农业生物技术学报

作者：张军梅, 郭小腊, 曹珊菱, 田峥, 周昱, 吴易璇, 张政哲, 刘光亮, 骆学农

单位：1 甘肃农业大学 动物医学院,兰州 730070; 2 中国农业科学院 兰州兽医研究所,兰州 730046

关键词：多房棘球蚴病,多房棘球蚴,Argonaute 2 (AGO2),间接ELISA,早期诊断,

基金：国家自然科学基金面上项目(32273031)

多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)是由多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)的幼虫(多房棘球蚴)寄生在人或动物肝脏中所引起的一种严重人兽共患寄生虫病。本研究旨在通过原核表达技术制备多房棘球蚴Em-AGO2 (Argonaute 2)重组蛋白,建立间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测方法,初步评价其在多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)早期诊断中的价值。本研究选取Em-AGO2基因N端1~738 bp的片段,构建pET-28a-Em-AGO2 (1~738 bp)截短重组表达载体,将其转化至大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,经诱导实现高效表达,并通过亲和纯化获得高纯度的Em-AGO2截短重组蛋白。Western blot结果显示,多房棘球蚴感染的小鼠(Mus musculus)血清能够特异性识别Em-AGO2截短重组蛋白,表明该重组蛋白抗原性良好。利用纯化的Em-AGO2截短重组蛋白为包被抗原,通过各步反应条件的优化,最终确定了检测条件：1 μg/mL Em-AGO2截短重组蛋白经0.05 mol/L (pH 9.6)碳酸盐包被缓冲液4 ℃包被过夜;用5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h;待检血清(用封闭液做1∶200倍稀释) 100 μL于37 ℃反应1 h;酶标二抗(用封闭液做1∶10000倍稀释) 100 μL于37 ℃反应1 h;加入底物后避光显色10 min;加入终止液50 μL后测定OD450值。基于Em-AGO2截短重组蛋白的间接ELISA检测体系经ROC曲线分析显示,其对多房棘球蚴感染小鼠的诊断特异性和敏感性均达100% (AUC=1.00),且与羊细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)、羊脑多头蚴(Multiceps multiceps)、羊肝片吸虫(Fasciola hepatica)、羊弓形虫(Toxoplasma gondii)、羊捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)及兔豆状囊尾蚴(Taenia pisiformis)等病原体的阳性血清均无交叉反应。用该方法对多房棘球蚴感染早期小鼠阳性血清检测结果显示,感染7 d时,虫体粗抗原、Em18重组蛋白和Em-AGO2截短重组蛋白的阳性检出率分别为18.75%、75%和71.88%;感染10 d时,阳性检出率分别为34.38%、90.63%和84.38%;感染15 d时,阳性检出率分别为81.25%、100%和100%;感染20 d时,阳性检出率分别为90.63%、100%和100%。本研究基于Em-AGO2截短重组蛋白开发了一种AE的间接ELISA检测方法,该方法在动物多房棘球蚴病早期诊断中展现出显著的潜力,具有重要的应用前景。

来源：2025年第11期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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