农业生物技术学报杂志

农业生物技术学报杂志2021年第12期

• 杧果DBB基因鉴定及其在胶孢炭疽菌和细菌性黑斑病菌侵染过程中的表达分析

  孙宇, 刘志鑫, 叶子, 高爱平, 罗睿雄, 蒲金基, 张贺

  B-box蛋白是一类锌指结构转录因子,其功能具有普遍性和特异性。为了揭示双B-box结构域锌指蛋白(double B-box, DBB)基因家族在杧果(Mangifera indica)中的序列特征及其表达特性,本研究以杧果全基因组数据为基础,采用生物信息学的方法对杧果DBB基因家族成员进行序列分析,并通过qRT-PCR技术研究杧果胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides, Cg)和细菌性黑斑病菌(Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae, Xcm)侵染过程中杧果DBB基因家族成员的相对表达量。结果表明,从杧果基因组中鉴定了9个DBB基因家族成员,命名为MiDBB1~9,9个MiDBBs蛋白均为不稳定亲水酸性蛋白,主要定位于细胞核中,不仅三级结构类似,N端还具有相同位点的两个保守结构域(B-box1和B-box2)。根据蛋白结构预测、系统发育关系、保守基序及多重序列比对分析推测,杧果DBB基因家族在进化上具有结构保守性,功能上具有相似性。杧果与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、苹果(Malus domestica)、菠萝(Ananas comosus)和毛果杨(Populus trichocarpa)构建的系统发育树显示,杧果DBB与毛果杨DBB亲缘关系最近,其次是苹果。qRT-PCR结果显示,胶孢炭疽菌侵染过程中,MiDBB1~9的相对表达量在12~48 h内持续上调,细菌性黑斑病菌侵染过程中,MiDBB2和MiDBB3的相对表达量在12~72 h内持续上调,初步确定了杧果DBB基因表达受胶孢炭疽菌和细菌性黑斑病菌的诱导。本研究结果为后续研究杧果DBB基因家族成员的功能和作用机制提供参考。

• 扭果花旗杆DeTIP2;1基因的克隆、亚细胞定位和表达分析

  邹丽媛, 马薇, 李金玉, 葛风伟

  水通道蛋白(aquaporins, AQPs)在植物生长发育及抵抗非生物胁迫中具有重要的作用。本研究从新疆旱生植物扭果花旗杆(Dontostemon elegans)转录组数据中筛选AQPs家族唯一上调液泡膜内蛋白(D. elegans tonoplast intrinsic protein, DeTIP2;1)基因(GenBank No. MW505902),克隆全长序列,进行生物信息学分析及表达分析,并进行亚细胞定位。结果表明,750 bp的DeTIP2;1编码249个氨基酸,蛋白分子量为24.92 kD,理论等电点为5.30,含有2个高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(asparagine-proline-alanine, NPA)基序。干旱和盐胁迫均能影响DeTIP2;1基因的表达,且该基因的表达具有组织特异性;亚细胞定位显示DeTIP2;1主要定位于液泡膜。上述结果表明,DeTIP2;1可能参与扭果花旗杆根部水分吸收和运输。本研究为干旱区植物资源功能基因的挖掘及筛选提供数据支持。

• 木豆类黄酮代谢通路关键基因家族的鉴定与表达分析

  杜婷婷, 宋治华, 董碧莹, 曹红燕, 刘腾跃, 杨琬珑, 祁萌, 陈婷, 王梦莹, 孟冬, 杨清, 付玉杰

  黄酮类化合物是植物体内重要的次生代谢产物,在植物生长发育和抵御逆境胁迫中均发挥着重要作用。木豆(Cajanus cajan)是一种生长在喀斯特地域高酸铝土壤的木本豆科先锋树种,富含多种类黄酮等次生代谢物。本研究针对鉴定类黄酮生物合成的关键通路,筛选和鉴定了木豆中8类关键酶基因家族,分别是苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、肉桂酸4-羟化酶(cinnamic acid-4-hydroxylase, C4H)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase, 4CL)、查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)、黄酮醇合成酶(flavonol synthase, FLS)、二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR),并利用生物信息学软件对其进行了系统发育、基因结构、蛋白结构和启动子顺式作用元件分析以及胁迫条件下的代谢通路基因表达调控分析。系统进化分析显示,PAL、C4H、4CL、CHI基因家族中的部分成员能够与大豆(Glycine max)中的基因聚类在一起,而CHS、FLS、DFR基因家族中仅体现出家族内部成员之间存在序列相似性。蛋白结构分析表明,每个基因家族均含有特殊的保守结构域。启动子顺式作用元件分析结果显示,6类基因家族中含茉莉酸甲酯(MeJA)响应元件的基因占总基因的50%以上。同时,针对木豆的生境特点,本研究对其在铝胁迫和茉莉酸甲酯处理下的8类基因家族进行了RNA-seq分析,结果显示铝胁迫处理下,相对表达量较高的CcPAL2、CcC4H1、CcCHS5~7和CcCHS12均显著上调,而CcCHI4~5和CcFLS7均呈现明显下调趋势,表明铝胁迫下木豆的查尔酮可能积累,推测其可能在抗铝方面发挥一定作用。MeJA处理中,CcC4H1、CcCHS5、CcCHS7、CcCHI4显著上调,而CcF3H下调为对照的0.6倍;同时,下游分支通路中的CcFLS1、CcFLS5、CcFLS6均显著上调,以上结果表明MeJA也可能促进了柚皮素和黄酮醇的积累,推测该物质可能在MeJA信号调控通路中可能发挥着重要作用。以上类黄酮生物合成酶基因在不同阶段的表达变化经qPCR验证与转录组测序结果一致。本研究揭示了类黄酮生物合成关键酶在不同胁迫下的表达模式,为进一步探究查尔酮、黄酮醇等类黄酮物质在逆境胁迫中的调控作用提供参考依据。

• 痤疮丙酸杆菌异构酶在小鼠细胞中异源表达及t10c12-共轭亚油酸的制备

  王超, 王洋洋, 饶喻, 李美娟, 刘宗平, 李世丽, 苟克勉

  来源于痤疮丙酸杆菌异构酶(Propionibacterium acnes isomerase, PAI)能够将亚油酸转化成反式10,顺式12-共轭亚油酸(trans 10, cis 12-conjugated linoleic acid, t10c12-CLA),饲喂 t10c12-CLA的动物会减少脂肪沉积和乳脂含量,能量的动态平衡受到影响。本研究用密码子优化的pai基因转染小鼠(Mus musculus) 3T3细胞,经高压气相色谱分析证实,PAI将底物亚油酸高效催化成t10c12-CLA,t10c12-CLA含量最高达到了细胞内多不饱和脂肪酸总量的7.09%;与转染pIRES2-AcGFP1的对照细胞株比较,转染pai基因并合成t10c12-CLA的细胞株出现亚油酸积累(12.46% vs 14.38%~15.54%)(P<0.05)和花生四烯酸减少(13.31% vs 9.03%~11.13%)(P<0.05),同时硬脂酸(14.07% vs 11.85%~12.54%)(P<0.05)和油酸(20.29% vs 14.89%~16.87%)(P<0.05)同步减少。qPCR结果显示,pai转染细胞中生成的t10c12-CLA可上调硬脂酰辅酶A去饱和酶1 (stearoyl-CoA desaturase 1, scd1)基因表达(P<0.05),可能是转基因细胞中硬脂酸含量下降的原因;但是,外源t10c12-CLA没有下调脂肪酸去饱和酶1 (fatty acid desaturase 1, fads1)和fads2基因表达。高压气相色谱检测结果显示,外源添加的t10c12-CLA阻滞了亚油酸向下游花生四烯酸的代谢(P<0.05),即t10c12-CLA可能竞争性结合FADS2/FADS1酶系,从而抑制亚油酸向花生四烯酸的正常代谢。本研究证实微生物的pai基因能够在哺乳动物细胞中正常表达并生产t10c12-CLA,可为研制pai转基因动物提供参考依据。

• 我国乌骨鸡品种遗传多样性和品种鉴定

  贾晓旭, 陆俊贤, 唐修君, 樊艳凤, 黄胜海, 葛庆联, 高玉时

  乌骨鸡(Gallus gallus domesticus)是我国优良的鸡遗传资源,具有一定药用价值。研究我国乌骨鸡品种的遗传多样性和品种鉴定,对于品种的保护具有重要意义。本研究对丝羽乌骨鸡、东乡绿壳蛋鸡、金湖乌凤鸡、余干乌骨鸡和竹丝鸡等5个乌骨鸡品种的197个个体的线粒体DNA的D-loop区全序列进行了检测。结果表明,5个乌骨鸡品种的D-loop区序列全长为1 231~1 232 bp,1 231 bp的序列在859 bp处存在1处单碱基缺失位点。共计检测到27个核苷酸多态位点,界定了18个单倍型。单倍型多样性、核苷酸多样性和平均核苷酸差异分别为0.862±0.013、0.00580±0.00107和7.137。中介网络图分析显示,5个乌骨鸡品种含有A、B、C和E共4个分支(单倍型类群),但各单倍型散布在不同品种中,形态学和地理格局分布不明显。遗传距离分析表明,竹丝鸡和丝羽乌骨鸡遗传距离较远。我国乌骨鸡有4个母系来源,遗传多样性相对较低。该研究结果为我国乌骨鸡遗传资源的保护、选育和鉴定工作提供了遗传背景信息。

• 浙江省地方品种鸡白血病J亚群感染调查及遗传进化分析

  倪征, 陈柳, 汤傲星, 唐井玉, 云涛, 刘光清, 张存

  J亚群禽白血病(subgroup J of avian leukosis)是由肉鸡(Gallus gallus)中分离的一种由J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J, ALV-J)引起的禽白血病的亚群,其临床上主要造成患病禽类的生长和免疫抑制,该病的普遍流行给养禽业带来严重危害。本研究使用ELISA的方法对浙江省杭州光大种禽场的地方品种鸡群鸡白血病J亚群(ALV-J)的感染情况进行了检测,并对阳性样本进行了病毒分离和鉴定。通过扩增分离株的囊膜糖蛋白(envelope glycoprotein 85, GP85)基因,对分离的禽白血病病毒进行了遗传进化分析。研究结果表明,10个地方品种鸡ALV-J阳性检出率差异很大,最低者只有4%,最高者则达到46%。用原代鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts, CEFs)从检测阳性样本中分离出3株ALV-J (分别命名为ZJ20-1, ZJ20-2和ZJ20-3)。用PCR方法从3个分离株中均扩增出GP85特异性片段,利用DNA STAR软件对分离病毒的GP85基因进行遗传演化分析。结果表明,本研究中分离的ALV-J分离株与参考毒株存在一定的遗传演化关系,可以分为两个拓朴群(G1和G2),分离的3株病毒属于G1群。与国内其他分离株的同源性为88%~98.0%。本研究为进一步深入研究ALV-J在我国鸡场中的流行规律及禽白血病净化提供了参考资料。

• 斑鳢生长激素基因的克隆及表达分析

  高丹丹, 欧密, 吴燕铎, 陈昆慈, 刘海洋, 罗青, 赵建

  生长激素(growth hormone, GH)是垂体分泌的多肽,在硬骨鱼类的发育和体细胞的生长过程中具有重要的调节作用。为探究生长激素在斑鳢(Channa maculata)雌、雄生长差异中的作用及其与性激素的相互作用机制,本研究克隆了斑鳢GH基因(GenBank No. MW574005)序列,分析了其表达模式及对外源性类固醇激素的响应。结果表明,斑鳢GH基因cDNA序列全长882 bp,开放阅读框(ORF)为639 bp,共编码212个氨基酸。斑鳢GH基因序列长1 604 bp,含有5个外显子和4个内含子。在5'端上游鉴定到一段长1 199 bp的侧翼序列,该序列含有前B细胞白血病转录因子3 (pre-B-cell leukemia transcription factor 3, PBX3)、信号转导和转录激活因子1 (signal transducers and activators of transcription 1, STA1)和叉头转录因子O3 (forkhead box O3, FOXO3)等多种转录因子结合位点。组织表达分析显示,GH在斑鳢垂体中高表达,且在雄性中的表达极显著高于雌性(P<0.01);不同发育时期表达分析显示,GH基因在365 d的雄性斑鳢垂体中表达量最高,且极显著高于同时期雌性斑鳢(P<0.01)。经ELISA检测验证,各发育时期内,雄性个体血清中的GH含量均高于同时期雌性个体。激素诱导实验显示,17α-乙炔基雌二醇(17α-ethynylestradiol, EE2)抑制雌、雄斑鳢垂体中GH基因的表达;17α-甲基睾丸酮(17α-methyltestosterone, MT)促进雄鱼垂体中GH基因的表达,但降低雌鱼垂体中GH基因的表达。该研究为进一步探究斑鳢雌雄生长二态性机制和生长调控的分子机理研究提供参考。

• 水稻草状矮缩病毒P3与钙调磷酸酶B样蛋白1的互作研究

  敬新欣, 宋霞, 鲁国东, 吴祖建

  钙调磷酸酶B样蛋白(calcineurin B-like proteins, CBLs)是一类具有多个Ca2+结合结构域且氨基酸序列高度保守的小分子量蛋白。在植物中,CBLs与CBL互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases, CIPKs)相互作用共同参与植物应对多种生物和非生物胁迫。本研究以水稻草状矮缩病毒(Rice grassy stunt virus, RGSV)致病蛋白RGSV P3为诱饵蛋白,利用酵母双杂交筛选了本氏烟(Nicotiana benthamiana) cDNA文库,结果发现RGSV P3与NbCBL1互作。从'日本晴'水稻(Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare)叶片中克隆了OsCBL1的CDS全序列,并通过酵母双杂交及双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementarity, BiFC)实验证实了RGSV P3与OsCBL1互作。同时发现RGSV P3通过与OsCBL1互作将OsCBL1从细胞膜招募到细胞核。另外,qPCR分析结果显示,RGSV侵染可以显著诱导OsCBL1的表达。以上结果表明,在RGSV侵染水稻过程中,P3可能通过与OsCBL1互作影响其参与的离子信号途径,进而调控病毒的侵染。该研究为深入揭示RGSV的致病性提供了思路。

• 灰葡萄孢MYB转录因子家族基因的鉴定及表达分析

  朱倩洁, 朱自平, 于新月, 张强, 曹宏哲, 邢继红, 张康, 董金皋

  MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)转录因子广泛存在于植物病原真菌中,在真菌的生长发育和胁迫响应中发挥重要功能。为了解灰葡萄孢(Botrytis cinerea) MYB转录因子家族的功能,本研究利用生物信息学方法对灰葡萄孢MYB转录因子家族进行系统进化分析、保守结构域分析、分生孢子发育时期和侵染时期的表达规律分析;利用qPCR技术,检测灰葡萄孢MYB家族基因在NaCl和H2O2处理后的表达变化。结果显示,灰葡萄孢中包含22个MYB转录因子家族基因,系统进化分析将其分为6个亚家族,分别是MYB、MYB-Hox、Zn-ZZ-MYB、DEXDc-HELICc-MYB、HAS-MYB和BAH-PND-MYB-Zn-GATA;MYB家族基因在分生孢子的不同发育时期和侵染时期呈现不同的表达规律,在NaCl和H2O2处理后出现不同的表达变化趋势,提示MYB家族基因在灰葡萄孢生长发育、侵染植物以及胁迫应答过程中可能具有重要的功能。本研究为深入探讨MYB转录因子家族的基因功能和灰葡萄孢的防治提供基础资料。

• 不同土壤熏蒸剂对生菜种植土壤镰孢病菌的抑制效果及土壤微生物群落的影响

  陈利达, 石延霞, 李磊, 柴阿丽, 郭宁, 范腾飞, 谢学文, 李宝聚

  随着设施温室高附加值蔬菜作物的连年栽培,土传病害问题愈发突出,熏蒸剂也因此得以更广泛的应用。但鉴于熏蒸剂的广谱性,在杀死有害生物的同时,不可避免地对非靶标生物产生一定的影响。本研究采用qPCR技术、选择性培养基分离计数等方法针对棉隆(30 g/m2)、氰氨化钙(120 g/m2)和威百亩(30 mL/m2)在生菜(Lactuca sativa)种植土壤内对镰孢菌的抑制效果和土壤微生物群落的影响进行研究,生菜收获期测定植株农艺性状和产量,结合土壤理化性质开展熏蒸剂与土壤微生物互作相关分析。结果表明,棉隆、氰氨化钙和威百亩处理前,土壤镰孢菌属DNA含量分别为3.29×109、2.85×109和5.85×109拷贝数/g,熏蒸揭膜后0 d分别降至1.72×109、2.17×109和5.25×109拷贝数/g;3种熏蒸剂处理揭膜0 d微生物数量显著减少,氰氨化钙处理揭膜60 d放线菌数量恢复且高于初始水平(4.30×109拷贝数/g),其他处理在揭膜后逐渐增加但未恢复到对照水平;棉隆、氰氨化钙和威百亩处理后对生菜根腐病的防效分别为78.90%、62.55%和48.64%。棉隆、氰氨化钙和威百亩处理后单产重分别为0.72、0.70、0.70 kg,与对照相比,棉隆熏蒸处理后生菜增产率(60.00%)较高,且生菜促生率达16%以上,氰氨化钙和威百亩处理次之。氰氨化钙和棉隆处理前pH分别为6.89、6.88,揭膜60 d分别增至7.12、6.98,棉隆、氰氨化钙、威百亩初始土壤电导率分别为284.50、324.00和330.00 μs/cm,揭膜60 d分别降低了22.38%、13.88%和37.18%。因此,3种熏蒸剂处理可不同程度地抑制镰孢病菌,同时也可以改良生菜的农艺性状和提高产量,后期微生物数量恢复且不会对土壤微生物群落产生明显的扰动影响,对环境较安全。本研究为生菜种植土壤微生态修复和重建技术提供了技术支撑。

• 牛瘤胃微生物纤维二糖水解酶基因(cbh)在乳酸菌中的表达

  孙康永杰, 杨宇泽, 魏亚琴, 万学瑞, 张钊, 马春娟, 曹磊, 邹爱爱, 王川

  玉米(Zea mays)秸秆作为牛羊等家畜的主要饲料来源,其中含有大量的纤维素,外源纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase, CBH)可促进纤维素在青贮过程中的降解。乳酸菌(Lactococcus lactis)作为益生菌,可提高青贮饲料的品质。本研究粗提黄牛(Bos taurus domestica)瘤胃微生物混合DNA,以其为模板扩增cbh基因并克隆至食品级载体pMG36e,构建分泌型表达载体pMG36e::CBH;将其导入乳酸菌NZ9000中,利用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)法测定重组纤维二糖水解酶的酶活,并对重组酶的酶学性质进行分析。结果显示,从牛瘤胃中克隆获得约1 600 bp的重组酶序列,其编码蛋白分子量约为56 kD,滤纸酶活为(2.218 1±0.834 3) U/mL,外切葡聚糖酶的酶活为(10.499 2±1.113 5) U/mL;重组酶对再生无定型纤维素(regenerated amorphous cellulose, RAC)的特异性最高,微晶纤维素次之,对滤纸和脱脂棉的特异性较低,而对羧甲基纤维素钠(CMC-Na)几乎没有活性;重组纤维二糖水解酶的最适pH为6,最适温度为60 ℃;1 mmol/L Mn2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Co2+和1% Tween-20对重组CBH的酶活有促进作用,1 mmol/L Ba2+和Hg2+几乎对酶活无影响,1 mmol/L K+、Mg2+和EDTA对酶活有抑制作用,5 mmol/L Mn2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Co2+对酶活有促进作用,10% Tween-20和5 mmol/L Zn2+、Ba2+、Hg2+、K+、Mg2+和EDTA对酶活有抑制作用。本研究构建的牛瘤胃微生物cbh基因的重组乳酸菌,有利于促进青贮过程中秸秆纤维素酶解及提高青贮饲料的营养价值。

• 副猪嗜血杆菌ptsG基因缺失株的构建及其部分生物学特性分析

  闫雪锋, 肖五淀, 古从伟, 何曼莉, 赵明德, 何绿琴

  葡萄糖磷酸转移酶系统(glucose-specific phosphotransferase system, PTSGlc)中葡萄糖特异酶ⅡBC(glucose-specific enzyme ⅡBC, EⅡBCGlc)对细菌的代谢有着全面的影响,但EⅡBCGlc在副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis)中的作用还不清楚。本研究采用自然转化法构建副猪嗜血杆菌EⅡBCGlc蛋白的编码基因(phosphotransferase system, ptsG)缺失株及互补株,比较野毒株和缺失株在胰蛋白胨大豆肉汤+葡萄糖培养基的生长状况、细菌形态、生物被膜形成能力、对氧化压力的耐受能力及对小鼠(Mus musculus)的毒力作用。结果表明,ptsG基因敲除后,副猪嗜血杆菌可以摄取更多的还原糖供自身生长。通过透射电镜观察,发现ΔptsG与野生株相比,菌体内部有更多的高电子密度区。此外,ptsG基因的缺失导致副猪嗜血杆菌生物被膜形成能力减弱以及对过氧化氢的耐受能力减弱。而ΔptsG与野生株对小鼠的毒力作用没有明显差异。本研究表明ptsG基因对副猪嗜血杆菌生物被膜的形成和氧化应激耐受能力具有重要的作用,为研究副猪嗜血杆菌的致病机制提供了基础资料。

• 新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

  华炯钢, 叶伟成, 倪征, 陈柳, 朱寅初, 云涛, 张存

  新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus, NDRV)是近年来发现的一种新病原,可引起各品种鸭及鹅发病,给我国养鸭业造成巨大的经济损失。NDRV σC蛋白是主要的外衣壳蛋白之一,通过细胞受体介导使病毒吸附于宿主细胞,并诱导宿主机体产生型特异性抗体。为制备NDRV σC蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)并鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达和纯化的重组σC蛋白免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,以重组纯化的σC蛋白为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选出4株稳定分泌NDRV σC蛋白的McAbs杂交瘤细胞株A5-A1、A5-B6、A9-D4和B9-6。Western blot结果显示,4株McAbs均能识别NDRV全病毒和原核表达的重组σC蛋白;间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)结果显示,4株McAbs均与NDRV呈阳性反应,与经典鸭呼肠孤病毒(Classical duck reovirus, CDRV)和禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)呈阴性反应。利用人工合成相互重叠的多肽库和一系列截短多肽,对4株McAbs识别的抗原表位进行鉴定,结果表明,3株单抗A5-A1、A5-B6和B9-6识别的核心抗原表位均为177PILSGPADA185,A9-D4单抗识别的抗原表位可能呈空间构象。抗原表位的保守性分析表明,该抗原表位在不同地域和不同宿主来源的NDRV分离株中具有很高的保守性。上述结果表明,177PILSGPADA185是NDRV的型特异性B细胞线性表位。本研究为深入探讨σC蛋白结构和建立NDRV临床检测方法提供基础资料。

• 滑液支原体亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)的原核表达及亚细胞定位

  张宏燕, 岳亚辉, 邢小勇, 龙翠琴, 武小椿, 温峰琴, 包世俊

  滑液支原体(Mycoplasma synoviae, MS)是一种重要的禽类致病性支原体,感染鸡(Gallus domesticus)和火鸡(Meleagris gallopavo)后引起渗出性滑膜炎、关节炎、跗跖部肿胀和呼吸道炎,造成养鸡业的重大经济损失。亚甲基四氢叶酸脱氢酶(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, MTHFD)催化5,10-亚甲基四氢叶酸生成5,10-甲炔基四氢叶酸,该酶是叶酸代谢中的关键酶,参与嘌呤核苷酸的合成。为研究滑液支原体MTHFD蛋白的免疫原性及其在MS中的分布,本研究参照GenBank中MS WVU1853株双功能5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶/5,10-亚甲基四氢叶酸环化水解酶(bifunctional 5,10-methylenetetrahydrofolate dehydrogenase/5,10-methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase, folD)基因序列设计引物,利用PCR扩增MS folD基因并对其序列进行分析和优化。结果表明,MS folD基因全长837 bp,与GenBank中其他MS菌株folD基因的序列相似性达99.6%。folD基因克隆至pET-28a (+)质粒后转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)感受态细胞,诱导后SDS-PAGE检测表达情况。结果显示重组蛋白(recombinant protein, r) MS MTHFD成功表达,且相对分子质量约为36 kD。纯化蛋白免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备抗血清,并利用Western blot、ELISA与免疫荧光试验对rMS MTHFD的免疫原性和MTHFD在MS中的分布进行分析。结果表明,rMS MTHFD蛋白具有良好的免疫原性,MTHFD在MS的细胞膜和细胞浆中均有分布,但在胞浆中的含量较多。本研究结果为滑液支原体MTHFD生物学功能的深入研究提供了基础资料。

• 快速聚合酶链式反应装置研究进展

  李佳乐, 林晟豪, 许文涛

  聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) 因其独有的优势而被广泛应用于多种领域。传统PCR技术耗时较长,一般多于60 min,因此提出快速PCR的方法。本文聚焦快速PCR反应装置,依据热量的传递方式分别介绍和分析了接触式(连续流动、固定腔室、振荡摆动)和非接触式(红外、激光、金属纳米结构、微波、电磁感应)热循环仪。最后,对快速PCR技术中的操作一体化、金属纳米结构进一步研发以及快速热循环仪的商业化生产进行了讨论和展望。本文为今后研发低成本、小型化、自动化、高通量的热循环仪提供参考。

• bHLH转录因子在植物缺铁调控网络中的作用机制

  赵安娜, 罗光明, 罗扬婧, 宋丹丹, 夏鸿东, 任洪曼, 张攀

  铁是植物生长发育所需最重要的微量元素之一。其作为酶辅助因子或电子传递链的组成部分,在植物光合作用、呼吸作用和氨基酸生物合成等多种重要代谢过程中发挥作用。为应对铁缺乏的情况,植物进化出复杂的转录调控网络来维持铁的动态平衡,严格控制铁的吸收、运输、同化和储存。植物调控网络由多种转录因子参与构成,碱性螺旋-环螺旋(basic helix-loop helix, bHLH)家族是其中最关键的转录因子家族之一。本综述对植物响应铁缺乏的2种策略进行了简要概述,介绍了bHLH转录因子的结构、分类与作用形式,并重点讨论了类缺铁所诱导转录因子(ferritin-like iron deficiency-induced transcription factor, FIT)、PYE (POPEYE)、铁转运蛋白1上游调控因子(upsteam regulator of iron-regulated transporter 1, URI)等bHLH转录因子以及缺铁调控蛋白E3泛素连接酶BTS (BRUTUS)在铁稳态调控级联调控中作用的最新进展,以期为bHLH转录因子在植物缺铁应答调控网络中的作用机制研究提供理论基础。

• 选择信号分析在羊功能基因挖掘中的研究进展

  刘文轩, 刘倩薇, 陈冲, 王琬婷, 罗军, 李聪

  羊(包括山羊(Capra hircus)和绵羊(Ovis aries))是人类主要饲养的家畜之一。羊根据其经济用途可以分为乳用、肉用、绒用和兼用四类。探究种群间选择信号的特征可以清楚地了解种群的遗传进化和选择进展,将正向选择应用于育种可加快遗传进展、缩短育种进程,对选择信号检测到的功能基因进一步验证为致因基因,可实现分子设计育种和重要经济性状的改良。本文综述了五种常用选择信号检测方法不同之处和适用范围,总结了近年来利用选择信号分析挖掘羊重要经济性状功能基因的研究进展,为下一步解析功能基因调控羊重要经济性状形成的分子机制奠定理论基础,为实施分子设计育种实现群体遗传改良或新品种(系)培育提供基因来源与分子素材。

• 大蒜体细胞胚发生mRNA及miRNA qPCR内参基因的筛选和验证

  李梦倩, 刘敏, 张蒙, 白云赫, 李萍, 魏寒玉, 周蓉, 蒋芳玲, 吴震

  大蒜(Allium sativum)是无性繁殖的重要蔬菜作物,其体细胞胚发生分子机理的研究还比较薄弱。筛选稳定的内参基因有助于解析体细胞发生过程中基因和miRNA的差异表达。为筛选大蒜体细胞胚发生mRNA和miRNA qPCR检测体系中稳定的内参基因,本研究分别选取大蒜7个mRNA候选内参基因,包括肌动蛋白(actin, AsACTIN)、甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, AsGAPDH)、18S核糖体RNA (18S ribosomal RNA, As18S rRNA)、多聚泛素酶(polyubiquitinase, AsUBQ)、α微管蛋白(α-tubulin, AsTUA)、转录因子LATE ELONGATED HYPOCOTYL (AsLHY)和Brassinosteroid resistant 1 (AsBES1)及5个miRNA候选内参基因包括AsU6 snRNA、As5.8S rRNA、AsmiR159a-1、AsmiR168a和AsmiR168a-5p,采用qPCR技术分别检测各内参基因在不同基因型、不同外植体和不同2,4-D浓度作用下不同体细胞胚发育阶段的Ct值,利用Delta CT、BestKeeper、NormFinder和GeNorm 4种方法分析候选内参基因稳定值,并结合RefFinder综合评价候选内参基因的表达稳定性。结果表明：对于mRNA qPCR表达分析,AsACTIN是最适用于不同基因型的内参基因,AsBES1是不同外植体和不同2,4-D浓度处理下最稳定的内参基因,对所有样品进行综合评价,稳定性最好的内参基因是AsBES1。对于miRNA qPCR表达分析,不同基因型中最稳定的内参基因是AsmiR159a-1,AsmiR168a-5p是不同外植体中最稳定的内参基因,As5.8S rRNA是不同2,4-D浓度处理下最稳定的内参基因,综合评价所有样本,最理想的内参基因是AsU6 snRNA。为验证所筛选内参基因的稳定性,以7个mRNA候选内参基因和5个miRNA候选内参基因分别对大蒜体细胞胚发育过程中差异表达的植物激素相关转录因子髓细胞组织增生蛋白(myelocytomatosis protein 2, AsMYC2)和AsmiR167d-1进行qPCR分析。结果显示,以不同外植体中稳定性最好的AsBES1和AsmiR168a-5p为内参时,AsMYC2和AsmiR167d-1的表达趋势与测序数据保持一致,而以其他基因和miRNA为内参时,表达趋势有所不同,进一步证实了所筛选内参基因的可靠性。本研究可为准确检测大蒜体细胞胚发生过程中相关基因和miRNAs的表达提供支持,有助于大蒜体细胞胚发生机理的深入研究。

• 鸭丙型肝炎病毒TB Green实时荧光定量PCR方法的建立

  陈翠腾, 万春和, 陈珍, 朱春华, 刘斌琼, 蔡国漳, 黄瑜

  鸭丙型肝炎病毒(Duck hepacivirus, DuHCV)是近年来从临床表现为产蛋异常鸭(Anas)群中新发现的一种丙型肝炎病毒。为建立DuHCV的分子生物学检测方法用于该病的流行病学调查并进一步探究其致病机制,本研究根据NCBI数据库中DuHCV参考株(HCL-2株, GenBank No. MK737640.1)的NS5B基因特征,设计特异性引物,建立检测DuHCV的TB Green实时荧光定量PCR方法。结果显示,建立的检测DuHCV的TB Green实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为64拷贝/μL;特异性好,与鸭群常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线仅DuHCV出现1个特异性单峰,Tm值为(82.22±0.21) ℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.13%~0.54%和0.53%~1.12%。利用建立的TB Green实时荧光定量PCR方法和常规逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)方法同时对103份临床样品进行DuHCV感染的检测,结果显示,RT-PCR方法检出阳性样品8份,阳性率为7.8%;TB Green实时荧光定量PCR方法检出阳性样品11份,阳性率为10.68%,且8份RT-PCR阳性样品经TB Green实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究为后续开展DuHCV感染的分子流行病学调查和致病机理研究提供技术支撑。