农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2023年第9期

• 不同叶面肥对水稻'隆晶优蒂占'生理特性及产量相关基因表达的影响

  彭佳元, 刘俊, 刘文祥, 张振乾

  优质杂交稻品质好,深受广大消费者喜爱。叶面肥作为作物根外追肥的一种方式,对其产量的提升有重要影响。为了筛选出合理的叶面肥配比,提高优质稻的产量,本研究以水稻(Oryza sativa) '隆晶优蒂占'为材料,研究了不同的叶面肥配比对优质杂交稻叶片生理生化指标、产量相关基因烯酰辅酶A水合酶(enoyl-CoA hydratase, NOG1)和叶绿素α加氧酶(pale green leaf-9, PGL-9)基因表达量及产量等方面的影响。采用油菜素内酯(brassinolide, BR)、硅(Si)和硒(Se)叶面肥进行组合,研究8个不同处理,以收获期产量为依据,找出适宜的叶面肥组合。结果表明,各处理水稻产量均高于对照(CK),其中Se处理水稻增产率最高(8.8%),其次是BR处理(8.3%)和Se+BR处理(8.2%)。在Si处理下,叶绿素含量、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性均孕穗期最高;在Si+BR、BR、Si处理下,可溶性糖含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化物酶(peroxidase, POD)活性均在抽穗期最高;在BR处理下,丙二醛(malonaldehyde, MDA)在分蘖期最低。相关性分析表明,NOG1和PGL-9表达量及叶绿素含量在抽穗期与产量均极显著相关,相关系数分别为-0.881、0.932、-0.940,另外在抽穗期,NOG1基因和PGL-9基因表达量与叶绿素含量之间极显著相关(P<0.01),相关系数分别为0.993、-0.971。综上所述,硒肥是最佳叶面肥,在抽穗期施用,可显著提高优质稻'隆晶优蒂占'的产量。本研究可为优质稻高产栽培提供参考。

• 甘蓝VQ基因家族鉴定及其响应根肿病菌侵染的表达分析

  王敏, 陈锦秀, 邰翔, 朱晓炜, 任云英, 薄天岳

  VQ蛋白是一类包含"FxxxVQxLTG"保守基序的氨基酸序列,是植物特有的蛋白家族,参与植物生长发育和各种胁迫响应过程。为了明确甘蓝(Brassica oleracea var. capitata) VQ基因家族的生物学功能,本研究从甘蓝全基因组中共鉴定出67个甘蓝VQ基因(BoVQ),对其进行生物信息学和表达模式分析。系统发育分析表明VQ基因共划分为7个亚组。染色体定位显示BoVQ基因在甘蓝9条染色体上呈不均匀地单一或成簇分布。转录组测序数据表明BoVQ基因在甘蓝的不同组织表达存在差异。11个BoVQ基因(BoVQ10, BoVQ20, BoVQ22, BoVQ32, BoVQ36, BoVQ43, BoVQ49, BoVQ54, BoVQ59, BoVQ60和BoVQ67)参与甘蓝花发育的整个过程。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示,BoVQ2、BoVQ12、BoVQ21、BoVQ26和BoVQ44基因在根肿病菌侵染下显著高表达。启动子顺式元件分析表明,病原菌应答元件W-box和防御与应激反应元件TC-rich repeats在响应根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)诱导的VQ基因启动子区域富集。蛋白互作网络预测BoVQ蛋白之间存在复杂的互作关系。该研究为进一步探索BoVQ基因在甘蓝中的功能和进化提供参考。

• 甜瓜组氨酸磷酸转运蛋白AHP家族的基因鉴定及表达分析

  赵望龙, 李嘉琪, 李猛, 王吉庆, 肖怀娟, 杜清洁, 李娟起

  组氨酸磷酸转运蛋白AHPs (Arabidopsis histidine phosphotransfer proteins)在植物生长发育和抵御生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。为探讨甜瓜(Cucumis melo) AHP的生物学功能和表达模式,本研究采用生物信息学分析、转录组测序和qRT-PCR等技术,对甜瓜AHP基因家族成员的数量、染色体位置、基因结构、亚细胞定位、蛋白保守基序、系统进化、启动子及基因表达等进行分析。结果表明,甜瓜AHP家族共有7个成员,分布于7条染色体上;氨基酸长度为109~412 aa,均表现为亲水性,全部成员均定位在细胞核或细胞外基质。系统进化分析发现,甜瓜AHP基因家族成员与黄瓜(Cucumis sativus)亲缘关系最近。预测分析发现,启动子上主要包含光响应、激素响应等顺式作用元件。转录组数据预测CmAHP5和CmAHP7在甜瓜的根、叶、雌花、雄花和果实中均有较高的表达,且二者在果实发育和成熟过程中可能起负调控作用;针对枯萎病和白粉病,CmAHP5可能起负调控作用,而CmAHP7可能起正调控作用。qRT-PCR证实CmAHP1~CmAHP5均参与低温响应,其中CmAHP4可能是关键的候选基因。本研究结果可为解析甜瓜AHP基因功能提供理论参考。

• 茶树细胞壁关联蛋白激酶基因家族的鉴定与表达分析

  焦小雨, 吴琼, 刘丹丹, 孙明慧, 王文杰

  细胞壁关联蛋白激酶(wall-associated kinase, WAK)是一类特殊的类受体蛋白激酶(receptor like kinase, RLK),在调节细胞生长和防御胁迫反应等方面发挥着重要作用。本研究利用生物信息学方法从茶树(Camellia sinensis)全基因组中鉴定出27个CsWAK成员,主要以基因簇的形式分布于2个染色体和1个组装片段上。根据系统进化关系将CsWAK分为5个亚组(Ⅰ~Ⅴ),同一亚组中的多数成员具有相似的基因结构和保守基序。转录组数据分析结果显示,大多数CsWAK成员在茶树的叶中高表达,其次是在根和茎中。在激素、低温、高盐等逆境胁迫下,CsWAK中多数成员基因表达变化差异不明显,少数基因表达变化显著,具有多样化和特异性。此外,对部分响应冷胁迫、PEG胁迫和盐胁迫的差异表达基因进行了qPCR分析。结果显示,低温处理下,所选9个基因均呈现先上升后下降的表达模式,且多数基因在低温处理3 h表达水平上调最为明显;在PEG处理下,所选9个基因的表达水平与转录组数据略有不同,但表达趋势相似;在NaCl处理下,所选9个基因的表达水平较未处理时显著下调,其中,CsWAK14对盐胁迫最为敏感。本研究结果为进一步解析CsWAK基因的生物学功能提供参考。

• 闽楠SPX基因家族的鉴定及其缺磷胁迫下的表达分析

  吴梦洁, 洪家都, 李芳燕, 周生财, 程龙军

  闽楠(Phoebe bournei)是我国特有的珍贵用材树种,在南方红壤土中造林易产生低磷胁迫,影响栽培效益。挖掘闽楠耐低磷重要基因资源,对利用分子辅助育种技术培育耐低磷闽楠品种具有重要意义。SPX基因家族成员与磷吸收和平衡相关,本研究在全基因组范围内对闽楠SPX基因家族成员进行筛选、鉴定,同时,利用qPCR技术分析了PbSPX基因在闽楠根、茎和叶中的组织表达情况,以及在缺磷处理10和60 d时,PbSPX基因在植株根和叶片中的表达模式。结果显示,20个PbSPX基因分布在闽楠的1到10号染色体,根据蛋白序列特征和进化关系分属4个亚家族,包括6个SPX亚家族成员,7个SPX-EXS亚家族成员,3个SPX-MFS亚家族成员和4个SPX-RING亚家族成员。启动子顺式作用元件分析表明,PbSPX基因启动子上含有P1BS、W-box和MBS等磷胁迫响应相关元件。组织特异性分析表明,PbSPX2、PbSPX-EXS1、PbSPX-RING2主要在根中表达,在叶中相对表达量较高的有12个PbSPX基因。在缺磷处理10和60 d的闽楠根中,除PbSPX6之外的其他5个SPX亚家族成员和PbSPX-MFS1都被缺磷显著诱导,与对照相比表达显著上调,而PbSPX-MFS2被显著抑制,表达显著下调。PbSPX-RING1和PbSPX-EXS1在缺磷10 d表达显著上调,PbSPX-RING3和PbSPX-EXS2在缺磷60 d表达显著上调。PbSPX-EXS6在缺磷10 d的根中表达显著下调,而在缺磷60 d时表达显著上调。叶片中PbSPX1~PbSPX5、PbSPX-EXS1及PbSPX-MFS1均在缺磷60 d时被诱导,与对照相比表达显著上调,而PbSPX-MFS2在缺磷60 d表达显著下调,与根中的表达趋势一致。作为磷转运体的亚家族成员PbSPX-EXS1、PbSPX-EXS2和PbSPX-EXS6在不同组织中对磷水平信号的响应不同。结果表明,闽楠SPX亚家族成员参与了磷胁迫响应,而且其表达受相应组织中磷水平的调控。本研究初步揭示了PbSPX基因家族成员与低磷胁迫响应的关系,为进一步研究其在低磷响应中的功能和机制提供了参考。

• 苎麻BnPCS1响应重金属镉胁迫功能分析

  张蕾, 全芮萍, 陈建福, 许明志, 崔国贤, 佘玮

  植物螯合肽合成酶(phytochelatin synthase, PCS)催化谷胱甘肽(glutathione, GSH)合成植物螯合肽(phytochelatins, PCs),在植物重金属解毒方面具有重要作用。植物PCS的重金属解毒功能因作物、品种和重金属胁迫程度的不同具有一定的差异性。苎麻(Boehmeria nivea)是南方重金属镉(Cd)污染土壤的替代种植作物,对重金属镉污染治理具有重要作用。为研究苎麻PCS响应重金属镉的分子机制,本研究将p426 GDP-BnPCS1酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达载体分别转化至野生型与镉敏感型酵母中,结果表明,50~100 μmol/L Cd2+胁迫下转基因酵母表现出更强的镉耐受能力。将BnPCS1在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过量表达,100 μmol/L Cd2+胁迫下转BnPCS1拟南芥的根长与生物量均高于野生型,过表达BnPCS1还增强了镉胁迫下拟南芥的抗氧化能力、GSH和PCs含量,以及AtPCS1、γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶1 (γ-glutamate cysteine ligase 1, AtGCL1)、谷氨酸合成酶1 (glutamate synthase, AtGS1)、重金属ATP酶1 (heavy metal ATPase 1, AtHMA1）和ABC转运蛋白1 (ATP-binding cassette transporter 1, AtATM1)基因的转录水平。以上结果表明BnPCS1能积极响应镉胁迫,增强苎麻镉耐受能力。本研究为苎麻耐镉分子育种提供了参考。

• NGF及其受体在牦牛与黄牛间脑及脑干不同区域中的表达与分布

  吴亚娟, 杜晓华, 刘霞, 郑丽平, 刘珊珊

  神经生长因子(nerve growth factor, NGF)主要通过结合其高亲和力受体酪氨酸蛋白激酶A(tyrosine protein kinase A, TrkA)在中枢神经系统组织或细胞低氧缺血适应性调控方面发挥重要的生理作用。本研究旨在阐明牦牛(Bos grunniens)适应高寒低氧环境过程中NGF和TrkA在间脑及脑干不同区域的表达及定位,并探讨二者之间的相互作用关系。分别采取不同海拔地区牦牛与黄牛(B. taurus)间脑及脑干组织,采用qPCR、Western blot、免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)对NGF及TrkA的表达水平及分布特征进行比较研究。结果显示,NGF和TrkA基因及蛋白在牦牛与黄牛间脑及脑干不同区域组织中均有表达,且表达存有差异。NGF基因及蛋白在牦牛与黄牛丘脑中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05);牦牛丘脑、延髓中NGF基因及蛋白水平显著高于黄牛(P<0.05),但在下丘脑和脑桥中均低于黄牛;而TrkA基因水平在丘脑、脑桥、延髓中均显著高于黄牛(P<0.05),在下丘脑中与黄牛无显著差异;TrkA蛋白水平在丘脑、下丘脑、脑桥及延髓中均与黄牛无显著差异。NGF和TrkA蛋白在牦牛与黄牛间脑及脑干中的分布与定位特征基本一致,在丘脑、下丘脑中NGF和TrkA蛋白主要定位于多形细胞胞质中,脑桥中主要定位于运动神经元,延髓中主要定位于神经元胞质。以上结果提示,下丘脑及脑桥对低氧比较耐受,丘脑及延髓对低氧比较敏感,通过激活相关的神经保护机制上调NGF表达增强牦牛丘脑与延髓对低氧的耐受性,而TrkA在低氧条件下发挥作用不显著。NGF及TrkA主要定位于间脑及脑干各区域中的神经元胞质及神经胶质细胞,说明二者协同对神经元及神经胶质细胞发挥内源性神经保护作用,进而保护脑组织。本研究为进一步探究牦牛脑组织低氧适应机制提供了理论依据与数据参考。

• AGPAT4基因干扰及过表达对西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞脂代谢的影响

  姚玮玮, 罗军, 王馨培, 屈小鹏, 田慧彬, 牛慧敏

  溶血磷脂酸酰基转移酶4 (1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 4, AGPAT4)是1-酰基甘油-3-磷酸O酰基转移酶家族的成员,具有催化甘油三酯合成的作用。为了阐明AGPAT4在山羊(Capra hircus)乳腺上皮细胞(goat mammary epithelial cells, GMECs)中的基因序列、结构以及AGPAT4对GMECs脂肪酸合成代谢的影响。本研究以西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞为实验材料,通过RT-PCR克隆AGPAT4基因,应用在线网站进行生物信息学分析,干扰与过表达AGPAT4进行功能分析。结果表明,本研究成功克隆得到AGPAT4基因CDS区1 137 bp (sequence ID: XM_005684959.3),编码378个氨基酸,蛋白分子量为43 939.35 u,理论pI值为8.92,存在跨膜结构,无信号肽,为携带正电荷的不稳定蛋白;AGPAT4蛋白与AGPAT1、AGPAT2、脂蛋白3 (lipin3, LPIN3)、二酰基甘油激酶(diacylglycerol kinases, DGK)、磷脂酶D (phospholipase D, PLD)、胞苷二磷酸-二酰基甘油合成酶(cytidine diphosphate-diacylglycerol synthase, CDS)等蛋白存在互作关系;干扰AGPAT4显著下调乙酰辅酶A羧化酶(acetyl coa carboxylase, ACC)基因表达(P<0.05);过表达AGPAT4显著上调硬脂酰辅酶A去饱和酶1 (stearoyl-coenzyme A desaturase, SCD1)与ACC基因表达(P<0.05)并显著促进细胞内甘油三酯积累(P<0.05)。以上结果表明,AGPAT4基因在山羊乳腺上皮细胞中对脂合成具有正向调控作用。本研究为后续开展AGPAT4基因对羊奶乳脂代谢的调控机制研究提供了基础资料。

• CircACAP2对奶山羊乳腺上皮细胞凋亡及β-酪蛋白和甘油三酯合成的影响

  江悦, 朱俊儒, 吴双虎, 寇晓宇, 安小鹏, 宋宇轩

  奶山羊(Capra hircus)品种选育的重要指标包括乳腺上皮细胞的数量和活性、泌乳量大小和乳成分。乳腺生长、发育及泌乳活动涉及复杂的调控过程。circACAP2 (circular ArfGAP with coiled-coil, ankyrin repeat and PH domains 2)可以促进心肌细胞凋亡,同时在乳腺癌组织中高表达,加快乳腺癌进程,但其对奶山羊乳腺上皮细胞(goats mammary epithelial cells, GMECs)的调控作用尚不清楚。本研究构建circACAP2过表达和干扰载体,并转染GMECs,双荧光素酶活性分析结果显示,circACAP2能与miR-21靶向结合;qRT-PCR结果显示,circACAP2干扰使miR-21表达量显著提高。细胞增殖检测试剂盒CCK8 (Cell Counting Kit-8)和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine, EdU)检测结果表明,circACAP2对GMECs增殖具有抑制作用;AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测结果显示,circACAP2对GMECs凋亡具有促进作用。ELISA试剂盒检测结果显示,circACAP2使GMECs的β-酪蛋白和甘油三酯分泌量降低。对ERK-Bax/Bcl-2凋亡信号通路和PI3K/mTOR/S6K泌乳信号通路相关分子进行Western blot检测,结果表明,circACAP2抑制pERK1/2和Bcl-2表达、促进Bax表达,同时PI3K、mTOR和S6K蛋白的磷酸化水平下降。上述研究结果表明,CircACAP2可能通过激活ERK-Bax/Bcl-2凋亡相关信号通路而促进GMECs凋亡,同时通过抑制泌乳相关的PI3K/mTOR/S6K信号通路而减少GMECs的β-酪蛋白和甘油三酯分泌。本研究为深入探讨关中奶山羊泌乳机理提供了基础资料。

• FSH来源及其剂量对西藏阿旺绵羊超数排卵效果的比较

  李涛, 王幸栓, 虞莲, 杨志勇, 林耀民, 高志敏, 李建强, 雷安民

  阿旺绵羊(Ovis aries)作为西藏高原地区特有的珍稀羊品种资源,具有独特的风味、优质的产肉性能以及较强的高原适应能力。为了防止阿旺绵羊存栏量下降和保护当地种质资源,本研究通过同期发情、超数排卵、手术法回收胚胎等方法,分析了国产和进口促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)来源及其剂量、超数排卵次数和有无发情史对阿旺绵羊超排效果的影响。结果表明,国产FSH对阿旺绵羊的超数排卵效果最佳,黄体平均数和有效胚胎平均数显著高于进口FSH组和国产+进口FSH组(P<0.05),可用胚平均数和胚胎回收率无差异。270和500 IU的FSH对阿旺绵羊超数排卵效果相同,分别对>50和40~50 kg的阿旺绵羊的超数排卵效果影响不显著;有无发情史对超数排卵效果无显著影响。另外,首次经过超数排卵的阿旺绵羊的总黄体数和回收胚数极显著高于多次超数排卵组(P<0.01)。因此,270 IU的国产FSH对阿旺绵羊超数排卵效果最好。本研究可以为当地阿旺绵羊保种和扩繁工作提供参考。

• 长江刀鲚FABP7基因遗传多态性及其与生长性状的相关分析

  于爱清, 施永海, 严银龙

  长江刀鲚(Coilia ectenes)是我国重要的经济鱼类,目前其自然种质资源急剧衰退,探究其脂肪酸结合蛋白7 (C. ectenes fatty acid-binding proteins 7, CeFABP7)基因连锁SNP位点与其生长性状的相关性,对于其生长性状的遗传改良及新品种的培育具有重要作用。本研究基于长江刀鲚的转录组数据,利用基因克隆技术获取CeFABP7基因的cDNA全长序列和基因组DNA序列,对其核心选育F3代群体的20个具有极端生长表型个体的CeFABP7基因全长序列直接测序,筛选获得该基因上的SNP位点后,再利用直接测序法或SnaPshot法对同批次随机选取的100尾长江刀鲚进行基因分型,最后通过最小二乘法分析基因多态性与长江刀鲚生长性状的相关性。结果显示,该基因cDNA全长1 295 bp,ORF由399个核苷酸组成,编码132个氨基酸;基因组DNA全长1 899 bp,包括4个外显子和3个内含子;共检测到5个SNP突变位点和1个TGT插入/缺失突变(I/D),分布于5′-非编码区、第1内含子和第3内含子;位点g.276C>G与长江刀鲚的体长、体高和体质量性状均显著相关(P<0.05),位点g.306A>C、g.747C>T和g.825C>T与长江刀鲚的体质量和体高性状显著相关(P<0.05),位点g.1447A>T和g.1532I>D由于部分基因型个体数量较少,显示与生长性状的相关性不显著;6个位点对长江刀鲚养殖群体遗传分析显示,长江刀鲚养殖群体的平均观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)、平均期望杂合度(expected heterozygosity, He)和平均多态信息含量(polymorphic information of content, PIC)分别为0.257、0.339和0.275。长江刀鲚FABP7基因上的位点g.276C>G有望成为剔除劣质长江刀鲚繁育亲本的重要候选分子标记,本研究对长江刀鲚的分子标记辅助育种具有理论指导意义。

• 福寿螺SOX9L基因的克隆与表达分析

  张爽, 苏靖景, 王欣慧, 张颖, 刘丰瑜, 刘婧琪, 袁紫霞, 吕佳励, 商凯琳, 杨受保

  福寿螺(Pomacea canaliculata)是中国的16种危害最大的外来入侵物种之一。SOX9 (SRY-related HMG box gene 9)是一类与早期胚胎发育有关的SOXE亚族基因。为探究福寿螺SOX9基因的功能,以不同发育阶段的福寿螺—仔螺(rankⅡ)、中螺(rankⅢ)和雌雄成螺(rankⅣ)为材料,在转录组测序的基础上,采用RT-PCR技术克隆得到福寿螺SOX9类似物基因的cDNA序列,命名为PcSOX9L (GenBank No. OP564918),并对其进行生物信息学和表达特性分析。结果表明,PcSOX9L基因包含1个1 701 bp的开放阅读框,编码566个氨基酸的假定蛋白,并含有2个保守结构域,分别是Sox-N和HMG-box-domain;PcSOX9L与其他动物SOX9蛋白的氨基酸序列相似性为52.72%~82.84%。qRT-PCR分析显示,PcSOX9L基因在雌雄成螺的性腺、肝脏、鳃、外套膜、腹足和雌性成螺的蛋白腺组织中均有表达,其中,在雄性成螺肝脏中表达量最高,且极显著高于雌性成螺的肝脏组织(P<0.01);在性腺组织中,雄性成螺的精巢比雌性成螺卵巢中的表达量高,但是差异不显著;PcSOX9L在从仔螺、中螺到性成熟成螺的3个不同发育阶段中均有表达,在仔螺中表达量最高;同时,PcSOX9L表达量在向雄性成螺发育的3个阶段中依次为仔螺>雄性成螺>中螺;在向雌性成螺发育的3个阶段中依次为仔螺>中螺>雌性成螺,提示该基因可能在福寿螺早期胚胎发育和性别决定中发挥作用。本研究为进一步分析SOX9基因在福寿螺性腺发育和性别决定中的作用机制提供基础资料。

• NbMVKa与新竹番茄曲叶病毒AV2蛋白互作对病毒致病性的影响

  李丁山, 韩星, 林文忠, 查晴辰, 张文文, 杜振国, 张洁, 吴祖建

  单组分双生病毒V2蛋白在病毒侵染过程中行使重要功能,而双组分双生病毒AV2蛋白功能的研究相对较少。为揭示双组分双生病毒新竹番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Hsinchu virus, ToLCHsV) AV2蛋白功能,本研究利用邻近依赖的生物素鉴定(proximity-dependent biotin identification, BioID)-质谱联用技术,在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中初步筛选出与AV2邻近的多个寄主蛋白。利用酵母双杂交(yeast two hybrid, YTH)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)验证了本氏烟甲羟戊酸激酶a (N. benthamiana mevalonate kinase a, NbMVKa)和ToLCHsV-AV2存在互作。利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)诱导的基因沉默技术,将ToLCHsV侵染性克隆接种NbMVKa沉默的本氏烟,接种10 d后,NbMVKa沉默的本氏烟症状不明显,而未沉默植株表现叶片卷曲,同时利用Southern blot分析发现,沉默植株的病毒DNA积累量相对减少;接种20 d后,NbMVKa沉默的本氏烟和未沉默植株症状基本一致。结果表明,NbMVKa可能通过与ToLCHsV-AV2互作而对病毒致病起正调控的作用。本研究结果为进一步阐明双组分双生病毒AV2蛋白功能提供理论依据。

• 广东番木瓜曲叶病毒和一品红曲叶病毒致病性分析

  李景远, 林文忠, 李丁山, 马崇欢, 吴祖建, 杜振国, 张洁

  近年来,广东番木瓜曲叶病毒(Papaya leaf curl Guangdong virus, PaLCuGDV)和一品红曲叶病毒(Euphorbia leaf curl virus, EuLCV)经常在百香果(Passiflora edulis)上被鉴定。本研究从福建地区表现典型双生病毒危害症状的百香果上扩增得到该2种病毒的全长序列,分别为2 732和2 745 bp;为明确PaLCuGDV和EuLCV的致病性,利用同源重组技术构建了2种病毒的侵染性克隆,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法接种本氏烟(Nicotiana benthamiana),结果发现,接种EuLCV的本氏烟表现出明显矮化且顶端叶片畸形卷曲症状,受病害危害明显重于接种PaLCuGDV,后者仅表现新叶稍微卷曲和叶片黄化;2种病毒混合侵染,受病害危害重于单独接种EuLCV或PaLCuGDV。Southern blot结果显示,PaLCuGDV和EuLCV单独及混合接种的烟草均有较高的病毒积累量。本研究首次构建了PaLCuGDV的侵染性克隆,并发现EuLCV和PaLCuGDV复合侵染会加重病害症状。本研究为解析PaLCuGDV和EuLCV的致病机制提供参考。

• 分子伴侣TF促进塞内卡病毒VP2蛋白在大肠杆菌表达

  杨锐, 茹毅, 郝荣增, 李亚军, 杨洋, 任蕊芳, 卢炳州, 毛玉涵, 张越, 郑海学, 张勇, 赵兴绪

  A型塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)是一种新近流行的小RNA病毒,严重危害着全球养猪业的健康发展。SVA病毒结构蛋白2 (viral structural protein 2, VP2)在诱导机体免疫应答中发挥了重要的作用。为制备可溶性的SVA结构蛋白VP2,并系统分析其免疫原性,本研究首先以SVA/CH-FJ-2017毒株基因序列为基础,构建SVA-VP2蛋白重组表达质粒pET28a-SVA-VP2。然后将pET28a-SVA-VP2重组质粒与分子伴侣pTf16质粒共同转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)感受态细胞,利用分子伴侣TF (trigger factor)在原核表达系统中促进蛋白可溶性表达的特性,诱导表达可溶性的SVA-VP2重组蛋白。纯化目标蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定后,免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),通过间接ELISA检测血清抗体水平,病毒中和试验测定中和抗体滴度,流式细胞术检测分析脾脏CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群,以及脾脏淋巴细胞增殖及细胞因子产生的情况。结果表明,利用分子伴侣TF16成功制备了可溶性的VP2重组蛋白,并且VP2重组蛋白能够与SVA阳性血清发生特异性免疫反应,免疫组小鼠的血清抗体效价可达1:32 000,中和抗体水平可达1:128,免疫组小鼠脾脏CD4+和CD8+ T淋巴细胞百分比含量极显著高于对照组(P<0.001),干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)、白细胞介素-2 (interleukin-2, IL-2)、IL-4和IL-10等细胞因子表达水平极显著高于对照组(P<0.001)。本研究成功利用分子伴侣TF共表达制备了可溶性的重组VP2蛋白,且重组VP2蛋白在体内、外试验中均具有良好的免疫原性,能够引发机体产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答,为SVA亚单位疫苗和诊断制剂的研制提供了实验材料和理论依据。

• miRNA调控畜禽附睾生物功能的研究进展

  郭世浩, 曹骏逸, 盖凯, 丛百林, 刘一正, 邢凯, 陈俐, 盛熙晖

  公畜禽的繁殖性能和精液品质对畜牧生产具有重要意义,与母畜禽受胎率、产仔数、成活率等密切相关。附睾作为重要的繁殖器官,负责精子的浓缩、成熟(包括精子活力的获得和受精能力)、保护和储存。miRNA (microRNA) 是一类长度约22 nt的非编码单链RNA 分子,与畜禽附睾的一系列生理过程密切相关,参与调控精子活力、精子成熟、精子细胞凋亡、离子通道活性、铜离子解毒等在内的不同生物过程。本文总结了哺乳动物与禽类附睾组织结构和功能的异同,综述了miRNA在调控畜禽附睾中精子活力、成熟、细胞凋亡、离子转运等生物学功能研究进展,为miRNA在附睾中的调控机制研究和种公畜繁殖性能的遗传育种研究提供参考。

• 种子内生菌促生机制和抗病机理研究进展

  翟凯辉, 张影影, 高夕全

  在植物-微生物互作过程中,由病原微生物引起的病害严重影响作物的产量和品质,而植物组织中的有益内生菌则在植物促生和抗病反应中发挥着重要作用,其中,丰富多样的种子内生菌正越来越受到人们的关注和重视。研究表明,内生菌通过与宿主植物的共进化,在种子中定植并进行世代间垂直传播,与宿主植物形成互惠共生体,在植物生命过程的各个阶段发挥促生和抗病等作用。但相比于根际微生物,种子内生菌受宿主遗传和环境因素等影响的机制、参与植物促生、抗病的功能和机制等方面的研究还不够深入。本文在介绍种子内生菌的种类和传播特征等内容的基础上,对种子内生菌在植物促生、与病原菌的互作机制、种子内生菌在植物抗病中的功能和应用等方面的研究进展进行了阐述,并针对当前种子内生菌研究中可能存在的问题对将来的可能研究方向提出建议,以期为在作物改良中开发和利用种子内生菌资源提供理论参考。

• 基于农杆菌介导的茄子枯萎病菌遗传转化体系建立及GFP标记菌株的构建

  严亚琴, 胡天华, 王五宏, 胡海娇, 魏庆镇, 汪精磊, 包崇来

  由尖孢镰刀菌茄子专化型(Fusarium oxysporum f. sp. melongenae)引起的茄子(Solanum melongena)枯萎病严重制约茄子的生产,其致病机制尚不明确。本研究以茄子枯萎病菌的分生孢子为转化受体,利用携带GFP表达载体pCAMsgfp的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化茄子枯萎病菌,建立并优化了农杆菌介导的茄子枯萎病菌遗传转化体系。结果表明,当农杆菌光密度(optical density)值为0.5时,在200 μmol/L乙酰丁香酮诱导条件下,与浓度为1×106个/mL的病原菌分生孢子悬浮液等体积混合后,在共培养温度为25 ℃~28 ℃条件下共培养48 h,茄子枯萎病菌的转化效率最高可达319±10.21个转化子/106个孢子。GFP的特异性引物PCR鉴定结果以及荧光观察表明GFP基因能够正常表达。本研究建立并优化了根癌农杆菌介导的茄子枯萎病菌的遗传转化体系,并获得了遗传稳定的GFP标记菌株,为病原菌与茄子互作的机制研究提供技术支撑。

• 浙贝母干腐病病原真菌分子鉴定

  张羽加, 李吉二, 温思思, 徐云飞, 赵伟春

  道地药材浙贝母(Fritillaria thunbergii)是浙江省金华市、丽水市等地重要的经济作物之一。近年来真菌性病害频发,其中干腐病发病严重,影响浙贝母产量和质量。本研究采用病组织分离法在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA)上分离纯化浙贝母干腐病病原真菌;采用菌落形态、菌丝及孢子形态观察法初步鉴定病原真菌;分别用核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)、翻译延伸因子基因(translation elongation factor 1 alpha, TEF-1α)、RNA聚合酶Ⅱ亚基(the second largest subunit of the nuclear RNA polymerase enzyme Ⅱ, RPB2)、热激蛋白60 (heat shock protein, HSP60)、3-磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, G3PDH)和茄病镰刀菌特异性序列(ITS-specific fragment of Fusarium solani, SOL)等6个基因的序列对病原真菌基因组DNA进行PCR扩增并测序,在GenBank中进行同源性比对并构建系统发育树,确定菌种种类。采用有创菌饼法和无创菌饼法检测真菌的致病性。结果表明,从浙贝母干腐病病株中分离得到14株真菌分离物,通过PCR扩增和测序分析,最终鉴定出4种病原真菌;通过构建发育树以及致病性实验证明了致病菌分别为茄病镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、变红镰刀菌(F. incarnatum)和木贼镰刀菌(F. equiseti)。本研究明确了浙贝母干腐病致病菌亦可为变红镰刀菌和木贼镰刀菌,并经PCR扩增获得了变红镰刀菌(MN386064)和木贼镰刀菌(MN386065)的G3PDH基因的部分序列,丰富了2种镰刀菌的基因序列,同时也为后续相关研究提供比对基础。