农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2019年第6期

• CRISPR/Cas9技术在创制番茄雄性不育株系中的应用研究

  刘玉琛, 丘式浚, 金曼, 邓汉超, 尹梅, 陈竹锋, 周向阳, 唐晓艳

  杂种优势利用能极大提高番茄(Solanum lycopersicum)的产量、抗病及抗逆表现,是重要的育种手段。生产上以雄性不育系作为母本能减少人工去雄的工作量。然而,不育系的选育和转育通常需要较长的周期,限制了不育系的品种培育及推广应用。利用现代生物技术编辑番茄雄蕊发育相关重要基因,可以更好地解析番茄雄蕊发育的分子机制,缩短番茄不育系品种的育种年限。番茄中SlAP3 (Solanum lycopersicum APETALA3, SlAP3)是拟南芥(Arabidopsis thaliana)花器官发育APETALA3 (AP3)的直系同源基因,该基因突变导致番茄雄蕊发育异常,形成雄性不育表型。本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统,分别在番茄SlAP3的外显子上选择2个带有前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motifs, PAM)序列的靶点(Targ1和Targ2),构建入CRISPR/Cas9系统表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化获得番茄T0代转基因植株;通过PCR扩增2个靶位点周围DNA序列后回收条带测序鉴定,获得成功敲除的植株,并对其花器官表型进行观察。研究结果表明,2个载体分别获得20和18株转基因阳性苗,对Targ1和Targ2靶点的10株及9株植物进行克隆及序列比对分析发现,在PAM上游的1~9 bp的碱基处均发生不同的缺失突变,导致SlAP3蛋白序列上的氨基酸缺失及提前终止。植株花器官表型观察发现,纯合突变植株均发生了花瓣、雄蕊等花器官同源异型突变及器官数目减少的表型。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建的载体能够特异性地靶向编辑目的基因SlAP3,导致该基因突变,从而形成番茄雄蕊同源异型即雄性不育表型。研究结果为利用CRISPR/Cas9系统创制番茄雄性不育系材料提供了一定的理论指导和技术支持。

• 重穗型变异材料爪哇稻22的生理性状和遗传特性

  游慧, 向珣朝, 杨博文, 黎怀成, 许亮, 龙跃腾

  重穗型是超级稻(Oryza sativa)育种的主要目标之一,能使单株各产量因子达到最优配置,是实现单位面积高产的基础。重穗型变异材料爪哇稻22 (Oryza sativa ssp. javanica)是由香大粒(Oryza sativa ssp. javanica)自然变异产生,其生理性状和遗传特性的研究有助于明确其利用价值。本研究对爪哇稻22与其野生型香大粒的主要生理性状以及外观和蒸煮食味品质差异进行了比较,用20对典型的籼粳分型SSR标记鉴定其籼粳遗传特性,进行聚类分析并构建SSR指纹图谱,用分子标记Wx M1进行糯性鉴定。结果显示,爪哇稻22单穗重为7.70 g,为重穗型变异材料;与香大粒相比,虽然爪哇稻22的千粒重极显著降低(P<0.01),但其他生理性状显著改善,特别是实粒数、结实率和单穗重极显著提高(P<0.01),外观品质和蒸煮食味品质均有所改善,品质较好。籼粳遗传分析表明,爪哇稻22含粳型特异标记8对,含籼型特异标记12对;爪哇稻22为籼粳混合偏籼型,而其野生型香大粒为籼粳混合偏粳型。聚类分析结果显示,爪哇稻22与荆糯6号(Oryza sativa ssp. indica)同属一群,遗传相似系数为0.63;而其野生型与京糯8号(Oryza sativa ssp. japonica)同属一群,遗传相似系数为0.81。分子标记糯性鉴定显示,爪哇稻22蜡质基因第2外显子有23 bp插入,为wxwx基因型,是典型糯稻,其表观直链淀粉含量仅1.42%,比其野生型香大粒(3.80%)更低。比较变异材料和野生型的DNA指纹图谱可知,爪哇稻22发生了多位点变异。重穗型变异体爪哇稻22具有优良的生理性状,其遗传背景为籼粳混合偏籼特性,因此可作为优异种质用于超级稻选育和籼粳交的桥梁亲本。本研究结果在超级稻育种上具有一定的理论意义。

• 酵母双杂交系统筛选马铃薯StLURP1基因的互作蛋白

  房宸曦, 车妍, 廖钰秋, 王一凡, 张宁, 司怀军

  寄生霜霉菌响应迟发上调基因1(late up-regulated in response to Hyaloperonospora parasitica 1, LURP1)在植物抵御致病菌寄生霜霉菌(Hyaloperonospora parasitica, Hp)的反应和抗逆中起到关键作用。为了阐明马铃薯(Solanum tuberosum)LURP1基因的生物学功能并明确其在蛋白互作网络中的作用,本研究利用同源重组的定向克隆方式构建了其诱饵载体pGBKT7-StLURP1,并通过酵母(Saccharomyces cerevisiae)双杂交系统筛选马铃薯cDNA文库。结果表明,双杂筛选的阳性率约为70%,最终获得88个阳性克隆,经测序鉴定出12种含完整开放阅读框的StLURP1互作蛋白,互作的真实性通过回转实验进行验证。对互作蛋白进行Blast比对和基因本体注释(Gene Ontology, GO)分析,结果显示,StLURP1与甘油磷酸二酯酶、富脯氨酸蛋白、多酚氧化酶、肌动蛋白解聚因子、重金属离子转运蛋白及DnaJ家族蛋白等多种蛋白相互作用,可能参与植物脂类代谢、生物与非生物胁迫响应、肌动蛋白解聚、重金属离子解毒及蛋白质折叠等生物过程。本研究为进一步研究StLURP1基因的生物学功能与作用提供了理论依据。

• 大白菜软腐病抗性相关基因分子标记的开发

  陈昌龙, 赵雪, 孙旺旺, 李晓颖, 田宇, 李未然, 谢华

  细菌性软腐病对大白菜(Brassica rapa ssp. pekinensis)的危害严重,胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum, Pc)是主要致病菌。本研究基于大白菜软腐病防御反应相关基因,拟开发软腐病抗性基因的分子标记。首先利用生物信息学方法对具有自主产权的大白菜抗软腐病相关基因的表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)数据进行分析,设计合成56对特异性引物,在大白菜软腐病抗病材料(A19-2)和感病材料(A32-2)亲本间筛选有多态性的EST-PCR和EST-CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence)标记。在两亲本F1代自交产生的F2代群体中(142个单株),统计标记位点的基因型,进行标记的分离分析。56对设计合成的特异性引物均能在亲本中扩增出清晰条带,其中具有多态性的标记共鉴定出30个：11个EST-PCR标记,19个EST-CAPS标记(其中有9对引物和限制性内切酶的组合不唯一);14个显性标记,16个共显性标记。将上述30个标记位点在F2代群体142个单株中的基因型进行统计,结果显示符合3∶1或1∶2∶1分离比例的位点共有24个,频率为80%;表现偏分离(不符合孟德尔分离比, P<0.05)的位点有6个,频率为20%。本研究利用大白菜抗软腐病相关的ESTs资源,开发了EST-PCR和EST-CAPS分子标记,对于加速大白菜ESTs资源的开发利用、大白菜抗性基因定位和分子标记辅助育种技术等研究具有一定的意义。

• 彩色棉查尔酮合成酶基因GhCHS1的克隆和功能分析

  梁先利, 张丽清, 柯丽萍, 孙玉强

  查尔酮合成酶基因(chalcone synthase, CHS)是黄酮类生物合成途径中的第1个限速酶基因。为探讨彩色棉(Gossypium hirsutum)花青素通路中关键酶基因GhCHS与彩色纤维色泽形成的关系,本研究克隆了GhCHS1基因,采用病毒介导基因干涉(virus induced gene silencing, VIGS)技术,获得彩色棉棕絮1号GhCHS1干涉株系,使用qRT-PCR分析干涉株系不同发育时期纤维的GhCHS1基因表达水平,测定干涉株系的纤维、叶片及棉仁花青素含量。从已知棉属基因组筛选到CHS家族的24个成员,根据同源性可归属7个类型和6种三级空间结构类型,其中GhCHS1 (GenBank No. LOC107897841)在棕絮1号发育的纤维和叶片中优势表达。GhCHS1蛋白主要分布在胞液中,二级结构以无规卷曲和α螺旋为主。棕絮1号GhCHS1干涉株系不同发育时期纤维中GhCHS1基因表达水平显著降低(P<0.05),纤维色泽显著淡化变白,明显区别于野生型棕色纤维,GhCHS1基因的表达水平越低,纤维色泽越浅。花青素含量分析表明,纤维种皮和棉仁花青素含量越少纤维色泽越浅。该研究结果表明GhCHS1基因参与彩色棉植株体内和纤维中花青素的合成和累积,GhCHS1基因在纤维色泽形成中起着关键作用。本研究为开展彩色棉纤维色泽形成机理的研究提供了一定的理论基础。

• 乙烯处理水仙催多花技术和机理的研究

  申艳红, 姜涛, 赵湾湾, 阮蔚华, 张寒, 周斌, 陈红梅, 陈晓静

  花葶数量是衡量水仙(Narcissus tazetta var. chinensis)商品鳞茎品质的重要指标之一。传统的水仙鳞茎熏蒸方法由于不能严格控制乙烯浓度,导致花芽诱导效果不佳。本实验研发了乙烯处理水仙催多花技术,采用200 μL/L乙烯气体在密闭容器中熏蒸水仙三年生鳞茎两次,可使花葶和小花数量提高1倍。为探讨乙烯催多花的原因,测定了不同处理的生理生化指标,并将处理后1 d的样品分别进行了转录组测序。外源乙烯增加了可溶性糖与蛋白质含量,提高了过氧化物酶(peroxidase, POD)活性、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)和玉米素(zeatin, ZA)水平。对水仙鳞茎转录组测序,共获得了65 898个unigenes,其中对照55 793个unigene、1-甲基环丙烯(1-methylcyclopropene, 1-MCP)处理57 321个unigene、乙烯处理64 350个unigene。基因本体(Gene Ontology, GO)分析显示,外源乙烯处理提高了水仙鳞茎的活性,促进了GO term中大部分基因的上调表达。通过比较不同处理间基因的差异表达,筛选了62个候选基因,包含4个淀粉与蔗糖代谢途径基因、9个多胺合成与转运基因、11个木质素合成与转运基因、31个成花相关基因和7个其他调控基因。12个基因的qRT-PCR结果验证了RNA-Seq的正确性。这些差异表达基因在水仙花芽分化过程中可能具有重要作用。本研究在生理生化和分子水平对乙烯处理促进水仙鳞茎花芽分化机制进行了探讨,为进一步阐明水仙花芽分化分子机制和指导水仙提供了理论依据。

• 马尾松PmWRKY164基因的克隆及耐低磷功能分析

  王庆竹, 尚先文, 汤纬玮, 李慧平, 文晓鹏, 范付华

  WRKY转录因子在植物应答逆境胁迫中扮演了重要角色。本研究克隆了马尾松(Pinus massoniana)的PmWRKY164基因(GenBank No. MH579749),该基因的cDNA全长1 977 bp,开放阅读框(ORF) 1 164 bp,编码387个氨基酸,具有WRKYGQK七肽保守结构域和C2H2(C-X4-5-C-X23-HXH)锌指结构域,属于WRKY家族第Ⅱb类成员。系统进化树分析表明,PmWRKY164与红豆杉(Taxus wallichiana var. chinensis, AEW91476.1)、欧洲云杉(Picea abies, ACA04888.1)的亲缘关系较近;分别以2种不同磷(phosphorus, P)浓度下胁迫处理的马尾松cDNA作为模板,对PmWRKY164的时空表达进行分析,结果表明,PmWRKY164在马尾松根茎叶中均有表达,叶中表达量最高,呈上调表达,与超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、酸性磷酸酶(acid phosphatase, Apase)3种酶的活性表达具有较高的相似性;构建pBWA(V)HS-PmWRKY164植物过表达载体,经遗传转化获得20株PmWRKY164过表达转基因植株。选取T1代3个转基因株系(Line-2, Line-3, Line-8)和野生型(wild type, WT)烟草株系,用4种不同浓度的Hogland营养液进行磷胁迫,结果表明,在P2低磷(营养液磷含量0.1 mmol/L)胁迫下,除了丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量低于野生型之外,磷含量、Apase活性、POD活性及SOD活性在转基因烟草中均显著高于野生型(P<0.05);而正常磷P3 (1 mmol/L)及高磷P4 (10 mmol/L)条件下,转基因与野生型植株并无明显差异。本研究为进一步探讨PmWRKY164的功能,以及为马尾松耐低磷胁迫的分子机制提供新的信息与思路。

• 牦牛FABP3基因组织表达、多态性及其对胴体和肉质性状的影响

  胡江, 曹健, 张丽, 赵志东, 王继卿, 刘秀, 李少斌, 陈金林, 罗玉柱

  心脏型脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid-binding protein, FABP3)参与肌肉中脂肪酸吸收和胞内转运,通过影响肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量进而影响肌肉嫩度和多汁性。本研究采用qRT-PCR及单链构象多态性(single strand conformation polymorphism, SSCP)方法,检测牦牛(Bos grunniens)FABP3基因组织表达和突变位点,分析基因突变对胴体及肉质性状的影响。结果表明,甘南牦牛FABP3基因在16个检测组织中相对表达量依次为心脏>背最长肌>回肠>胰腺>盲肠>空肠>其他组织,且心脏中相对表达量显著高于其他组织(P<0.05)。牦牛FABP3基因5'-UTR、intron 1区各检测到1处突变,而intron 2区检测到5处突变;甘南牦牛5'-UTR-intron 1区突变影响胴体重、肌肉嫩度及熟肉率(P<0.05),等位基因B1能极显著增加胴体重、降低肌肉剪切力值(P<0.01),等位基因C1能极显著降低胴体重和熟肉率(P<0.01)。本研究为牦牛肉质性状分子遗传提供基础数据。

• 酿酒酵母甘露聚糖诱导绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1表达的信号通路研究

  金鑫, 张曼, 杨银凤

  β-防御素是机体的内源性抗菌肽。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甘露聚糖能够诱导绵羊(Ovis aries)瘤胃上皮细胞(ruminal epithelial cells, RECs) β-防御素-1 (sheep β-defensin-1, SBD-1)的表达,但是诱导机制尚不明确,限制了甘露聚糖制剂的开发利用。为了探讨丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号传导通路(p38, ERK1/2, JNK)和核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)通路是否参与甘露聚糖诱导绵羊RECs SBD-1的表达,首先利用qPCR和Western blot方法检测甘露聚糖对p38、ERK1/2、JNK和NF-κB表达的影响;然后用甘露聚糖分别刺激RECs 5、15、30、45和60 min后,通过Western blot检测p38、ERK1/2、JNK、IκB和p65的磷酸化水平;最后采用qPCR和ELISA方法检测p38、ERK1/2、JNK和NF-κB的特异性抑制剂对甘露聚糖诱导SBD-1表达的影响。结果显示,甘露聚糖刺激使RECs中p38、ERK1/2、JNK和NF-κB的mRNA水平以及p38、JNK、ERK1/2、IκB和p65的磷酸化水平均显著提高(P<0.01);同时,甘露聚糖刺激RECs不同时间可以使p38、ERK1/2、JNK、IκB和p65发生磷酸化;此外,p38、ERK1/2、JNK和NF-κB的抑制剂均能极显著降低甘露聚糖诱导SBD-1的表达(P<0.01),且p38抑制剂的抑制效果最明显。上述结果提示,酿酒酵母甘露聚糖诱导绵羊RECs SBD-1表达的过程可能由p38、ERK1/2、JNK和NF-κB信号通路共同调节,并且p38信号通路可能发挥更主要的作用。该研究探讨了甘露聚糖诱导防御素表达的机理,为解释甘露聚糖促免疫功能提供了新线索,也为更好地开发和利用甘露聚糖制剂提供了参考依据。

• 越背花毛蒙古马皮肤组织中色素生成相关基因TYR、TYRP1及DCT的表达分析

  赵若阳, 李超, 图格琴, 陶克涛, 拉希玛, 王文兴, 黄博光, 白东义, 芒来

  哺乳动物毛色形成的分子机制一直以来是动物遗传育种领域研究的热点,自然界中多种多样的动物毛色引起了许多研究者的兴趣,其中马(Equus caballus)的毛色种类繁杂,是马品种登记中不可或缺的一项内容,马毛色分子机理的研究一直以来非常重要。目前的研究大多为群体间的研究,鲜少有报道从个体毛囊色素合成的角度研究马毛色。越背花毛蒙古马(Tobiano Mongolian Horse)毛色特别,形成机理更加复杂。色素合成过程涉及的基因数量众多,调控网络复杂。其中酪氨酸酶基因(tyrosinase,TYR)、酪氨酸相关蛋白酶1基因(tyrosinase-related protein 1, TYRP1)及酪氨酸酶相关蛋白2基因(tyrosinase-related protein 1, TYRP2)(现称多巴色素异构酶(dopachrome tautomerase, DCT)),是色素合成通路中重要的3个下游基因。本实验采用石蜡包埋组织切片苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE staining)染色技术初步探究了越背花毛蒙古马毛囊结构及色素分布,qRT-PCR方法检测不同颜色部位TYR、TYRP1及DCT基因的表达差异,后续分别利用Western blot和免疫荧光技术对3个基因相应蛋白进行定量定位分析。结果显示,越背花毛蒙古马不同颜色(黑, 白)皮肤组织中色素分布明显不同,真皮层厚度不同,毛囊毛球直径有差异。3个基因的mRNA与蛋白表达量在不同颜色皮肤组织中的表达有明显差异,蛋白的表达基本定位于毛囊毛球的毛母质部位。最终得出结论,色素合成下游基因TYR、TYRP1及DCT的表达差异影响了越背花毛蒙古马不同颜色皮肤组织中的色素合成,对毛发色素沉积过程具一定的调控作用。本研究为深入研究越背花毛蒙古马毛色分子机理提供资料,并为其他哺乳动物毛色研究提供参考借鉴。

• 小鼠肌肉生长抑制素Y309和C310位点缺失突变对蛋白结构的影响

  陈晨, 朱琳, 周新宇, 白春玲, 郑重, 魏著英, 李光鹏

  肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)又名生长分化因子8 (growth-differentiation factor 8, GDF-8),是转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)家族成员之一,广泛参与机体生长调控过程。作为肌肉生长的负调控因子,MSTN基因突变会造成肌细胞过度增殖、肌纤维数量增加和肌纤维肥大。本研究通过测序技术及生物信息学方法,对小鼠(Mus musculus) MSTN基因Y309和C310位点缺失突变前后编码蛋白的多级结构及其功能进行预测分析。结果表明,MSTN基因突变小鼠第3外显子nt 175~180发生缺失突变,肌肉组织中MSTN基因mRNA表达量减少,MSTN蛋白表达量也减少,MSTN蛋白受体激活素Ⅱ型受体基因(activin typeⅡreceptor, ActR2b)表达量减少,与肌肉发育相关的成肌决定因子基因(myogenin determination, MyoD),生肌决定因子5基因(myogenic factor 5, Myf5)以及肌细胞生成素基因(myogenin, Myog)的表达量发生显著上调,表现出肌肉肥大的表型。分析突变后的MSTN蛋白结构发现,缺失Y(309)和C(310)位点两个氨基酸破坏了MSTN成熟肽的二硫键,β延伸链延长,蛋白结构改变。蛋白功能预测表明,在MSTN突变蛋白内缺失了一个蛋白结合位点,从而影响了其与受体的结合。本研究表明,小鼠MSTN第3外显子nt 175~180是影响MSTN蛋白功能的核心序列,缺失突变后会产生肌肉肥大的表型,为研究MSTN基因功能提供了良好的小鼠模型。

• 乌蒙凤鸡凤头性状与Hoxc8基因表达及其生长性能的相关研究

  陆静, 张勇, 骆科印, 白优, 张雄, 李泽润, 王天松, 莫先艇, 黄明捷

  同源盒基因C8 (homeobox gene C8, Hoxc8)对鸡(Gallus gallus)凤头性状有着重要调节作用,且凤头性状对鸡早期生长性能有显著影响。为研究乌蒙凤鸡Hoxc8基因表达量与凤头性状及其生长性能的相关性,本研究以乌蒙凤鸡为研究对象,测定不同凤头性状乌蒙凤鸡早期生长性能及Hoxc8基因表达量。研究结果显示,Hoxc8基因在成年有凤头乌蒙凤鸡各组织中均有表达,在凤头骨中表达量最高,在睾丸中表达量较高,在肾、胸肌、腿肌、胫骨和大肠中表达量居中,在心、肝、卵巢、脾脏中表达量较低(P<0.01);在24周龄有凤头乌蒙凤鸡头皮和背皮组织中,Hoxc8基因的表达量极显著低于无凤头乌蒙凤鸡(P<0.01);Hoxc8基因在不同性别乌蒙凤鸡各组织中呈差异表达：在24周龄乌蒙凤鸡中,公鸡头皮、背皮组织中表达量极显著高于母鸡(P<0.01);在成年有凤头乌蒙凤鸡中,公鸡胫骨、腿肌组织表达量高于母鸡,母鸡心、肝、下丘脑、垂体组织表达量高于公鸡;凤头性状对乌蒙凤鸡早期生长性能有影响,随着周龄的增长,有凤头乌蒙凤鸡体重、体斜长、胸深、胸宽、胫长指标生长趋势较无凤头乌蒙凤鸡好;有凤头和无凤头乌蒙凤鸡公鸡早期生长性能优于母鸡;出壳重较大的乌蒙凤鸡早期增重较好。上述研究结果表明,乌蒙凤鸡凤头性状与Hoxc8基因头皮、背皮组织特异表达有关,有凤头乌蒙凤鸡早期生长性能较好。本研究结果对乌蒙凤鸡的保种选育有一定指导意义。

• 草鱼PKMa基因SNPs筛选及与耐糖性状的关联分析

  樊佳佳, 唐小红, 白俊杰, 姜鹏, 马冬梅, 李胜杰

  丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)是糖酵解途径中最后一个关键限速酶,在动物糖代谢过程中发挥重要作用。研究发现,草鱼(Ctenopharyngodon idella)Ma型丙酮酸激酶基因(Ma-type pyruvate kinase, PKMa)的3'非编码区存在2个SNPs位点：T+1817C和G+1818T;两位点连锁组成3种单倍型：TG/TG、TG/CT和CT/CT(分别简称: AA, AB和BB)。为探究草鱼PKMa基因多态性对机体耐糖能力的影响,本研究设计低糖(low-glucose, LD)和高糖(high-glucose, HD)两种饲料养殖环境,比较3种PKMa基因型个体在不同糖水平下的生长性能。8周饲养实验结果显示：LD组草鱼生长速度快于HD组,其中LD组AA单倍型个体体质量分别比AB、BB单倍型增加4.9%和6.1%(P>0.05);HD组AA单倍型个体体质量分别比AB、BB型增加36.8%和30.4%(P<0.05),且比LD组AA单倍型增加6.7%。针对PKMa基因在脑组织特异表达,检测脑组织PK酶浓度,发现LD组PK酶浓度低于HD组;两组中AA单倍型样本PK浓度均高于AB和BB单倍型。研究结果表明,PKMa基因多态性与草鱼耐糖能力存在关联。饲料糖水平过高对草鱼生长有一定程度的抑制,但AA单倍型个体表现出较好的耐受性,推测该突变有助于提高草鱼PK酶的表达,从而更好地利用饲料中的糖源。该研究可为耐糖草鱼新品种(系)的选育提供候选分子标记。

• 纳米氧化锌对美国红鱼单核巨噬细胞的毒性效应

  张剑, 朱跃骅, 周妮妮, 费岳军, 刘莲, 钱云霞

  纳米氧化锌(zinc oxide nanoparticles, ZnO NPs)的广泛应用使生物更容易接触到纳米氧化锌及其不良影响。为探讨纳米氧化锌对美国红鱼(Sciaenops ocellatus)单核巨噬细胞(monocytes/macrophages, MO/MΦ)的毒性效应,使用不同浓度ZnO NPs(0, 12.5, 25, 50 μg/mL)对美国红鱼MO/MΦ进行不同时间(6, 12, 24 h)处理,用四唑盐(3-(4, 5-dimethyl thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)比色法、中性红(neutral red uptake, NRU)法和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放法测定细胞活性。在处理6 h后,用流式细胞仪检测细胞对ZnO NPs的摄取、细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平及细胞凋亡率;用qRT-PCR测定了Caspase 9 mRNA表达水平的变化。结果显示,与对照组相比,实验组表现为：1) MTT法检测的细胞活性和细胞对于中性红的摄入能力均随ZnO NPs浓度的增高和暴露时间的延长而降低;2) LDH的释放量会随着ZnO NPs暴露时间的延长和ZnO NPs浓度的增加而增多。3) 细胞对ZnO NPs的摄取量随浓度增加而增加;4) 细胞内ROS水平升高;5) 细胞凋亡率呈现增长的趋势;6) Caspase 9表达量均显著增高。上述研究结果表明,ZnO NPs与美国红鱼MO/MΦ活性存在浓度和时间-毒性依赖关系,ZnO NPs进入细胞后,细胞内活性氧水平升高,从而引起细胞凋亡,氧化应激可能是诱发ZnO NPs细胞毒性的主要途径。本研究为深入探讨ZnO NPs对水生生物的毒性效应提供了基础资料。

• 禾谷镰孢菌过氧化物酶家族基因的表达规律分析

  柳健虎, 张康, 藏金萍, 曹宏哲, 张靖, 邢继红, 董金皋

  过氧化物酶作为病原真菌抗氧化防御系统的主要组分,能够清除来源于植物体产生的活性氧(reactive oxygen species, ROS),促使病原菌成功侵染宿主植物细胞,禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)过氧化物酶(peroxidase,POX)的相关研究尚未见报道。本研究利用生物信息学手段搜索真菌过氧化物酶基因的数据库,获得了31个禾谷镰孢菌过氧化物酶基因,系统进化分析和保守结构域分析均将其分为18个亚家族。对过氧化物酶家族基因的表达模式进行分析,发现FgPOX (禾谷镰孢菌过氧化物酶, Fusarium graminearum peroxidase)-13、FgPOX-17、FgPOX-16、FgPOX-19等基因在菌丝和分生孢子中均具有较高表达水平,FgPOX-24、FgPOX-29在菌丝中表达水平较高,FgPOX-11、FgPOX-10、FgPOX-4、FgPOX-23在分生孢子中表达水平较高。对过氧化物酶家族基因在侵染过程中的表达规律进行分析,发现FgPOX-13在病菌侵染过程中表达水平明显升高并保持较高水平,FgPOX-17、FgPOX-28、FgPOX-30等基因在病菌侵染的早期表达水平较高,FgPOX-12、FgPOX-10、FgPOX-23等基因在病菌侵染的后期表达水平较高。进一步利用qRT-PCR技术对禾谷镰孢菌过氧化物酶家族基因在H2O2胁迫条件下表达规律进行分析,发现FgPOX-1、FgPOX-4、FgPOX-6、FgPOX-9、FgPOX-10、FgPOX-22、FgPOX-30的表达水平是正常条件下的20倍以上,FgPOX-9、FgPOX-13等随着H2O2胁迫时间的延长,表达水平明显增高,而FgPOX-1、FgPOX-21等随着H2O2胁迫时间的延长,表达水平明显降低。本研究明确了禾谷镰孢菌过氧化物酶家族基因数量、系统进化关系、保守结构域,以及在病菌不同组织、侵染过程和响应H2O2胁迫中的表达规律,为阐明禾谷镰孢菌过氧化物酶家族基因的功能提供了基础资料。

• 传染性法氏囊病病毒感染DF-1细胞的转录组学分析

  彭曦冉, 俞天奇, 张宜娜, 周继勇, 胡伯里

  传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)感染鸡(Gallus gallus)引起的IBD是一种严重的、高度传染的免疫抑制性疾病。为探索IBDV感染所引起的宿主细胞转录组变化,本研究以IBDV感染鸡成纤维细胞系DF-1,提取细胞总RNA,使用TruSeq® RNA LT Sample Prep Kit v2构建RNA文库,采用Illumina HiSeq 3000平台进行高通量测序,分析IBDV感染12 h引起的DF-1细胞转录组变化,筛选显著变化基因。实验结果显示,差异表达基因总共有3 417条,其中在IBDV感染组中相对高表达的基因有1 887条,相对低表达的基因有1 530条(差异倍数(Fold change, FC)>2且P≤0.05)。对差异基因进行基因本体(Gene Ontology, GO)注释及KEGG信号通路富集分析,发现IBDV感染能够引起DF-1细胞中免疫、凋亡、代谢等20多条信号通路发生显著变化;其中细胞免疫和细胞凋亡通路可能在IBDV感染和免疫调控机制中具有重要作用。随机选择9条差异表达基因进行qRT-PCR验证,变化趋势与转录组数据一致。本研究为揭示IBDV致病及免疫抑制的分子机制提供了参考信息。

• 传染性法氏囊病病毒感染DF-1细胞的lncRNA表达谱变化分析

  丁颖楠, 俞天奇, 张宜娜, 周继勇, 胡伯里

  传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是一种由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的急性、高度接触性的传染病,在易感雏鸡(Gallus gallus)群中发病率可达80%~100%,死亡率高达30%~35%。为探究IBDV感染所引起的宿主细胞内长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA)表达谱变化,本研究利用Illumina Hiseq 3000平台进行高通量测序,并对IBDV感染和未感染的鸡成纤维细胞系DF-1的lncRNA表达谱进行分析。结果显示,有958条差异表达的lncRNA,其中728条上调、230条下调。利用miRanda-aug2010软件预测差异lncRNA的靶基因,然后通过生物信息学方法对靶基因进行基因本体论(Gene Oncology, GO)注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)信号通路富集分析,结果显示,靶基因在免疫应答过程、细胞因子反应、细胞凋亡和核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)等生物学过程中显著富集,参与视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ, RIG-Ⅰ)信号通路、Toll样受体信号通路和细胞凋亡等通路。利用qRT-PCR方法对随机挑选的9条lncRNA进行验证,结果显示,其表达变化趋势与高通量测序数据一致。本研究对IBDV lncRNA表达谱进行分析,为深入探讨与IBDV发病机制相关的关键lncRNA分子作用机制提供了参考依据。

• 粪肠球菌源EndoE的重组表达及酶学性质研究

  韩小韦, 黄云娜, 牛毅男, 李学俊, 徐全乐, 陈鹏

  内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase, ENGase, EC3.2.1.96)是糖蛋白去糖基化重要的工具酶,其可以切割糖蛋白上N-连接的聚糖。本研究基于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)基因组数据,通过PCR扩增ENGase基因endoE (endoglycosidase E),并以同源重组方式构建表达载体pET-28a-endoE,实现了EndoE在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 Star (DE3)中的高效表达,并对EndoE去糖化的催化特性等进行了较为系统的分析。研究结果显示,重组EndoE在大肠杆菌中以可溶形式表达,经钴离子螯合层析与阴离子交换层析可获得高纯度的目标蛋白,产量为45.6 mg/L。去糖基化活性分析表明,重组EndoE能去除天然及变性核糖核苷酸酶B (ribonuclease B, RNase B)、鸡卵白蛋白(ovalbumin, Ova)和免疫球蛋白G (immune globulin G, IgG) N-连接的糖基侧链。基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱证实了EndoE对RNase B N-连接糖链的水解活性。EndoE在20~50 ℃和pH 4.0~6.0的范围内均具有良好的水解活性,并对100 mmol/L二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol, DTT)、1 mol/L NaCl和2% Triton X-100具有耐受性。EndoE较已报道的粪肠球菌来源的ENGase具有更为广泛的底物作用范围,是蛋白质糖基化分析中有潜在应用价值的工具酶。

• 猪体细胞克隆胚胎移植技术要点分析

  吴亚林, 李继良, 周伟良, 董树仁, 冯保亮, 刘志国, 牟玉莲, 李奎

  猪(Sus scrofa)胚胎移植技术作为转基因、基因编辑猪制备过程中的必备技术,对制备效率有着重要影响。本文对猪体细胞克隆胚胎移植过程中的关键技术环节：受体母猪选择、受体母猪发情与移植胚胎的同期性、胚胎移植操作方法、受体猪的麻醉方法、移植时间、移植胚胎的数量、受体手术后管理等方面的技术要点、操作经验以及研究进展做讨论分析,为猪体细胞克隆胚胎移植操作提供参考。

• 甘薯卷叶病毒LAMP快速检测技术的建立及应用

  李华伟, 刘中华, 张鸿, 许泳清, 李国良, 林赵淼, 许国春, 邱永祥, 纪荣昌, 罗文彬, 汤浩, 邱思鑫

  甘薯卷叶病毒(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV)是甘薯(Ipomoea batatas)生产上重要的病毒病之一,建立SPLCV快速检测方法,对该病的诊断及技术防控至关重要。本研究以甘薯卷叶病毒基因组的外壳蛋白基因(coat protein, cp)为靶序列,设计了一组环介导恒温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)特异性引物,以SYBR Green Ⅰ作检测指示剂,通过优化反应条件,建立了一种甘薯卷叶病毒的LAMP可视化快速检测方法,该方法在65 ℃的恒温条件下反应1 h完成检测。特异性检测结果表明,只有感染SPLCV的样品在指示剂的作用下呈现绿色,且扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带,而与感染其他甘薯DNA病毒、番茄黄花曲叶病毒(Tomato yellow mosaic leaf curl virus, TYLCV)、烟草曲叶病毒(Tobacco leaf curl virus, TLCV) 3种DNA病毒均无交叉反应,表明该方法具有较高的特异性;灵敏度检测结果表明,该方法的最低检测限为1 pg/μL基因组DNA,是普通PCR的10倍,说明该方法灵敏度较高。因此本研究建立的甘薯卷叶病毒环介导等温扩增技术具有扩增快速、特异性高、简便、不需要特殊仪器,肉眼可视化观察结果,适合田间甘薯卷叶病毒样品及基层部门的快速检测。