农业生物技术学报

作者：雷佳茹, 王淞, 狄安琪, 安常所, 孙雪松, 刘明成, 袁宏敏, 杨磊, 李光鹏

单位：内蒙古大学 省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室,呼和浩特 010070

关键词：RNA干扰(RNAi),CRISPR/Cas13a,微小RNA (miRNA),肌肉生长抑制素(MSTN),

基金：内蒙古自治区科技领军人才团队(2022LJRC0006); 内蒙古自治区揭榜挂帅项目(2022JBGS0025); 内蒙古自治区科技重大专项(2021ZD0009; 2021ZD0008; 2022ZD0008); 农业农村部农业重大科技项目(NK2022130203); 内蒙古自治区青年科技英才支持项目(NJYT23138); 中央引导地方科技发展资金(2022ZY0212)

RNA干扰(RNA interference, RNAi)主要由小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)、短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)、微小RNA (microRNA, miRNA)和CRISPR/Cas13a介导。miRNA通过与靶标mRNA碱基互补配对介导RNAi。CRISPR/Cas13a通过crRNA (CRISPR-derived RNA)和Cas13a蛋白的共同作用介导RNAi。关于CRISPR/Cas13a和miRNA介导的RNAi效率比较目前尚无报道。本研究根据肌肉生长抑制素基因(myostatin, MSTN)在西门塔尔牛(Bos taurus)和小鼠(Mus musculous)的mRNA同源序列,设计牛和小鼠通用的MSTN-crRNA-1/2/3和MSTN-miRNA-1/2/3。为了排除由Cas13a蛋白表达不稳定引起的CRISPR/Cas13a干扰效率波动,首先制备稳定表达Cas13a蛋白的牛肌肉卫星细胞(satellite cells, SCs)和小鼠成肌细胞系C2C12,将MSTN-crRNA-1/2/3和MSTN-miRNA-1/2/3分别转染牛SCs和小鼠C2C12。转染48 h后,采用qRT-PCR检测CRISPR/Cas13a和miRNA介导的MSTN干扰效率;此外,采用MTT法和细胞增殖检测试剂盒CCK-8 (Cell Counting Kit-8)检测CRISPR/Cas13a和miRNA介导的MSTN基因敲低对牛SCs和小鼠C2C12活力和增殖的影响。结果显示,MSTN-crRNA-1/2/3在牛Cas13a-SCs和小鼠Cas13a-C2C12中的平均干扰效率和最高干扰效率分别为45％和54％,MSTN-miRNA-1/2/3在牛SCs和小鼠C2C12中的平均干扰效率和最高干扰效率分别为30％和33％,说明CRISPR/Cas13a干扰效率高于miRNA;MSTN-miRNA-1/2/3使牛SCs和小鼠C2C12细胞活力和增殖能力分别下降了12% 和12.5% (P<0.05),而MSTN-crRNA-1/2/3对细胞活力和增殖能力没有影响。上述结果说明,基于CRISPR/Cas13a构建的MSTN干扰载体优于miRNA。本研究为模式动物和大家畜的基因编辑研究与应用提供基础资料。

来源：2024年第1期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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