植酸酶菌株,通过响应面优化法对培养基成分和培养条件进行优化。用海藻酸钠(sodium alginate, SA)和CaCl2作为包埋剂和交联剂,将植酸酶制成微胶囊酶制剂,探究其储存稳定性及其对玉米(Zea mays)的促生效果。结果表明,筛选到的1株植酸酶产生菌经16S rRNA鉴定为波纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)。培养基成分和发酵条件优化后的发酵产植酸酶活性高达(435.70±1.87) U/mL,较优化前提高了82.16%。使用3% SA和3% CaCl2制备的微胶囊酶制剂具有成球性好、酶活力高的特点。在储存30 d仍然保留(85.63±1.73)%的酶活力。盆栽实验表明,微胶囊酶制剂使玉米苗干重、株高、根干重、根长和苗鲜重增加了48.59%~304.46%,对玉米具有显著的促生作用。本研究提供了1种植酸酶微胶囊酶制剂的菌种筛选、发酵优化及酶制剂的制备方法,对微胶囊酶制剂在农业生产和新型菌肥的广泛应用具有重要意义。

• 利用大肠杆菌-农杆菌-酵母三元穿梭载体快速构建辣椒斑驳病毒杭州分离株侵染性克隆

  赵薇, 张灿, 付康, 马宁, 葛家成, 孙凯, 俞晓平

  辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus, PepMoV)是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的成员,能够侵染辣椒(Capsicum annuum)、番茄(Solanum lycopersicum)等重要茄科作物。本研究利用小RNA测序技术,在浙江省杭州市的辣椒样品中成功检测到PepMoV。通过RT-PCR技术扩增其基因组,获得长度为9 640个核苷酸的全长基因组序列。为了克服PepMoV侵染性克隆构建过程中面临的大片段拼接困难及基因组含有大肠杆菌(Escherichia coli)致死基因等问题,采用酵母(Saccharomyces cerevisiae)体内同源重组技术,将5个DNA片段在酵母中一步组装成PepMoV病毒的全长侵染性克隆。重要的是,酵母质粒可以直接转化入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)并进行浸润接种,从而避免了大肠杆菌克隆步骤及其相关的毒性问题。结果表明,与传统的酶切连接方法相比,该构建策略将所需时间从数月缩短至仅1周,获得的PepMoV-HZ病毒侵染性克隆能够有效感染本氏烟草(Nicotiana benthamiana),并且发病症状明显。PepMoV病毒侵染性克隆的成功构建不仅为建立该病毒的快速检测方法提供了阳性样品对照,而且为深入研究该病毒的基因功能及其与寄主的相互作用机制提供了重要的实验材料和手段。

• 牦牛HMGN2多克隆抗体的制备及应用

  贾利毅, 潘阳阳, 王萌, 张晖, 李玉平, 徐子疆, 王军乾, 余四九, 王立斌

  高迁移率族核小体结合域蛋白2 (high mobility group nucleosomal binding domain 2, HMGN2)在哺乳动物胚胎发育过程中高度表达,可与核小体结合,改变染色体结构,参与调节细胞分化、胚胎发育等过程,为探究HMGN2蛋白在牦牛(Bos grunniens)子宫中的作用机理,本研究以牦牛为研究对象,克隆牦牛HMGN2基因并制备牦牛HMGN2多克隆抗体,通过qPCR检测HMGN2基因在牦牛不同时期子宫中的相对表达量;利用纯化的牦牛HMGN2重组蛋白免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus),通过A/G-Sepharose柱层析法纯化制备牦牛HMGN2多克隆抗体;利用Western blot检测HMGN2蛋白的表达,并通过免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测HMGN2蛋白的定位。结果表明,本研究成功克隆牦牛HMGN2基因(GenBank No. OR713742)并构建重组质粒pKMD-SUMO-HMGN2,诱导产生重组蛋白,符合预期结果。qPCR和Western blot的结果显示,HMGN2基因及蛋白在牦牛妊娠早期子宫中的表达量最高。IHC检测结果表明,HMGN2主要表达于子宫腺与子宫内膜。提示HMGN2可能在牦牛妊娠早期对胚胎的附植和胎儿的生长发育具有重要调节作用。以上结果表明,本研究所制备的牦牛HMGN2抗体可为进一步研究HMGN2蛋白的作用 机理提供基础资料。

• 稳定表达HPV16和18亚型抗原蛋白E7的肿瘤细胞模型构建及评价

  蒋昕, 胡莱茵, 宋亚雯, 孙静, 宋厚辉, 夏菁, 程昌勇

  人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)是一种常见的生殖道感染病毒,HPV16和HPV18与宫颈癌之间存在密切关联。目前全球共有6种预防性HPV疫苗获批上市,但是这些疫苗只有预防作用,不能用于已感染病例的治疗。因此,本研究以小鼠(Mus musculus)宫颈癌细胞系TC-1为基础模型构建HPV16 E7和HPV18 E7共同表达的TC-1-HPV18 E7细胞模型,并使用减毒单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)为载体的重组菌株疫苗LM-HPV18 E7递送肿瘤抗原,评价重组菌株疫苗在TC-1-HPV18 E7荷瘤小鼠模型中的治疗效果。结果表明,本研究成功构建了TC-1-HPV18 E7细胞模型和小鼠模型,TC-1-HPV18 E7荷瘤小鼠与TC-1荷瘤小鼠在成瘤过程中无差异;与TC-1荷瘤小鼠的肿瘤相比,疫苗LM-HPV18 E7对TC-1-HPV18 E7荷瘤小鼠的肿瘤具有显著的治疗效果,表明LM是一个具有开发潜力的活疫苗载体平台。本研究使以TC-1为基础的细胞模型的用途得到扩展,也为减毒单增李斯特菌作为治疗性疫苗载体的研究提供了参考。