农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2020年第4期

• 小麦TaSKP2A基因抗逆相关表达分析及与其互作蛋白的筛选

  孟钰玉, 李虎滢, 许媛, 魏春茹, 范润侨, 于秀梅, 赵伟全, 康振生, 刘大群

  S-期激酶相关蛋白2A (S-phase kinase-associated protein 2A, SKP2A)是一个F-box蛋白,参与植物细胞分裂的调控,并能增加拟南芥(Arabidopsis thaliana)对渗透胁迫的抗性。为探究小麦(Triticum aestivum) SKP2A基因在响应非生物逆境及病原菌侵染中的功能,本研究在克隆到小麦TaSKP2A基因的基础上,对其编码的蛋白进行了分析。结果表明,TaSKP2A编码一条381个氨基酸组成的多肽,预测其等电点和分子量分别为6.83和40.87 kD;TaSKP2A为非分泌型蛋白质,定位于细胞核上,属于富含亮氨酸重复(leucine-rich repeat, LRR)型F-box蛋白。qRT-PCR结果显示,TaSKP2A在雌蕊和旗叶中的表达量较高,在幼茎和雄蕊中较低;经水杨酸(salicylic acid, SA)和NaCl处理后TaSKP2A分别在24和48 h出现上调表达;在H2O2胁迫下,TaSKP2A基因整体呈现下调表达;在叶锈菌(Puccinia triticina)侵染各个时间点的抗病组合中TaSKP2A的表达量高于感病组合,在接种后12 h的抗病组合中,该基因的相对表达量最高,为对照的8.1倍。经酵母(Saccharomyces cerevisiae)文库筛选及回复验证,发现几丁质酶(chitinase, CHI)和SCF (Skp1-Cullins-F-box)复合体骨架蛋白SKP1与TaSPK2A具有相互作用。上述结果提示,TaSKP2A可能响应盐和叶锈菌侵染等逆境胁迫,该F-box蛋白为SCF复合体成员。本研究结果为解析SKP2A蛋白的功能和深入探究其调控网络及作用机制提供了基础资料。

• 小麦有效分蘖数QTLs定位及其元分析

  左煜昕, 刘媛, 张沛沛, 栗孟飞, 程宏波, 陈思瑾, 幸华, 杨德龙

  有效分蘖数(productive tiller number, PTN)作为小麦(Triticum aestivum)产量形成重要因子之一,是由多基因控制的复杂数量性状,利用数量性状基因位点(quantitative trait loci, QTL)定位和元分析手段,发掘PTN真实的主效QTL及其紧密连锁的分子标记,是实现小麦分子遗传改良的重要途径。本研究利用1套小麦重组近交系(recombinant inbred lines, RIL)群体,设置不同水分条件,对PTN进行QTL定位,并整合已发表的QTL信息,进行元分析。结果发现,小麦RIL群体PTN表型变异广泛且存在超亲分离现象,易受水分环境影响,普遍表现出较低的遗传力。在不同水分环境条件下,共检测到22个控制小麦PTN的加性QTL,分布在除4A以外的20条染色体上,对表型变异的贡献率在5.86%~13.84%。通过整合来源于15个作图群体的97个控制PTN的QTL,建立了QTL一致性图谱。最终获得33个一致性QTL及其紧密连锁的候选分子标记,图距最小可达到1.94 cM。本研究结果为小麦有效分蘖数QTL精细定位以及分子标记辅助选择育种提供理论依据。

• 水稻恢复系泸恢8258产量性状的QTL定位

  曹应江, 游书梅, 蒋开锋, 张涛, 杨莉, 杨乾华, 万先齐, 李昭祥, 高磊, 郑家奎

  恢复系是三系杂交稻(Oryza sativa)重要的亲本之一,挖掘其高产基因,对提高杂交稻的产量水平具有重要意义。本研究利用水稻三系恢复系'泸恢8258'与'扬恢34'构建重组自交系群体(recombinant inbred lines, RIL)作为材料,在四川德阳、遂宁、泸州3个环境下,考察了单株生物量、收获指数、单株产量、有效穗、每穗颖花数、每穗实粒数、结实率、千粒重8个产量相关的性状。在构建了一张包含184个DNA标记的遗传连锁图谱基础上,利用Windows QTL Cartographer 2.5检测产量相关性状的数量性状位点(quantitative trait locus, QTL),8个性状在3个环境下共检测到62个QTL,分布在12条染色体上。共有2个QTL在3个环境下同时检测到,分别是控制千粒重的qTGW3和控制每穗实粒数的qFGP6-1,增效等位基因来自'泸恢8258',对表型的贡献率分别为5.92% (德阳)、7.79% (遂宁)、19.04% (泸州)和8.80% (德阳)、10.90% (遂宁)、4.96% (泸州)。共有17个QTL在其中的两个环境下被检测到,分别是控制单株生物量的qBYP6-2、qBYP9,控制收获指数的qHI3-1、qHI3-2、qHI12,控制单株产量的qYP3-2、qYP12,控制单株有效穗的qEP2-1、qEP9-2,控制每穗颖花数的qSP6-1、qSP12,控制每穗实粒数qFGP2-1、qFGP2-2、qFGP6-2、qFGP12-2,控制结实率的qSSR2、qSSR6-1。在两个环境下检测到的17个QTL中,增效等位基因来自'泸恢8258'的有11个,分别是qHI3-1、qHI3-2、qBYP6-2、qBYP9、qYP3-2、qEP2-1、qEP9-2、qSSR2、qSSR6-1、qSP6-1、qFGP6-2,其他6个QTL增效等位基因来自'扬恢34'。8个性状检测到的QTL中,除每穗颖花数和每穗实粒数外,其他性状检测到的QTL增效等位基因大多来自'泸恢8258'。这些研究结果为水稻产量相关性状的精细定位、克隆、分子标记辅助选择提供理论和技术支撑。

• 甜瓜侧枝长度QTL定位及候选基因预测

  杨森要, 刘海英, 高路银, 杨路明, 朱华玉, 胡建斌, 马长生, 孙守如

  侧枝长度是植物的重要株型性状之一,是改良蔓生植物株型的有效切入点。本研究以甜瓜(Cucumis melo)短侧枝材料D581为父本、长侧枝材料H465为母本构建F2及F2∶3群体,研究侧枝长度的变异规律,对其进行QTL定位并预测候选基因。研究结果表明,侧枝长度在F2和F2∶3群体中呈典型的正态分布,6个侧枝性状指标的广义遗传率高于60%。利用253个SSR和InDel标记构建一张包含12个连锁群、覆盖基因组全长1 433.3 cM的遗传图谱,标记间的平均遗传距离为5.67 cM。春秋两季共定位到31个QTL,单个QTL的表型贡献率为6.39%~16.46%,不同指标和不同环境下的7个QTL被共定位在LG8的SSR029716~ECM88区间,其累积贡献率达75.66%。通过对双亲进行深度重测序(>30×),并在共定位区段开发新的InDel标记,将这一区段缩小至185 kb,该区段注释有31个基因,其中3个基因参与了植物激素信号转导途径,是调控甜瓜侧枝发育最有可能的候选基因。本研究鉴定到的QTL和候选基因是当前甜瓜侧枝性状基因发掘研究的有益启示,也为甜瓜株型分子改良提供理论依据。

• 芹菜转录组数据SSR标记的开发及其遗传多样性分析

  陈昌龙, 董岩, 田宇, 石妙涵, 葛秀秀, 谢华

  芹菜(Apium graveolens)是一种世界范围内重要的叶类蔬菜。目前芹菜的遗传研究需要一些有价值的分子标记。本研究利用GenBank中芹菜3套转录组数据中的高质量reads,通过序列拼接,得到39 619个unigenes序列,从中共识别到4 034个SSR位点,其中二核苷酸重复类型最为丰富,占43.9% (1772);其次为单核苷酸(26.7%, 1078)和三核苷酸类型(21.0%, 846);四、五、六核苷酸总计占1.3% (52);其余为复合型(7.1%, 286)。在设计的375对SSR引物中,有39对在选择的5种不同来源的代表性芹菜材料中被成功验证,产生了清晰而稳定的高质量特异PCR产物。利用荧光标记PCR及多重毛细管电泳技术,在供试的76种芹菜材料中39个位点共检测出110个等位变异,平均每个位点2.821个,变化范围为2~4个;基因型数目变化范围为2~9,平均每个位点为4.308;平均多态信息含量(polymorphism information content, PIC)为0.256,变化范围为0.013~0.581;鉴别力(power of discrimination, PD)变化范围为0.026~0.764,平均为0.379。76种芹菜遗传多样性分析结果显示,本芹和西芹平均等位变异分别为2.641和2.436,Nei's指数平均分别为0.347和0.194,Shannon's指数平均分别为0.589和0.351,提示本芹的遗传多样性大于西芹。分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)结果表明,61.72%的变异来源于芹菜个体内,22.07%的变异来源于西芹和本芹群体内个体间,16.22%的变异来源于两群体间。主成分分析(principal component analysis, PCA)与UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic means)聚类分析结果一致,基本上西芹和本芹可分别聚成不同类群;但相比于西芹,本芹聚类相对离散,提示本芹的遗传变异可能相对丰富。本研究丰富了用于芹菜种质资源遗传多样性分析及分子鉴定的SSR标记,并建立了基于多重毛细管电泳的高效检测体系。

• 苦荞抗旱相关转录因子基因FtWRKY10的克隆及功能鉴定

  王官凤, 吕兵兵, 王安虎, 赵海霞, 王晓丽, 吴琦, 陈惠, 李成磊

  WRKY转录因子是植物特有的一类锌指型蛋白。本研究基于苦荞(Fagopyrum tataricum)转录组数据,由苦荞中克隆1条WRKY转录因子基因FtWRKY10。序列分析表明,FtWRKY10定位于苦荞基因组第5号染色体,DNA全长4 303 bp,含6个外显子和5个内含子,ORF为1 647 bp可编码548个氨基酸残基的蛋白;推导的FtWRKY10蛋白为Ⅰ类WRKY转录因子,与拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtWRKY20具有最近的系统发育关系,qRT-PCR显示其在苦荞中的表达受到干旱胁迫的诱导。分子鉴定结果表明,FtWRKY10在酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株AH109中显示出转录激活活性,在转基因拟南芥中定位于细胞核;该转录因子可分别在酵母和植物细胞中特异结合其靶DNA位点W-box并启动报告基因的表达。转基因拟南芥中,FtWRKY10的超表达可增强拟南芥萌发过程中对干旱和脱落酸(abscisic acid, ABA)处理的耐受;提高拟南芥植株在干旱胁迫下叶绿素(chlorophyll)和脯氨酸(proline, Pro)的含量,增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)的活性,上调拟南芥抗逆相关基因脱水应答蛋白(responsive to dehydration protein, RD)RD29A、RD29B和RD22,ABA应答蛋白(responsive to ABA protein, RAB) RAB18及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(serine/threonine protein kinase) KIN1的表达。本研究为苦荞优良生产性状的利用提供了了基础资料和思路,为进一步丰富WRKY转录因子家族的功能提供了基础素材。

• 毛竹锌指同源结构域基因家族全基因组鉴定及表达分析

  马瑞芳, 陈家璐, 刘笑雨, 朱丰晓, 阮诗雨, 喻珮瑶, 张智俊

  锌指同源结构域(zinc finger-homeodomain, ZF-HD)是一种同源异形盒蛋白家族,是植物特有的一类转录因子,在植物生长发育和响应非生物胁迫中发挥着重要作用。为探究ZF-HD基因家族在毛竹(Phyllostachys edulis)生长发育中的功能,基于毛竹基因组和相关转录组数据,运用生物信息学的方法,分析ZF-HD家族的理化性质、系统进化关系、基因蛋白结构以及表达模式等。研究结果表明：毛竹基因组中含有23个ZF-HD成员,其中内含子数较少(1~2个),基因结构和基序均相对保守。该家族蛋白序列存在不同结构域,含有可以和DNA结合的同源域(homeodomain, HD)和锌指(zinc-finger, ZF)两个结构域;系统进化树显示ZF-HD家族可分为6类亚族;结合多序列比对和同源模建分析结果,毛竹ZF-HD属于C2H2类型的类锌指结构域超基因家族。上游启动子序列中含有多个激素应答相关顺式作用元件;共线性分析可知毛竹与水稻(Oryza sativa)之间的共线性关系高于毛竹与拟南芥(Arabidopsis thaliana)之间的共线性关系,且存在基因复制倍增事件;结合基因本体(Gene Ontology, GO)富集,分析不同激素处理条件下以及笋芽发育不同阶段RNA-seq数据,发现毛竹ZF-HD可响应外源赤霉素(gibberellin, GA)和萘乙酸(naphthalene acetic acid, NAA)的调控;笋期部分基因家族成员的高表达,提示其可能参与了竹笋快速生长发育过程。本研究结果将有助于揭示ZF-HD基因家族在毛竹快速生长发育中的生物学功能。

• 巨桉EgrBBX基因家族鉴定及其在非生物逆境处理下的表达分析

  杨宁, 从青, 王晓荣, 倪晓祥, 程龙军

  BBX (B-box)蛋白是锌指结构转录因子蛋白家族的一个亚家族,广泛参与植物的生长和发育,在非生物逆境响应中也具有重要作用。桉树(Eucalyptus)是我国南方用材树种,但其抗逆性较差,限制了桉树栽培范围的扩大和栽培效益提高。为丰富桉树抗逆基因资源,给桉树抗逆分子辅助育种提供参考依据,本研究从巨桉(Eucalyptus grandis)全基因组范围内搜寻并鉴定出21个BBX基因家族成员,利用mg2c、Protparam、MEGA和PlantCARE软件进行染色体分布、序列结构特征以及启动子上顺式作用元件的种类和分布等分析,并对EgrBBX家族基因的组织特异性表达及其在低温、干旱及高盐处理下的表达模式进行qRT-PCR检测分析。结果表明,21个EgrBBX基因分别分布在9条染色体上;编码蛋白序列中含有典型的B1、B2和CCT结构域,可分为B1+B2+CCTⅠ和Ⅱ型、B1+B2、B1+CCT以及B1五个类型。启动子元件分析结果表明,EgrBBX家族基因启动子上除含有大量光响应元件,还含有ABRE (ABA-responsive element)、MBS (MYB binding site)、LTR (low-temperature responsiveness)、HSE (heat-stress responsive element)等非生物逆境响应相关元件。以qRT-PCR方法进行根、茎和叶的组织表达分析表明,EgrBBX1、EgrBBX7、EgrBBX9、EgrBBX13和EgrBBX18主要在叶片中表达,EgrBBX3、EgrBBX6和EgrBBX15在茎中具有相对较高的表达量。在不同时间低温、干旱和高盐的非生物逆境胁迫条件下,大部分EgrBBX基因发生响应：低温处理下EgrBBX4、EgrBBX7、EgrBBX8、EgrBBX14、EgrBBX16和EgrBBX17在整个处理时间周期内均表现为强烈的表达抑制;EgrBBX8、EgrBBX11、EgrBBX12和EgrBBX18在干旱处理1 d即出现明显的上调表达,2 d后该诱导效应减弱或消失;高盐处理下,21个EgrBBX基因中13个在12 h后表达达到峰值,然后逐渐回落。本研究可为深入揭示EgrBBX基因家族在非生物逆境胁迫响应中的具体功能,筛选桉树抗逆性EgrBBX基因资源提供参考依据。

• LHR、PRLR基因在不同发育阶段牦牛睾丸中的表达与定位

  马富龙, 褚敏, 常永芳, 包鹏甲, 郭宪, Qudratullah Kalwar, 马启财, 潘和平, 阎萍

  促黄体素受体(luteinizing hormone receptor, LHR)和催乳素受体(prolactin receptor, PRLR)基因在哺乳动物生殖发育中扮演着重要角色,广泛存在于各种组织。为分析不同年龄牦牛(Bos grunniens)睾丸组织中LHR、PRLR基因表达的变化模式,并探究其在成年期牦牛不同器官中的表达差异,分别采集幼年期(6月龄)、初情期(24月龄)、性成熟期(36月龄)、成年期(72月龄)牦牛睾丸组织和72月龄公牦牛的肾脏、肝脏、肺脏、心脏、脾脏、骨骼肌等器官组织。采用qRT-PCR技术检测不同发育时期牦牛睾丸组织和成年牦牛不同器官组织中LHR、PRLR mRNA表达水平,并采用免疫组织化学技术研究不同发育期牦牛睾丸组织的LHR、PRLR蛋白表达定位。结果显示,LHR、PRLR基因在牦牛睾丸组织中的表达量从幼年期到性成熟期极显著增加(P<0.01),成年期与性成熟期差异不显著。成年牦牛不同器官组织LHR基因在睾丸组织中的表达水平高于在肾脏、骨骼肌和肺脏组织中的表达水平(P<0.05),PRLR基因在肾脏的表达量最高,其次为骨骼肌、睾丸和脾脏(P<0.05)。LHR、PRLR免疫阳性标记定位于睾丸支持细胞、间质细胞、初级精母细胞和次级精母细胞,其在细胞中的阳性信号从幼年期到性成熟期逐渐增强,成年期趋于稳定,蛋白表达趋势与mRNA基本相符。说明睾丸组织中LHR、PRLR可能在精子成熟过程中发挥作用并参与间质细胞的生物学功能,LHR还可能参与调节其他非性腺组织的发育。上述研究结果为揭示牦牛睾丸发育与生殖调控的分子机制提供重要理论依据。

• 牦牛CAV1基因克隆及其在雌性生殖系统主要器官中的表达定位

  张瑞, 王靖雷, 潘阳阳, 王静瑜, 胡学权, 马睿, 崔燕, 余四九

  窖蛋白-1(Caveolin-1, CAV1)是一种与内吞作用、细胞外基质组织、胆固醇分布、细胞迁移和信号传导相关的膜蛋白。为探索正常生理条件下CAV1在雌性牦牛(Bos grunniens)生殖系统中的表达及其生理功能,本研究以牦牛不同繁殖时期(卵泡期, 黄体期和妊娠期)的子宫、卵巢和输卵管为材料,利用基因克隆、qRT-PCR、蛋白质免疫印迹(Western blot)、免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)等方法,对CAV1基因和蛋白的表达进行分析。结果显示,CAV1基因(GenBank No. MN127963)高度保守,牦牛CAVI基因序列与普通牛(Bos taurus)相比有差异,但其编码的氨基酸不变,牦牛CAVI基因与普通牛和绵羊亲缘性最近,与家猫和马亲缘性最远,其编码的蛋白为稳定的疏水性膜蛋白;CAV1在雌性牦牛生殖系统主要器官中均有表达,其中卵泡期输卵管、卵巢、子宫中CAV1的表达水平显著高于黄体期、妊娠期(P<0.05),妊娠期输卵管中CAV1的表达水平显著高于黄体期(P<0.05),黄体期卵巢和子宫中CAV1的表达水平显著高于妊娠期(P<0.05);免疫组织化学结果显示,CAV1在输卵管黏膜上皮、浆液腺,卵巢卵泡膜、卵泡颗粒层、生殖上皮、黄体细胞,子宫内膜和子宫腺体均有表达。研究结果为深入探索CAV1参与哺乳动物生殖生理调控提供了理论基础,有助于高原哺乳动物繁殖规律的研究。

• 基于转录组测序分析西门塔尔牛和安格斯牛脂肪沉积相关基因的差异表达

  赵伟明, 吴慧光, 吴江鸿, 王国富, 高树新

  肌内脂肪(intramuscular fat, IMF)的含量和分布是形成牛大理石花纹肉的物质基础。西门塔尔牛(Bos taurus)和安格斯牛(B. taurus)的脂肪沉积能力不同,安格斯牛IMF含量显著高于西门塔尔牛。本研究采用高通量测序技术筛选背膘脂肪沉积相关基因,旨在为西门塔尔牛和安格斯牛脂肪沉积机制研究提供参考依据。以西门塔尔牛和安格斯牛15月龄公牛各3头进行育肥屠宰实验,对屠宰后的胴体进行肉质性状测定。取两个品种牛背膘脂肪组织进行转录组测序和生物信息学分析。结果显示,2个品种牛在粗脂肪、滴水损失、眼肌面积和pH方面差异不显著,西门塔尔牛剪切力显著高于安格斯牛(P<0.01)。转录组数据分析结果表明,2个品种的牛在背膘脂肪组织存在1 296个差异表达基因,主要富集在代谢、生长、发育等55个功能条目和脂质代谢、碳水化合物代谢、能量代谢等44条代谢通路;根据通路和功能分析,选择丙酮酸脱氢酶激酶4 (pyruvate dehydrogenase kinase 4, PDK4)、核受体第4亚族A组成员1 (nuclear receptor subfamily 4 group A member 1, NR4A1)和同源异型蛋白(prospero related homeobox, PROX1) 3个基因,利用实时荧光定量PCR技术进行基因表达量分析。结果显示,安格斯牛背膘脂肪中PROX1和PDK4的相对表达量分别比西门塔尔牛高47%和14% (P<0.01),NR4A1在西门塔尔牛背膘脂肪中相对表达量比安格斯牛高30% (P<0.05)。本研究获得的差异表达基因可作为肉牛肉质性状遗传育种改良的候选基因,可为深入探讨背膘脂肪生长发育的遗传机理提供基础资料。

• 四个绵羊品种BMPR-IB基因3'-UTR区多态性及其与胎产羔数的相关分析

  孙渭博, 张利平, 郎侠, 张筱艳, 靳继鹏, 张紫奇, 肖帆, 雷志惠

  为探究骨形态发生受体蛋白IB 基因(bone morphogenetic protein receptor IB, BMPR-IB)非编码区多态性对绵羊(Ovis aries)繁殖性能的遗传效应,本实验以湖羊多羔母羊(Multiple Hu Sheep, HM)、蒙古羊单羔母羊(Singletons Mongolian Sheep, MS)和双羔母羊(Twins Mongolian Sheep, MT)、欧拉羊单羔母羊(Singletons Oula Sheep, ZS) 和双羔母羊(Twins Oula Sheep, ZT)、澳洲白绵羊单羔母羊(SingletonsAustralian White Sheep, AS)为研究对象,利用DNA 直接测序法检测BMPR-IB 基因3'-非编码区(3'-untranslated region, 3'-UTR) SNPs,并分析其与胎产羔数(后简称产羔数)之间的相关性。结果表明：在3'-UTR区1 145~1 500 bp 检测到1339(G/A)和1354(A/G)两个突变位点,对3'-UTR 区1354 位点(对应BMPR-IB基因mRNA序列NM_001009431.1 中3019 位点)进一步分析,表明在MT和ZT中检测到野生AA型、杂合突变AG型和纯合突变GG型,优势等位基因均为A;在MS、ZS及AS中检测到野生AA型和杂合突变AG型,优势等位基因均为A;在HM中检测到杂合突变AG型和纯合突变GG型,优势等位基因为G;经多态信息含量(polymorphism information content, PIC)分析可知：HM、MT、MS、ZS及AS处于低度多态(PIC<0.25);ZT 处于中度多态(0.25

• 猪SLC26A7基因内含子1中内源性逆转录病毒(ERV)转座子插入多态与生长性状的关联分析

  陈子璇, 迟诚林, 安亚龙, 陈才, 宋成义, 王宵燕

  硫酸盐/阴离子转运蛋白基因家族(solute carrier family 26, SLC26)成员中的SLC26A7基因可作为选择性的氯离子通道,调节肾脏电解质平衡,介导甲状腺激素生物合成,若其突变可导致甲状腺机能不全,影响个体生长发育。本研究采用比较基因组学和生物信息学方法,分析猪(Sus scrofa domesticus)SLC26A7基因的转座子插入,检测不同品种间的插入多态及其对大白猪生长性状的影响,并采用双荧光素酶报告基因检测内源性逆转录病毒(Endogenous retrovirus, ERV)插入对启动子活性的影响。研究表明,SLC26A7基因内含子1中有280 bp的ERV插入,引入品种ERV+频率高于中国地方猪种,大白猪ERV+/+个体100 kg体重日龄显著高于ERV-/-个体(P<0.05),ERV+/+个体宰前体重显著低于ERV-/-个体(P<0.05)。SLC26A7基因内含子1中插入的ERV显著抑制其启动子活性(P<0.05)。本研究证实了猪SLC26A7基因内含子1的ERV插入对猪100 kg体重日龄和宰前体重有显著影响(P<0.05),研究结果为该分子标记在猪分子育种中的应用提供了参考。

• 三穗鸭ITPR2基因组织表达、功能预测及其SNPs对蛋壳品质的影响

  谭光辉, 吴磊, 李杰章, 覃媛钰, 张依裕

  1,4,5-三磷酸肌醇Ⅱ型受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor typeⅡ, ITPR2)是钙离子跨膜转运活性的关键调控因子,影响蛋壳品质。本研究以贵州三穗鸭(Anas platyrhyncha domestica)为研究对象,利用qRT-PCR检测ITPR2基因的组织表达,将PCR纯化直接测序法结合DNAStar筛查鉴定蛋白结构域的SNP位点,运用一般线性模型分析SNP位点对蛋壳品质的遗传效应。结果显示,三穗鸭ITPR2基因在11个组织中均有表达,表达量依次为胰腺>蛋壳腺>腺胃>肾>胸肌>脾>小肠>肺>肝>心脏>肌胃,且胰腺和蛋壳腺表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。三穗鸭ITPR2基因外显子16、内含子14和内含子37共检测到3个中度多态(0.25<PIC<0.50)变异位点,其中g.128767757 A>G与g.128659402 G>T、g.128662092 C>T之间存在强连锁不平衡;g.128659402 G>T和g.128767757 A>G突变位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。关联分析显示,第16外显子突变位点g.128662092 C>T影响蛋壳品质,其TT基因型显著增加蛋壳强度(P<0.05);3个SNPs联合产生4种单倍型和10种双倍型,H4为优势单倍型,H2H4为优势双倍型;组合基因型对蛋壳品质具有不同程度影响,其中H1H1和H1H2显著提高蛋壳品质强度(P<0.05)。ITPR2蛋白功能预测结果显示,该基因编码蛋白包含2 647个氨基酸,属于非可溶性、不稳定蛋白;存在6个N-糖基化位点,其二、三级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主。本研究结果提示,三穗鸭ITPR2基因g.128662092 C>T突变位点CT基因型有利于提高蛋壳强度;3个SNP位点相互联合能显著蛋壳品质,可作为鸭蛋壳品质选择的遗传标记。

• 基于18S rRNA基因对植物寄生线虫的系统学研究

  李戌清, 郑经武

  长期以来,植物线虫的鉴定和分类主要以形态学特征和测量数据为依据,有关的方法主观且繁琐,难以可靠地鉴别线虫种内和种间群体间差异,而以DNA为基础的分子分类学研究方法,提供的信息客观简便,更能揭示不同类群的线虫在进化过程中的系统学关系。本研究分别利用NEMF1/S3和A/S3两对引物对来源于国内外植物根围土壤的小杆目、矛线目和三矛目94个植物寄生线虫种群的18S rRNA基因进行PCR扩增,所得序列经DNAstar软件联配比较、编辑,并用MEGA 6.0软件进行系统发育分析,以最大似然法(maximum likelihood, ML)构建系统发育树,结果发现,基于引物对A/S3扩增序列构建的植物线虫系统发育树能系统体现出不同线虫类群及同一线虫类群内不同种群间的系统发育关系。相关研究结果将为未来植物线虫系统进化研究提供一定的借鉴。

• 耐除草剂基因aroAA1501可拆分位点的鉴定

  宋亚亚, 杨江涛, 王志兴, 王旭静

  基因拆分技术(gene splitting)能有效避免转基因作物中目标性状向环境中的逃逸。为了利用基因拆分技术培育新型耐草甘膦(glyphosate)的转aroAA1501基因水稻(Oryza sativa),本研究依据aroAA1501蛋白的高级结构筛选出13个可能的拆分位点,PCR的方法将aroAA1501拆分成N端(An)和C端(Ac) 2部分,并分别与Ssp DnaE intein的N端(In)和C端(Ic)结合形成融合基因An-In和Ic-Ac。以pETDuet-1为基础载体,构建了单独含有An-In、Ic-Ac和同时含有An-In/Ic-Ac的原核表达载体共40个。将构建好的原核表达载体导入营养缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli)菌株ER2799中,通过功能互补试验证明aroAA1501在141/142、224/225和230/231位点处拆分后,拆分开的蛋白在蛋白内含肽intein介导下重新组装成有功能的完整蛋白。草甘膦耐受性试验证明230/231是最适宜的拆分位点,拆分后重新组装的蛋白对草甘膦的耐受性是完整aroAA1501蛋白的3倍。此研究为后期培育耐草甘膦的转aroAA1501基因水稻提供了基础资料。

• 绿原酸体外抗新型鸭呼肠孤病毒作用的研究

  潘力, 马秀丽, 黄中利, 李桂明, 唐亮, 于可响, 林树乾

  由新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus, NDRV)引起的NDRV病是困扰我国养鸭业的主要疾病之一。绿原酸(chlorogenic acid, CHA)作为许多中药的主要成分,在抗病毒方面发挥着重要作用。本研究拟明确CHA在NDRV感染幼仓鼠(Mesocricetus auratus)肾细胞系BHK-21不同阶段的抗病毒作用效果,为CHA抗NDRV的临床治疗提供参考依据。首先根据NDRV的S3基因序列(GenBank No. KJ879932)设计引物,建立NDRV实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, qPCR)检测方法;然后采用细胞增殖-毒性检测试剂盒测定CHA的细胞毒性,确定CHA在BHK-21细胞上的最大安全浓度;最后进行抗病毒试验,组Ⅰ向BHK-21细胞接种病毒NDRV,然后加入不同浓度的CHA,定期收集细胞冻融液;组Ⅱ的病毒吸附方式与组Ⅰ相同,用药前病毒NDRV先在BHK-21细胞上增殖10 h,定量检测增殖10 h后的病毒载量作为基值;以病毒增殖10 h为实验起始点,分别加入不同浓度的CHA,后续流程与组Ⅰ相同;以上两组均设置阴性和阳性对照。定期观察细胞病变,并将收集的样品进行NDRV的qPCR检测。结果显示,本研究建立的用于NDRV检测的qPCR方法最低检测限为92.5拷贝/μL;CHA在BHK-21细胞上的最大安全浓度为128 μg/mL;CHA能在体外抑制NDRV增殖,存在明显的剂量效应关系。本研究可为NDRV的相关机制研究和实际应用提供基础资料。