农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2023年第4期

• 小麦ABF/AREB/ABI5基因家族全基因组鉴定与表达分析

  郭树娟, 孙月, 郑昊元, 赵惠贤, 马猛, 刘香利

  脱落酸响应元件结合因子/脱落酸响应元件结合蛋白/脱落酸不敏感蛋白 5 (abscisic acid (ABA)- responsive element binding factors/ABA-responsive element binding proteins/ABA insensitive 5, ABF/AREB/ABI5)属于碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)转录因子A亚家族,参与植物 ABA 信号通路,调控下游基因表达,进而影响植物生长发育、逆境胁迫响应等。本研究对小麦(Triticum aestivum) ABF/AREB/ABI5 基因进行了全基因组鉴定,并对其基因系统进化关系、理化性质、基因结构、基因复制、启动子顺式作用元件及表达模式进行了分析。在小麦全基因组范围内共鉴定到36个TaABF基因,分布在除了7B外的小麦所有染色体上,且在第Ⅲ部分同源群上存在串联复制和片段复制事件。TaABF 编码区长度为672~1 191 bp,蛋白等电点为5.22~9.93,均为亲水性蛋白。根据系统进化分析可分为3组,每组中的TaABF 基因在结构和保守基序上表现出高度相似性。启动子顺式作用元件分析表明,TaABF 基因家族启 动子具有多种响应激素和非生物胁迫相关的顺式作用元件。转录组表达模式分析显示,不同TaABF基因呈现组织和发育时期差异性表达,多数基因在种子发育时期高表达;与拟南芥AREB/ABF亚家族同源的GroupⅠ中基因TaABF17、TaABF18、TaABF19 在干旱和盐胁迫下均上调表达。进一步利用 qPCR 对TaABF17、TaABF18、TaABF19 基因在ABA和干旱、盐处理下的表达进行分析,结果表明,ABA处理后TaABF18 显著上调表达,而 TaABF17 和 TaABF19 显著下调表达 ;干旱和盐处理后 TaABF17、TaABF18、TaABF19 基因都显著上调表达。本研究为小麦TaABF基因抗逆功能研究提供了基础资料。

• 转录组芯片分析发现雄性不育小麦BNS的乙酰辅酶A代谢途径缺陷

  付庆云, 杨靖, 孙海丽, 苏晴, 卫笑, 茹振钢, 李友勇

  BNS (Bai-nong sterility)是一个普通小麦(Triticum aestivum)的核型温敏雄性不育系,在杂交小麦研究中有重要价值。为揭示其不育生理机制,本研究采用 Affymetrix 小麦表达谱芯片检测 BNS 雄性不育 和雄性可育四分体时期、单核期花药及对应穗轴的转录组,分析差异探针谱生成的代谢网络。结果发现, BNS 可育花药上调表达探针基因生成的代谢网络中,形成乙酰辅酶 A 代谢子网络,完全不育花药中该代谢子网络缺陷,部分不育花药中缺少合成节点。乙酰辅酶 A 代谢子网络由乙酰辅酶 A 合成和代谢、酰基 辅酶 A 合成和代谢、硫酯合成和代谢 6 个节点组成,连接的代谢途径有激素代谢、蜡质代谢、氨基酸代谢、 ATP 合成、线粒体电子传递等,继而连接柱头、花药和花粉发育。乙酰辅酶 A 是细胞能量代谢的枢纽性物质,该代谢途径缺陷直接影响 ATP 等能量载体生成,从而影响小孢子发育。分别检测 BNS 不育株和可育株的花药、旗叶组织中 ATP 含量,发现不育花药中 ATP 含量比可育花药下降 10% 左右(P<0.01),不育旗叶中 ATP 含量比可育旗叶下降达 50% (P<0.01)。上述结果证实不育系在小孢子发育关键时期出现 ATP 供应短缺,推测乙酰辅酶 A 代谢缺陷是 BNS 雄性不育的重要生理机制。本研究为揭示 BNS 的不育发生 过程提供了重要线索,也为植物雄性不育能量供应短缺的形成提供了代谢依据。

• 海岛棉体细胞胚发育特异性基因GbLEC2启动子的克隆和活性检测

  赵雪, 柳涛, 黄明婧, 张佳伟, 姑扎丽努尔·吐鲁洪, 张霞

  在发育调控因子介导的植株再生过程中,发育调控因子的过量表达会引起植株畸形、花粉败育 等多重效应。寻找合适的启动子来驱动发育调控因子在植物中的恰当表达是获得发育正常的再生植株 的方法之一。B3 转录因子 LEAFY COTYLEDON2 (LEC2)在胚胎发育过程中特异表达,在种子成熟过程中发挥着重要的调控作用。本研究通过半定量 PCR 初步检测到海岛棉(Gossypium barbadense) GbLEC2 在 根、茎、叶和胚性愈伤组织中不表达或表达量微弱,而在球形胚、鱼雷胚和子叶胚中的表达量较高。生物信息学分析结果表明,GbLEC2 启动子序列中含有控制种子特异性表达的 Skn-1 和 RY repeat 顺式作用元 件。为了进一步研究 GbLEC2 启动子的转录特性,本研究借助瞬时转染法将 ProGbLEC2-1 (2000 bp)、ProGbLEC2-2 (1500 bp)、ProGbLEC2-3 (1000 bp)、ProGbLEC2-4 (500 bp)等 4 种不同长度的 GbLEC2 启动子片段转入海岛棉不同的组织细胞中。GUS 染色分析结果显示,ProGbLEC2-3 (1000 bp)和 ProGbLEC2-4 (500 bp)启动子片段仅在体细胞胚胎 发生时期有转录活性,这初步符合 Lowe 等对驱动“发育调控因子”表达的启动子要求。本研究克隆获得 的 GbLEC2 启动子片段有望作为一种新型候选启动子精准调控发育调控因子的表达,从而应用于发育调控因子促植株再生体系介导的新型海岛棉分子育种技术平台。

• 棉花Gols基因家族的鉴定及其在干旱胁迫应答中的功能研究

  古丽斯坦·赛米, 刘隋赟昊, 郑蓓, 陈永坤, 黄耿青, 赵惠新, 张经博

  棉子糖在植物应答非生物胁迫过程中发挥着重要的作用,肌醇半乳糖苷合成酶(galactinol synthase, Gols)是参与合成棉子糖的重要酶类。本研究在全基因水平上对Gols基因家族进行了鉴定和分析,在亚洲棉(Gossypium arboreum)和雷蒙德氏棉(G. raimondill)中分别鉴定出8个和7个Gols基因,在陆地棉(G. hirsutum)和海岛棉(G. barbadense)中均鉴定14个Gols基因。进化分析显示,Gols 基因家族可分为7个亚组。保守基序和基因结构分析显示,亲缘关系近的 Gols 基因之间的保守基序和基因结构也十分相似。启动子顺式作用元件分析显示,GhGols基因存在多个与非生物胁迫应答相关的顺式作用元件。组织表达模式分析显示,一些GhGols基因在特定的组织中优势表达。PEG处理下的表达分析显示,部分GhGols基因的表达受到 PEG 的显著诱导,其中GhGols6的表达受PEG诱导显著上调。qPCR结果显示 GhGols6 的转录水平也受到干旱胁迫的显著诱导(P<0.01)。进一步利用病毒诱导的基因沉默技术(virus induced gene silencing, VIGS)对 GhGols6 基因进行沉默,发现沉默 GhGols6 降低了棉花对干旱胁迫的耐受性,表明 GhGols6 是棉花干旱应答的正调控因子。本研究为后续深入研究Gols基因在棉花干旱胁迫应答中的功能提供了参考。

• 两个柑橘品种果实有机酸相关基因的差异表达分析

  王建辉, 杨鑫, 龚晓源, 余洁霖, 韩冬梅, 李凛, 李翔, 刘达玉, 李京晶, 唐江

  柑橘(Citrus)果实富含柠檬酸等营养成分。为了探究柑橘果实汁胞细胞中关键基因的转录变化对柠檬酸等品质相关代谢物积累的影响,分别对两个遗传相近的枸橼类柑橘品种'甜柠檬' (C. limetta) 与'尤力克' (C. limon)进行果实品质分析。转录组测序结果对比分析表明,两个品种的果实汁胞细胞之间 参与柠檬酸等代谢物的合成、分解、转运相关基因发生转录变化。在果汁可滴定酸含量差异显著的两个 柑橘品种之间发现了 4 044 个差异表达基因。对差异表达基因进行了 KEGG 代谢通路的富集分析。低酸型'甜柠檬'的汁胞细胞中上调的差异表达基因富集于 γ-氨基丁酸代谢(GABA shunt)等 24 个代谢通路 ;高酸型'尤力克'上调的差异表达基因富集于柠檬酸循环等 13 个代谢通路。在果实成熟期,两个品种之间的柠檬酸合成酶基因的相对表达量没有显著性差异 ;'尤力克'汁胞细胞中质子泵转运基因的相对表达量显著高于'甜柠檬',从而促进'尤力克'汁胞细胞中液泡的酸化。果实有机酸含量可能与柠檬酸分解、质子泵转运相关基因的上调表达有关。本研究为深入解析柑橘属果实的有机酸代谢机理提供了一定理论依据。

• 牡丹PsDXR和PsMCS基因的克隆、表达分析及亚细胞定位

  李紫瑶, 刘冰, 胡增辉, 吴静, 冷平生

  萜烯类化合物是牡丹(Paeonia suffruticosa)的主要花香成分,1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原酶(1- deoxyxylulose-5-phosphate reductoisomerase, DXR)和2-甲基赤藓糖-2,4-环二磷酸合成酶 (2-C- methylerythritol-2, 4-cyclodiphosphate synthase, MCS)作为2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate, MEP)途径中的关键酶,在植物萜烯合成中起着重要作用。为探究 PsDXR 和 PsMCS 基因在牡丹萜烯合成途径中的作用,本研究以牡丹'皇冠' cDNA为模板,克隆了 PsDXR (GenBank No. ON092613)和 PsMCS 基因(GenBank No. ON092614),对其进行了生物信息学分析和亚细胞定位,并通过 qRT-PCR 分析了其在牡丹'皇冠'不同花发育时期和组织中的表达。结果显示,PsDXR 和 PsMCS 基因 cDNA 编码全长分别为 1 401 和 702 bp,分别编码 466 和 233 个氨基酸。2 个基因编码的蛋白均为稳定亲水性蛋白,PsDXR 蛋白具有DXP_reductoisom 和 DXP_redisom_C保守结构域,PsMCS蛋白具有 MECDP 特有结构域。亚细胞定位结果显示 2 个蛋白均定位于叶绿体。PsDXR 和 PsMCS 基因在花的不同发育时期的表 达模式均为先升高后降低 ;在不同组织中,2 个基因均具有显著的表达差异性(P<0.05)。研究结果表明 PsDXR 和 PsMCS 基因在牡丹 MEP 代谢途径中可能起着重要的作用。本研究为牡丹在萜烯类物质的生物 合成中提供分子研究依据。

• 钩藤UrIO基因及其启动子的克隆与分析

  郑浩杰, 王晓红, 李永权, 李雪, 上官黎阳, 田宇航, 张明

  环烯醚萜氧化酶(iridodial oxidase, IO)属于 CYP76 家族 A26 亚家族,是萜类吲哚生物碱上游合成途径中环烯醚萜途径的第 4 步限速酶,能催化环烯醚萜生成 7 脱氧马钱子酸。本研究基于转录组数据注 释,克隆得到钩藤(Uncaria rhynchophylla) UrIO 基因(GenBank No. ON227515),编码 516 个氨基酸 ;系统进化关系显示,钩藤 UrIO 与金鸡纳树(Cinchona calisaya) CcIO 亲缘关系最近,其次是长春花(Catharanthus roseus) CrIO;多序列比对分析表明,钩藤 UrIO 具有细胞色素 P450 (cytochrome P450 proteins, CYP)家族的3 个典型结构域。组织表达谱显示,UrIO 在钩藤的茎中表达水平最高,其次是果实中;并且在外源茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)处理下显著上升(P<0.05),不受外源脱落酸 (abscisic acid, ABA)诱导;利用融合引物与巢式整合 PCR (fusion primer and nested integrated PCR, FPNI-PCR)技术克隆 UrIO 的启动子 ; 植物顺式调节元件(plant cis-acting regulatory elements, PlantCARE)分析显示,该启动子包含胁迫响应和激 素响应等元件,瞬时烟草(Nicotiana tabacum)转化实验表明,该启动子能驱动下游 GUS 基因表达,进一步的酵母单杂交(yeast one hybrid, Y1H)证实了 UrMYC2 和 UrIO 启动子互作。本研究为进一步解析钩藤萜类吲哚生物碱合成途径提供参考。

• 贯叶连翘AP2家族的全基因组鉴定及表达特征

  李勇慧, 梁玉洁, 常思瑾, 郭明欣, 张延召, 陈尧

  贯叶连翘(Hypericum perforatum)是一种多年生草本植物,也是重要的药用植物。 AP2(APETALA2)基因家族是植物中较特殊的转录因子家族,在调控植物的生长发育中起到关键作用。贯叶连翘作为金虎尾目中被测序的物种,其 AP2 基因家族尚未被分析过。为了解 AP2 基因家族在贯叶连翘中 的特性与功能,本研究利用不同组织中贯叶连翘转录组测序数据和生物信息学方法鉴定到 21 个 HpAP2 转 录因子,对其理化性质、基因结构、保守基序、进化关系、顺式元件和表达模式进行分析,利用 qRT-PCR 检测5 个 HpAP2 家族基因在 3 种激素胁迫下的表达变化。结果表明,HpAP2 家族成员的理化性质存在差异,都属于亲水性蛋白;在 AP2 蛋白二级结构中,无规卷曲和 α-螺旋占比较大,延伸链和 β-转角相对占比较小;系 统进化分析显示,HpAP2 家族基因分为 euANT (eu-AINTEGUMENTA)、basalANT 和 euAP2 三个亚组,相同 亚组成员具有相似的基因结构和保守基序;HpAP2 启动子区顺式作用元件包括转录、发育、非生物或生物胁迫及激素响应4类;转录组数据显示,57.14% 的 AP2 家族基因在根、茎、叶和花 4 种组织中均表达,但表达水平存在明显差异;qRT-PCR 分析显示,选取的5个HpAP2 基因在不同激素胁迫下都表现出差异表达,其中 HpAP2-5、HpAP2-11 和 HpAP2-18 分别在脱落酸(abscisic acid, ABA)、水杨酸(salicylic acid, SA)和赤霉素(gibberellin, GA)处理中出现显著的上调表达,提示这些基因可能在应激相关植物激素的响应中发挥作用。本研究为深入阐释 HpAP2 基因家族功能及其在胁迫响应中的调控作用提供参考依据。

• 芳樟中芳樟醇合酶基因CcTPS14的克隆和表达分析

  曹瑞兰, 周增亮, 任志华, 王习政, 程钦华, 胡冬南, 陈尚钘, 刘娟

  芳樟(Cinnamomum camphora var. linaloolifera)是一类枝叶精油中富含芳樟醇的樟树,经济价值高,是我国南方地区重要的工业原料树种之一。芳樟醇合酶是芳樟醇合 成途径的关键萜类合成酶(terpene synthases, TPSs)。为解析芳樟中芳樟醇合酶基因的作用机理,本研究基于转录组数据,从芳樟优良无性系中克隆 1 个芳樟醇合酶基因CcTPS14 (登录号: ON156014),并对其进行生物信息学、系统进化和组织特异性表达分析。结果显示,CcTPS14 基因全长 725 bp,CDS 为 684 bp,编码 227 个氨基酸,相对分子质量为 25.69 kD;CcTPS14 蛋白理论等电点为 5.39,脂肪系数为 87.19,不稳定系数为 51.40,为亲水性蛋 白。亚细胞定位预测显示 CcTPS14 最可能定位在叶绿体中,其二级结构主要为无规则卷曲(65.86%)和 α- 螺旋(22.52%),含有少量扩展链(12.60%)和 β-折叠(9.01%)。系统进化分析发现,CcTPS14 与沉水樟(C. micranthum)和土肉桂(C. osmophloeum) TPS 亲缘关系最近,而与水青树(Tetracentron sinense)和朱红大杜鹃 (Rhododendron griersonianum)等物种的亲缘关系较远。qPCR 结果显示,CcTPS14 基因在芳樟不同组织部位相对表达量存在显著差异,其中 CcTPS14 在芳樟的成熟组织中的(如茎和老叶)表达量显著高于幼嫩组织(如嫩叶, 幼果和花)中的表达量(P<0.05)。本研究为深入解析 CcTPS14 功能及其芳樟中芳樟醇合成分子机制提供了参考依据。

• 牛KLF14和PDE10A基因的印记鉴定和甲基化分析

  董艳秋, 靳兰杰, 杨欣怡, 李冬杰, 霍浩楠, 苏红, 李世杰

  在哺乳动物中,印记基因与胎盘发育和胎儿生长密切相关。印记基因的表达变化会通过各种生理反应和信号通路导致哺乳动物生长发育异常并引发相关疾病。KLF14 (Kruppel like factor 14)和磷酸二 酯酶 10a (phosphodiesterase 10a, PDE10A)基因在人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)中被鉴定为印记基因。目前,关于 KLF14 和 PDE10A 基因在牛(Bos taurus)中的印记研究还未见报道。本研究首先应用 RT- PCR 方法分析 KLF14 和 PDE10A 基因在牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑和胎盘中的表达,发现 KLF14 基因只在胎盘中表达 ;而 PDE10A 基因在被检测组织中均有表达。进一步应用基于 SNP 的 RT-PCR 产物直接测序方法,分析 KLF14 和 PDE10A 的等位基因表达状态。结果显示,KLF14 基因在胎盘中为单等位基因表达,通过对其双亲的基因型进行分析,确定 KLF14 基因在牛胎盘中为母源印记基因;而 PDE10A 基因在胎盘和其他组织中均呈现双等位基因表达,为非印记基因。应用亚硫酸盐测序方法分析 KLF14 基因启 动子区的甲基化状态,发现其在牛胎盘和精子中均为轻甲基化,不存在差异甲基化区,说明 KLF14 基因启 动子区的甲基化修饰不参与调控 KLF14 基因的印记表达。上述结果表明牛 KLF14 基因为胎盘特异的母 源印记基因,PDE10A 基因为非印记基因。本研究为深入探讨 KLF14 和 PDE10A 基因功能提供参考依据。

• 囊泡运输蛋白SEC22B敲低对牛病毒性腹泻病毒复制的影响研究

  张成远, 袁圆圆, 郭妍婷, 杨莉, 冉多良, 付强, 史慧君

  牛病毒性腹泻病的感染情况日趋严重,给养殖业造成了严重的损失,目前我国缺乏有效的治疗手段,导致感染模式复杂化,其致病机制和病毒-宿主之间相互作用研究也尚不清楚。为了探究囊泡运输蛋白 (vesicle transport protein homolog, SEC22B)敲低对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)复制的影响,根据 GenBank 数据库中 SEC22B 基因序列,使用 Benchling 平台设计向导 RNA (small guide RNA, sgRNA),克隆至 LentiCRISPR v2 载体后进行慢病毒包装,使用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲低胎牛肾细胞(madin-darby bovine kidney cells, MDBK)中的 SEC22B 基因表达,使用 Western blot 鉴 定 SEC22B 基因敲低(knockdown, KD)情况;BVDV 感染 SEC22B KD 细胞不同时间后,分别使用 qPCR 和免疫荧光染色检测 BVDV 5' UTR mRNA 水平变化和双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)量,使用 Reed- Muench 法测定 BVDV 感染不同时间后子代病毒滴度变化。Western blot 检测发现,与对照 Scramble 细胞相比,SEC22B KD 细胞中 SEC22B 蛋白表达量显著降低 ;与 BVDV 感染 Scramble 细胞相比,BVDV 感染 SEC22B KD 细胞后 5' UTR mRNA 水平和 dsRNA 量均极显著降低(P<0.01),同时,子代病毒滴度极显著下降(P<0.01)。结果表明,敲低 SEC22B 基因后显著抑制 BVDV 复制,本研究为 BVDV 防控新方法的建立提供理论依据。

• PPARγΔ5在猪脂肪细胞分化过程中的表达及其对分化的影响

  魏芳, 蒋苏苏, 李帅兵, 符璐, 宋苏堤, 卢建雄, 张国华

  选择性剪接是真核生物精密调控组织细胞类型和发育的重要方式。过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ) 是脂肪细胞分化的关键调控因子,其前体mRNA可能通过选择性剪接产生外显子5 跳跃的亚型 PPARγ∆5,影响脂肪细胞分化。本研究从3日龄仔猪(Sus scrofa)皮下脂肪组织中分离培养前体脂肪细胞,诱导分化,以 qPCR 检测基因 mRNA 表达。结果显示,PPARγ∆5 在猪脂肪细胞分化早期表达极显著提高,中期达到高峰,后期极显著降低(P<0.01),其变化趋势与 PPARγ 及富含丝氨酸/精氨酸剪接因子(serine/arginine-rich splicing factor 1, SRSF1)一致。PPARγ激动剂罗格列酮处理可极显著提高细胞PPARγ∆5 和 SRSF1 表达(P<0.01),而拮抗剂 GW9662 可极显著降低其表达(P<0.01)。构建PPARγ∆5-siRNA 重组慢病毒,转染猪前体脂肪细胞,PPARγ∆5 表达极显著降 低约 75% (P<0.01)。与转染阴性对照慢病毒和未转染细胞相比,PPARγ∆5 表达沉默显著促进前体脂肪细胞分化及 PPARγ 和脂肪酸结合蛋白 4 (fatty acid-binding protein 4, FABP4)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase, SCD) 基因的表达(P<0.05),显著下调脂蛋白脂酶 (lipoprotein lipase, LPL)基因mRNA 表达(P<0.05)。本研究提示,猪脂肪细胞依赖SRSF1及 PPARγ 的表达和活性,通过选择性剪接产生 PPARγΔ5;PPARγΔ5 是脂肪细胞分化的抑制子,可能通过负调控 PPARγ 表达减弱猪前体脂肪细胞分化。本研究结果为揭示猪脂肪形成的机制提供了新的依据。

• 半番鸭性腺发育关键基因17β-HSD3的克隆、序列特征及表达分析

  缪中纬, 李丽, 朱志明, 章琳俐, 郝晓娜, 黄勤楼, 郑嫩珠, 辛清武

  17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase, 17β-HSD)可将经胆固醇转化而成的雄烯二酮最终氧化为睾酮,对睾丸激素合成和雄性性状发育至关重要。本课题组前期研究发现 17β- HSD3 可能通过类固醇激素合成途径参与半番鸭(Cairina moschata)胚胎期性腺发育。本研究以半番鸭为 研究对象,通过 cDNA 末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)获得 17β-HSD3 基因全 长 cDNA 序列,利用生物信息学对其序列特征和蛋白理化性质进行分析预测,并构建系统进化树 ;采用 qPCR 技术分析 17β-HSD3 基因在半番鸭胚胎期不同组织(脑,心,肝,肺,肌肉, 性腺和肾)中的特异性表达以及在半番鸭、父本番鸭和母本北京鸭性腺中的差异表达。结果表明,半番鸭 17β-HSD3 基因全长 cDNA 序列全长为 1 332 bp,含有 1 个 963 bp 的开放阅读框、1 个 26 bp 的 5'非编码区和 1 个 343 bp 的 3'非编码区。编码的蛋白质含有320 个氨基酸,该编码蛋白为不稳定性蛋白。同源性和进化树系统分析表明,半番鸭17β-HSD3 基因与天鹅(Cygnus olor)亲缘关系最近,同源性高达 96.5%。组织特异性表达分析显示,17β- HSD3 基因在半番鸭性腺中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01),同时,随着胚胎发育 17β-HSD3 基因 表达量在半番鸭性腺组织中逐渐升高,表明该基因可能参与半番鸭性腺发育;17β-HSD3 基因在繁殖性状 正常的番鸭和北京鸭性腺中表达量显著高于不育的半番鸭(P<0.05),表明其表达可能与半番鸭的不育相 关。本研究为进一步研究 17β-HSD3 基因对半番鸭性腺发育和生殖细胞分化的调控机理提供理论依据。

• MagaininⅡ对EHECO157:H7所致小鼠肠道屏障损伤及炎症状态的影响

  农可懿, 房鑫, 刘又铭, 张海文

  O157:H7 是一种肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC)菌株,作为食源性 病原体可导致畜禽与人类(Homo sapiens)患病。马盖宁(magainins)是具有抗菌和抗肿瘤特性的阳离子肽,对革兰氏阴性和阳性菌具有抗菌活性。本研究旨在明确蛙(Xenopus laevis)源抗菌肽 MagaininⅡ对 EHECO157:H7 攻毒小鼠(Mus musculus)的肠道炎症及微生物区系的影响。以体重接近的 C57/BL6 雄性小鼠 40只为受试对象,随机分为 4 组(每组 10 只)：CK 组,O157 组,MagⅡ组,O157+MagⅡ组。在相同基础日粮条件下,分别在 1、5 和 9 d 对 O157 组和 O157+MagⅡ组以 0.1 mL O157 菌液(浓度为 106 CFU/mL)灌胃,CK 组 和 MagⅡ组灌胃相同体积的 PBS 溶液 ;1 h 后,MagⅡ组和 O157+MagⅡ组按照 5 mg/kg 体重,于腹腔注射0.25 mL MagaininⅡ溶液,CK 组和 O157 组注射相应体积的无菌生理盐水 ;10 d 后安乐处死全部受试小鼠,采集相应组织样本进行检测。结果表明,MagaininⅡ单独处理对小鼠血清炎性细胞因子浓度和空肠炎性细胞因子、屏障功能相关基因表达均无影响;EHEC O157: H7处理导致小鼠空肠白细胞介素 -6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)基因表达水平及血清 IL-1β、IL-6、TNF-α 浓度显著升高(P<0.05),血清 IL-10 水平显著降低(P<0.05),空肠紧密连接蛋白 claudin-1、黏 蛋 白 -1 (mucin-1, MUC-1)、MUC-2 的表达水平显著降低(P<0.05);Magainin Ⅱ处理可显著改善EHECO157:H7导致的IL-1β、IL-6、TNF-α、claudin-1、MUC-1、MUC-2 基因表达及血清 IL-1β、IL-6、IL-10 浓度的异 常(P<0.05)。另外,本研究通过 16S rDNA 测序来分析 MagaininⅡ干预引起的肠道微生物变化。测序结果显示,在属水平上,O157 组中普氏菌属(Prevotella)和拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度显著升高(P<0.05), O157+MagⅡ组拟杆菌属相对丰度降低(P<0.05),即 EHEC O157:H7 攻毒后与炎症发展相关的普氏菌属 和拟杆菌属丰度显著增加,MagaininⅡ处理使不利菌属拟杆菌属丰度显著下降,提示 MagaininⅡ可维持肠道屏障和缓解炎症水平,从而在 EHEC O157:H7 诱导的小鼠肠道损伤中发挥保护作用,肠道群菌的变化可能是 MagaininⅡ保护肠道损伤的相关因素。综上所述,MagaininⅡ可作为潜在药物用于治疗 EHECO157:H7 引起的肠道疾病。

• 中华绒螯蟹EsPrx4基因的克隆及抗菌功能分析

  梁猛, 王美垚, 李建林, 颜逢缘, 周军, 唐永凯

  近年来,养殖水环境恶化和养殖密度的提高,病害的发生和非生物的胁迫应激,严重影响着中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的生长和发育。过氧化物还原酶(peroxiredoxin, Prx)在氧化应激应答过程中发挥重要作用。Prx4 为Prx 家族的重要成员,为了探讨 Prx4 在中华绒螯蟹抗菌免疫应答中的调控功能,本研究应用同源克隆技术从中华绒螯蟹的肝胰腺中克隆出 EsPrx4 基因(GenBank No. ON685195)。序列分析表明,EsPrx4 的编码区为738 bp,共编码245个氨基酸。理化性质分析表明,EsPrx4 蛋白的分子量为27.31 kD,理论等电点为 5.55,总平均亲水性为-0.181,表明 EsPrx4 蛋白为亲水性蛋白。系统进化分析表明,中华绒螯蟹EsPrx4与拟穴青蟹 (Scylla paramamosain)、斑节对虾(Penaeus monodon)和南美白对虾(Litopenaeus vannamei)等虾蟹类的Prx4 基因具有高度同源性,表明虾蟹中 Prx4 具有较高的保守性。qPCR结果显示,EsPrx4 在中华绒螯蟹体内广泛表达,在肝胰腺中表达量最高,在肠中表达量最低。在鳗弧菌 (Listonella anguillarum)刺激下,EsPrx4 迅速应答,在 24 h 表达量达到最高,72 h 时恢复至正常水平,表明 EsPrx4 参与了鳗弧菌刺激引起的反应,在中华绒螯蟹免疫应答中发挥重要作用。本研究为中华绒螯蟹先天免疫和 Prx 基因家族的深入研究提供理论支持。

• 马铃薯淀粉代谢相关基因及其顺式调控元件的分子研究进展

  唐珂, 严彩虹, 朱博, 曾子贤

  马铃薯(Solanum tuberosum)块茎中淀粉含量及其代谢对淀粉加工影响极大。解析参与马铃薯淀粉代谢过程关键酶的功能及其表达调控,有助于通过基因工程对马铃薯块茎淀粉含量及品质进行改良。 本文详细综述了马铃薯淀粉代谢过程中关键酶编码基因的研究进展及其在马铃薯淀粉改良方面的研究成果;同时,提出了通过对马铃薯淀粉代谢网络中关键基因顺式调控元件鉴定并进行分子操作,从而提高马铃薯块茎淀粉含量及品质的可能性,为创制兼备粮食和能源用途的高淀粉含量马铃薯品种提供一种潜 在手段。

• 向日葵干旱胁迫相关基因和转录因子研究进展

  石慧敏, 邬阳, 苏飞燕, 李丹丹, 侯建华

  干旱是影响许多地区农作物生产力最重要的环境因素之一。向日葵(Helianthus annuus)对干旱 条件虽具有耐受性,但其在分子水平上的耐受机制研究较少,阐明向日葵抗旱性的复杂机制将加速抗旱 性新品种的选育。本文对参与向日葵干旱胁迫响应的功能基因和转录因子(AP/ERF, bZIP, WRKY, HB, NAC, MYB, bHLH 等)进行了总结。最后对当前研究情况进行了总结,并对未来发展趋势进行了展望,希望将这些候选基因和转录因子作为一种潜在的生物技术工具,为今后解析和改良向日葵抗旱性,提高向日葵产量提供参考。

• 通过优化的5'RACE技术鉴定牛脂肪组织KLF4基因转录起始位点

  郝瑞杰, 张燕玲, 徐淑雨, 李敏, 张铭铭, 李星雨, 陈亚珍, 郭允, 昝林森

  5' cDNA 末端快速扩增(5' rapid amplification of cDNA ends, 5' RACE)技术是基因转录表达调控研究的关键手段之一,其操作复杂,对样品要求较高。牛(Bos taurus)脂肪组织杂质含量高,单位体积 RNA 含量低,经常造成 5' cDNA 末端扩增的失败,影响脂肪沉积分子机制的研究。Kruppel 样因子 4 (Kruppel- like factor 4, KLF4）是调控牛脂肪沉积的关键基因,为了准确鉴定牛 KLF4 基因在脂肪组织中表达的转 录起始位点,揭示脂肪沉积关键基因的表达调控机理,以郏县红牛皮下脂肪组织为研究对象,对经典5' RACE 技术进行改进。首先采用特异性反转录引物,仅反转录总 RNA 中的特定 mRNA,以提高目标基因的反转效率,耐受更低浓度的 RNA;然后,调整反转录体系,简化加尾前 cDNA 纯化步骤,减少目标 cDNA 的损失,保证后续 RACE 扩增中的模板浓度;最后,采用适当靠近 mRNA 5'端的基因特异性引物(产生较短的 RACE 片段),降低 RACE 扩增中聚合酶延伸能力,模板二级结构等因素的干扰。通过上述改进措施,成功获得了 KLF4 基因的 RACE 片段。对该片段进行测序和比对分析后,发现郏县红牛 KLF4 基因 的转录起始位点与 NCBI 数据库中以胞嘧啶 C 作为起始核苷酸的 KLF4 基因(NM_001105385)不同,其向 5' 端延伸了 2 个碱基(GA),以鸟嘌呤作为起始核苷酸,该结果更符合转录起始位点通常为一个嘌呤(A 或 G)的特征。分析不同长度 RACE 片段对 PCR 扩增的影响,结果发现较短的 RACE 片段(<500 bp)可以顺利扩增成功 ;而对于大于 1 000 bp 的 RACE 片段,试剂盒法和优化法均没有获得有效片段。本研究通过优化 5' RACE 技术,成功鉴定了郏县红牛皮下脂肪 KLF4 基因的转录起始位点,该新位点证实了我国地方牛种的遗传特异性,为进一步研究该基因在脂肪沉积中的作用提供了参考。

• 玉米大斑病菌实时荧光定量PCR内参基因的筛选与应用

  代玉立, 刘晓菲, 甘林, 兰成忠, 滕振勇, 杨秀娟

  由异宗配合的子囊菌大斑凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)引起的大斑病(northern leaf blight)是我 国玉米(Zea mays)和高粱(Sorghum bicolor)生产的重要真菌病害。为筛选适用于玉米大斑病菌实时荧光定量 PCR (quantitative real-time PCR; qRT-PCR)的内参基因,本研究以转录延伸因子 1α (elongation factor-1α, EF-1α)、新生多肽相关复合物 α 多肽(nascent-polypeptide-associated complex alpha polypeptide, NACA)、60S 核糖体蛋白 L2 (60S ribosomal protein L2, RPL2)、60S 核糖体蛋白 L37a (60S ribosomal protein L37a, RPL37A)、泛素结合酶 (ubiquitin-conjugating enzyme, UBC)、α 微管蛋白 (α-tubulin, TUBA)、肌动蛋白 (actin, ACT)和 β 微管蛋白 (β-tubulin, TUBB)为候选内参基因,以玉米大斑病菌4个不同菌株、3个不同发育阶段、体内侵染4个不同时期以及苯醚甲环唑胁迫 4 个不同时间的样品为实验材料,通过 qRT-PCR 技术测定玉米大斑病菌各候选内参基因在上述不同条件下的表达量,利用geNorm (v3.5)、NormFinder (v0.953)、 BestKeeper (v1.0)、Delta-CT 以及 RefFinder (http://blooge.cn/RefFinder/)等分析方法综合评价候选内参基因的表达稳定性。同时,分别以筛选的稳定性较好和较差的内参基因,分析玉米大斑病菌羊毛甾醇 14α去甲基化酶(lanosterol 14α-demethylase, CYP51)基因在苯醚甲环唑胁迫下的表达规律。结果表明,8 个候选内参基因的扩增效率范围为 90.3%~97.8% (r>0.99),熔解曲线峰图均为单一峰,符合 qRT-PCR 的扩增效率要求。TUBA 和 TUBB 适于做玉米大斑病菌不同菌株间基因表达分析的内参基因 ;RPL2 和 TUBA 是 不同发育阶段表达较稳定的内参基因;NACA 和 TUBA 是体内侵染不同时期较理想的内参基因;ACT 适于做苯醚甲环唑胁迫不同时间基因表达分析的内参基因。qRT-PCR 分析表明,在苯醚甲环唑胁迫下,玉米 大斑病菌 CYP51 基因的表达量随时间的推移显著增加,胁迫 24 h 时,表达量达到最大,胁迫 36 h 表达量显著下调(P<0.05)。以稳定性较好的 ACT 作为内参基因时,与未胁迫组相比,苯醚甲环唑胁迫可显著诱导玉米大斑病菌 CYP51 基因上调表达(P<0.05)。但是,以稳定性较差的 TUBB 作为内参基因时,得出了2个菌株的 CYP51 基因表达量相反的结果。本研究为玉米大斑病菌基因表达定量分析提供了有效的校正工具,确保基因定量分析的准确性,为进一步研究玉米大斑病菌抗药基因过表达提供了参考依据。

• 变形假单胞菌ExsA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备

  韦金平, 李云凤, 邱薇, 陈兴莆, 陈波宇, 陈新华, 覃盼

  Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system, T3SS)是革兰氏阴性菌中普遍存在的蛋白分泌机制,是细菌毒力因子产生致病效果的重要途径。阿糖胞苷(Ara-C)型 DNA 结合蛋白 ExsA 是 T3SS 的主要激活因子之一,能够调控 T3SS 相关蛋白的表达。本研究将变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida) PQLYC4菌株的 ExsA 基因克隆至原核表达载体 pET28a (+ ),将重组表达质粒pET-28a-ExsA 转化至大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3)感受态细胞进行诱导表达。结果显示,大肠杆菌表达的重组 ExsA 蛋白分子量略小于 30 kD,与预期分子量(29.7 kD)一致。将表达的重组 ExsA 蛋白进行纯化,免疫新西兰大白兔 (Oryctolagus cuniculus)制备抗 ExsA 蛋白的多克隆抗体,效价达 1∶256 000 以上 ;利用制备的抗体,采用 Western blot 和间接免疫荧光方法,检测变形假单胞菌菌体中的 ExsA 蛋白和鲤鱼(Cyprinus carpio)上皮细 胞(epithelioma papulosum cyprini, EPC)中过表达的 ExsA 蛋白,均可发生特异性反应。本研究为深入探讨 ExsA 蛋白结构及其在调控变形假单胞菌毒力因子 T3SS 系统中的功能提供了工具。